一種重組偽狂犬病病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組偽狂犬病病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，所述重組偽狂犬病毒是以重組偽狂犬病病毒PRV/TK-/gE-/EGFP+為母本，將含豬圓環(huán)病毒2型的主要免疫原性基因ORF2的表達盒替換插入gE基因中的EGFP基因表達盒獲得的一種重組偽狂犬病病毒，命名為rPRV-ORF2。本發(fā)明的重組偽狂犬病病毒用于重組偽狂犬病病毒疫苗，具有安全性和有效性。
【專利說明】一種重組偽狂犬病病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動物病毒基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種重組偽狂犬病病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]偽狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus, PRV)屬于皰疫病毒(Herpesviridae) α抱疫病毒亞科(Alpha-herpesvirinae)水痕病毒屬(Varicello virus)的抱疫病毒I型(Porcine herpesvirus Type I),能引發(fā)豬的嚴重疾病。偽狂犬病在豬常呈爆發(fā)性流行,對妊娠母豬的危害尤其嚴重，常引起死胎、流產(chǎn)、木乃伊；后備母豬和空懷母豬感染病毒后可引起不育癥，不發(fā)情、返情和屢配不孕。公豬感染后表現(xiàn)為睪丸腫脹、萎縮，失去種用能力。新生仔豬感染PRV后大量死亡，15日齡以內(nèi)死亡率可達100%，3~4周齡仔豬的死亡率可達30%~40%。育肥豬感染偽狂犬病毒后，則表現(xiàn)為發(fā)熱，呼吸道癥狀以及生長遲緩，影響增重，降低飼料報酬。除豬以外的其它動物發(fā)生該病表現(xiàn)為發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎癥狀，均以死亡而告終，但表現(xiàn)為散發(fā)或呈地方性流行。同時，豬既是偽狂犬病病毒的貯存者，也是偽狂犬病毒的傳染源，控制豬偽狂犬病不僅對養(yǎng)豬業(yè)本身，而且對其它動物養(yǎng)殖的順利發(fā)展也有著十分重要的意義。疫苗免疫接種是預(yù)防控制與消滅偽狂犬病的根本措施。目前市售的PRV疫苗絕大多數(shù)為具有鑒別診斷能力的活疫苗，有匈牙利的天然弱毒Bartha-K/61株疫苗產(chǎn)品，及四川農(nóng)大郭萬柱教授主持研發(fā)的豬偽狂犬病活疫苗(SA215株)和華中農(nóng)業(yè)大學陳煥春教授主持研發(fā)的豬偽狂犬病活疫苗(HB98株)。該類疫苗已投放市場使用多年，對豬偽狂犬的預(yù)防與控制發(fā)揮了重要作用。SA215株與HB98株均為基因工程活疫苗毒株，即采用分子生物學方法缺失其母本病毒的主要毒力基因(如TK)與非必須糖蛋白基因(如gE、gl)，使其毒力大大降低，并具有鑒別診斷能力，為豬偽狂犬病的控制做出了巨大貢獻。
[0003]自1991年在加拿大北部豬群中出現(xiàn)由豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirusType2，PCV2)感染引起的PMWS以來，全球的絕大多數(shù)國家和地區(qū)均相繼有PCV2感染及導致的疾病的報道。PCV2感染不僅引起PMWS1DNS等PCV2相關(guān)疾病，感染豬死亡率高，而且其主要病毒特征為淋巴系統(tǒng)損傷和免疫缺陷，造成感染豬對其它病原的易感性增高，因此，PCV2感染給各國養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經(jīng)濟損失和潛在危險，成為了嚴重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病。
[0004]在我國，通過血清學和流行病學調(diào)查證實PCV2感染相當嚴重，全國各省(市)的大小豬場均存在PCV2感染。2002年由PCV2感染引起的PMWS在全國各地呈暴發(fā)流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失，己成為我國規(guī)?；i場危害養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要免疫抑制性疫病之一。據(jù)2011年各科研院所的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，我國豬場的PCV2陽性率已達100%，具有流行范圍廣、各生長階段豬感染嚴重、混合感染突出等特點，嚴重威脅我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。PCV2對養(yǎng)豬業(yè)的另一影響為其感染可導致其它疫苗免疫時的免疫效力顯著降低。
[0005] 由于PCV2感染細胞后不表現(xiàn)細胞病變、病毒增殖滴度低，為疫苗的研制造成了極大的困難。直至2007年，全球第一個PCV2疫苗即梅里亞Circovace在歐盟被批準上市，隨后先后有英特威Circumvent?、富道Suvaxyn PCV2*及勃林格CircoFLEX?上市，但僅勃林格CircoFLEX?在我國成功獲批上市。2010年后，我國先后有5個PCV2全病毒滅活疫苗批準上市。該類疫苗由于生產(chǎn)成本高,價格昂貴,仔豬用疫苗每頭份10~14元，按免疫兩次計算，每頭仔豬的費用至少30元，母豬用疫苗每頭份至少30元，一般至少免疫3次，每頭豬的費用為90元以上，由此可見，該類疫苗的使用大大提高了養(yǎng)豬的成本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種重組偽狂犬病病毒，應(yīng)用于活疫苗中具有高安全性和有效性。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供一種重組偽狂犬病病毒的構(gòu)建方法，通過分子生物學手段獲得一種重組偽狂犬病病毒。
[0008]本發(fā)明的另一方法在于提供重組偽狂犬病病毒在制備豬偽狂犬病與豬圓環(huán)病毒2型疫苗中的應(yīng)用。
[0009]為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
[0010]一種重組偽狂犬病病毒，其是以重組偽狂犬病病毒PRV/TK_/gE7EGFP+為母本，將含豬圓環(huán)病毒2型的主要免疫原性基因0RF2的表達盒替換插入gE基因中的EGFP基因表達盒獲得的重組偽狂犬病病毒rPRV_0RF2,拉丁文名為Recombinant Herpesvirus SuisrPRV-0RF2 ;該病毒保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國，武漢，武漢大學，郵編430072)，保藏號為:CCTCC-V201408，保藏日期為:2014年03月10日。
[0011]上述方案中所采用的重組偽狂犬病病毒母本為本研究室在申請?zhí)枮镃N201210128876.5中所披露的重組偽狂犬病病毒PRV/TK7gE_/EGFP+，拉丁文名為Recombinant pseudorabies PRV/TKVgEVEGFP+,該病毒保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國，武漢，武漢大學，郵編430072)，保藏號為:CCTCC-V201410，保藏日期為:2014年03月24日。
[0012]一種重組偽狂犬病病毒的構(gòu)建方法，其步驟如下:
[0013]l)pgE-0RF2的構(gòu)建:設(shè)計0RF2擴增引物，以PCV2陽性病料中提取的PCV2DNA為模板，經(jīng)PCR擴增獲得0RF2全基因，經(jīng)KpnI與XhoI消化后，克隆至pUC19_gE/EGFP替換EGFP 獲得 pgE-0RF2 ；
[0014]2)轉(zhuǎn)染:在細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)BHK-21細胞，待BHK-21細胞80 %融合時以PRV/TKVgEVEGFP+感染BHK-21細胞后，再以pgE_0RF2轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染后，繼續(xù)培養(yǎng)60h~72h，凍融收獲病毒；
[0015]3)純化與鑒定:將轉(zhuǎn)染后收獲的病毒接種于細胞培養(yǎng)板中80%融合細胞后培養(yǎng)至明顯病變出現(xiàn)，挑選無熒光噬斑，并純化至100%無熒光，獲得重組偽狂犬病病毒，命名為rPRV-0RF2o
[0016]所述的重組偽狂犬病病毒在制備豬偽狂犬病與豬圓環(huán)病毒2型疫苗中的應(yīng)用。
[0017]一種重組偽狂犬病病毒疫苗包括上述rPRV_0RF2病毒液和保護劑或佐劑。
[0018]本發(fā)明所述的偽狂犬病病毒疫苗中，rPRV-0RF2的TCID5tl為105_7/0.1ml0
[0019]本發(fā)明所述的偽狂犬病病毒疫苗中，所述保護劑為rPRV_0RF2病毒液和保護劑的體積比為1:1。
[0020]本發(fā)明所述的偽狂犬病病毒疫苗中，所述保護劑可以采用藥學上可以接受的疫苗保護劑或佐劑，作為優(yōu)選的，所述保護劑為由去離子水、蔗糖、明膠組成，其中每10ml保護劑中蔗糖30-50g，明膠5-10g。
[0021]相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于:
[0022]1、本發(fā)明所用的載體材料為重組偽狂犬病病毒PRV/TK_/gE7EGFP+基因工程弱毒株，該病毒的增殖滴度高，且重組偽狂犬病病毒株P(guān)RV/TK_和PRV/TK_/gE_不但對斷奶仔豬十分安全有效，即使對懷孕母豬及初生仔豬也十分安全，可產(chǎn)生堅強的保護力，這就為將其開發(fā)成一種良好的病毒活疫苗載體提供了廣闊的前景；
[0023]2、本發(fā)明利用DNA重組同源重組技術(shù)成功地將PCV2的主要免疫原性基因0RF2替換了 EGFP基因，克服了 PCV2增殖滴度低的缺點，并采用強啟動子(人巨細胞病毒CMV啟動子)進一步提高了 0RF2的表達效率，使其高水平表達；
[0024]3、本發(fā)明深入評價了 rPRV_0RF2制備防制豬偽狂犬病與豬圓環(huán)病毒2型相關(guān)疾病疫苗上的應(yīng)用，將該毒株制成豬偽狂犬病-豬圓環(huán)病毒2型基因工程活疫苗進行了小鼠安全性與免疫效力試驗，表明其是一株安全、有效的疫苗毒株。
[0025]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖lrPRV_0RF2的構(gòu)建技術(shù)路線示意圖；
[0027]圖2pgE_0RF2轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建示意圖；
[0028]圖 3、pgE-0RF2 的酶切鑒定，其中 M:DNA Ladder, Lanel ~3:HindIII+ClaI 酶切鑒定 pgE-0RF2 ；
[0029]圖4、純化前rPRV_0RF2感染ST細胞熒光觀察，其中A:可見光觀察；B:熒光觀察；箭頭所示為無熒光的rPRV-0RF2感染ST細胞；
[0030]圖5、純化后rPRV_0RF2感染ST細胞熒光觀察，其中A:可見光觀察；B:熒光觀察；
[0031]圖6、PCR 鑒定 rPRV-0RF2，其中 M:DNA Ladder, Lanel ~6 分別為噬斑毒 A4、A7、A8、A19、A23、A24 中 0RF2 基因 PCR 擴增；
[0032]圖 7、RT-PCR 鑒定 rPRV_0RF2 中 0RF2 的表達，其中 M:DNA Ladder, Lanel ~6 分別為噬斑毒 A4、A7、A8、A19、A23、A24 的 RT-PCR 擴增。
[0033]圖8、Western blot 鑒定 rPRV-ORF2 中 ORF2 的表達；
[0034]圖9、PCR 鑒定 rPRV-0RF2 中 TK 基因缺失，其中 M:DNA Ladder, Lane I ~6 分別為 rPRV-0RF2 的噬斑毒 A4、A7、A8、A19、A23、A24 的 TK 基因 PCR 擴增；
[0035]圖10、PCR 鑒定 rPRV-0RF2 中 gE 基因缺失，其中 M:DNA Ladder, Lanel ~6 分別為噬斑毒A4、A7、A8、A19、A23、A24中g(shù)E基因缺失檢測；
[0036]圖11、rPRV-0RF2免疫Balb/C小鼠后PCV2抗體水平比較；
[0037]圖 12、rPRV-0RF2免疫Balb/C小鼠后PRV抗體水平比較。

【具體實施方式】
[0038]除另有說明外，本申請中所有的科技術(shù)語都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。下列實施例旨在進一步舉例說明實現(xiàn)本發(fā)明的具體方式，而不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。
[0039]在本申請中，如無特別說明，本發(fā)明的實施都使用分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在下了文件中有詳細描述:Sambrook 等人編著的 Molecular Cloning:Alaboratory Mannual,第二版(1989) ；Nucleic Acid Hybridizat1n (B.D.Hames 和 S.J.Higgin 編著，1984)；Immnochemical Methods in Cell And Molecular B1logy(Academic Press, London)。
[0040]本發(fā)明所用的材料來源如下:
[0041]病毒和細胞:重組偽狂犬病病毒PRV/TK_/gE7EGFP+為本研究室自主構(gòu)建(專利申請?zhí)?CN201210128876.5中公開，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為:CCTCC-V201410)，BHK-21細胞、ST細胞由肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司農(nóng)業(yè)部動物疫病防控生物技術(shù)與制品創(chuàng)制重點實驗室保存。
[0042]質(zhì)粒和菌株:pUC19_gE/EGFP為本研究室自主構(gòu)建(專利申請?zhí)?CN2 01210128876.5) ；DH5 α菌株由肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司農(nóng)業(yè)部動物疫病防控生物技術(shù)與制品創(chuàng)制重點實驗室保存。
[0043]工具酶和其它試劑:EXTaq Premix 試劑盒、TaKaRa LA Taq? with GC Buffer試劑盒、病毒 DNA 提取試劑盒、KpnI> XhoI> Hindlll、Clal、Agarose GEL DNAPurificat1nKit、DNA Ligat1n Kit 購自 TaKaRa 公司，One-step RT-PCR Kit 購自 Τ0Υ0Β0 公司。Lipofectamine?2000購自Invitrogen公司。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。
[0044]引物:參考PCV2全基因組序列(EU921254)，設(shè)計合成引物，用于檢測PCV2及擴增0RF2全基因。引物序列及預(yù)期PCR產(chǎn)物的大小見表1 ;FTK/RTK、FgE/RgE分別為PRV TK與gE基因缺失檢測引物，均與已申請專利:CN201210128876.5中公開的相同。
[0045]表1檢測PCV2及擴增0RF2全基因的PCR引物
[0046]

【權(quán)利要求】
1.一種重組偽狂犬病病毒，其特征在于:其是以重組偽狂犬病病毒PRV/TK7gE-/EGFP+為母本，將含豬圓環(huán)病毒2型的主要免疫原性基因0RF2的表達盒替換插入gE基因中的EGFP基因表達盒獲得的重組偽狂犬病病毒，即rPRV-0RF2 ;該病毒保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為:CCTCC-V201408。
2.一種如權(quán)利要求1所述的重組偽狂犬病病毒的構(gòu)建方法，其特征在于:其步驟如下: 1)pgE-0RF2的構(gòu)建:設(shè)計0RF2擴增引物，以PCV2陽性病料中提取的PCV2DNA為模板，經(jīng)PCR擴增獲得0RF2全基因，經(jīng)KpnI與XhoI消化后，克隆至pUC19_gE/EGFP替換EGFP獲得 pgE-0RF2 ； 2)轉(zhuǎn)染:在細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)BHK-21細胞，待BHK-21細胞80%融合時以PRV/TK7gE-/EGFP+感染BHK-21細胞后，再以pgE_0RF2轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染后，繼續(xù)培養(yǎng)60h~72h，凍融收獲病毒； 3)純化與鑒定:將轉(zhuǎn)染后收獲的病毒接種于細胞培養(yǎng)板中80%融合細胞后培養(yǎng)至明顯病變出現(xiàn)，挑選無熒光噬斑，并純化至100%無熒光，獲得一種重組偽狂犬病病毒，命名為rPRV-0RF2o
3.如權(quán)利要求1所述的重組偽狂犬病病毒在制備豬偽狂犬病與豬圓環(huán)病毒2型疫苗中的應(yīng)用。
4.一種重組偽狂犬病病毒疫苗，其特征在于:其包括如權(quán)利要求1所述rPRV-0RF2病毒液和保護劑/佐劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組偽狂犬病病毒疫苗，其特征在于:所述的rPRV-0RF2的TCID50 為 105-7/0.Imlo
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組偽狂犬病病毒疫苗，其特征在于:所述保護劑為rPRV-0RF2病毒液和保護劑的體積比為1:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組偽狂犬病病毒疫苗，其特征在于:所述保護劑為由去離子水、蔗糖、明膠組成，其中每10ml保護劑中蔗糖30-50g，明膠5_10g。
【文檔編號】C12N7/01GK104130982SQ201410183100
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】黃紅亮, 陳瑞愛, 謝小雨, 任常寶, 何玲 申請人:肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司, 廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司