專利名稱：一種檢測(cè)狂犬病毒屬病毒的codehop rt-pcr試劑及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及狂犬病毒的檢測(cè)技術(shù)，具體涉及ー種檢測(cè)狂犬病毒屬病毒的C0DEH0PRT-PCR試劑及方法。
背景技術(shù)：
狂犬病毒屬分為7個(gè)基因型狂犬病病毒(classical rabies virus),拉各斯蝙幅病毒(Lagos bat virus),莫科拉病毒(Mokola virus),杜文海格病毒(Duvenhagevirus),歐洲蝙蝠狂犬病毒I型(European bat lyssavirus types I),歐洲蝙蝠狂犬病毒 2 型(European bat lyssavirus types 2 ),澳大利亞蝙幅狂犬病毒(Australian batlyssavirus).國(guó)內(nèi)流行的野毒株為基因I型，近十年來(lái)中國(guó)狂犬病的發(fā)病率及死亡率一直 維持在毎年超過(guò)2000人的高位。基因2型飛型僅在非洲和歐洲發(fā)現(xiàn)，5型和6型在歐洲蝙蝠中比較普遍，雖感染人的病例不多，但幾乎每型病毒都曾致死人?？紤]到歐亞大陸的連續(xù)性和國(guó)際貿(mào)易的頻繁往來(lái)，無(wú)法排除其余基因型狂犬病毒的傳入。目前，狂犬病毒的檢測(cè)方法主要有病毒分離、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攻毒、血清學(xué)檢測(cè)方法和基因檢測(cè)方法?；驒z測(cè)方法主要是反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，如授權(quán)公告號(hào)為CN 101153344，名稱為狂犬病毒套式RT-PCR檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒的發(fā)明專利，就公開了以外套PCR預(yù)混體系和內(nèi)套PCR預(yù)混體系的RT-PCR技術(shù)，可以完成全部7個(gè)基因型的檢測(cè)，外套引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小是845bp，內(nèi)套引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小是371bp，內(nèi)套引物是以不同基因型RV特點(diǎn)設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物。該發(fā)明專利雖然可檢測(cè)所有狂犬病毒屬的基因型，但需要外套PCR預(yù)混體系和內(nèi)套PCR預(yù)混體系ニ種檢測(cè)試劑共同檢測(cè)，檢測(cè)方法復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間也較長(zhǎng)，且不能有效確認(rèn)具體基因型，更無(wú)法鑒定狂犬病毒屬內(nèi)的未知病毒或可能出現(xiàn)其他基因型的病毒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)狂犬病毒屬病毒的C0DEH0P RT-PCR試劑及方法，該C0DEH0P RT-PCR試劑只用一組引物下，特異性更；用該C0DEH0P RT-PCR試劑檢測(cè)狂犬病毒屬時(shí)間較短，方法簡(jiǎn)便，靈敏性高，且可以確認(rèn)具體基因型，以及鑒定狂犬病毒屬內(nèi)的未知病毒或可能出現(xiàn)其他基因型的病毒。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為一種檢測(cè)狂犬病毒屬的C0DEH0P RT-PCR試劑，包括引物溶液，所述引物溶液中含有核苷酸序列為5’ -TTTGTTTTCTGACAAGAATG ACAAATatha ayathaa -3’ 的上游引物 KQZ1，和核苷酸序列為 5’ -TTTTGCTGCATGTCTAACTT Cttgrtcnac cca -3’的下游引物KQZ2，上述序列中其中h含義為a或c或t/u, y含義為c或tAi，r含義為g或a, η含義為g或a或c或tAl或其它。檢測(cè)狂犬病毒屬病毒的方法，其步驟如下
a、RNA提取用RNA提取試劑盒(購(gòu)自Qiagen公司)提取病毒的RNA，得到RNA，具體提取方法依說(shuō)明書進(jìn)行；
b、RNA逆轉(zhuǎn)錄用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)于Promega公司)對(duì)上述RNA進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，得到PCR模板,具體逆轉(zhuǎn)錄方法依說(shuō)明書進(jìn)行在0.2mL eppendorf管中加入oligo d (T)15primers (50mM) I μ L，上述RNA 10μ L,72°C 10. min，再加入反應(yīng)試劑，20 μ L反應(yīng)體系中AMV反轉(zhuǎn)錄酶終濃度為O. 5U/ μ L，RNA酶抑制劑終濃度為O. 5U/ μ L，dNTP終濃度為O. 5mM,4μ L RT-buffer 5 X，反應(yīng)條件為42°C 60min，72°C IOmin ;反應(yīng)產(chǎn)物即為后續(xù)的PCR模板；
c、PCR反應(yīng)在 O. 2mL 印pendorf 管中加入 10 XPCR 緩沖液(PCR buffer)2· 5 μ L、濃度為25mM的MgCl2溶液I. 5 μ L、濃度為IOmM的dNTP液0. 5 μ L、濃度為5U/ μ L的Taq酶液
0.5 μ L、含濃度都為25 μ M的上游引物KQZl和下游引物KQZ2的引物溶液I μ L、上述PCR模板2yL，滅菌去離子水16yL，組成PCR反應(yīng)體系；反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，52°C退火 30s，72°C 延伸 lmin，35 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 7min，4°C保存 PCR 產(chǎn)物；
d、瓊脂糖凝膠電泳將上述PCR產(chǎn)物用重量百分濃度為1-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目標(biāo)條帶，電泳條件電壓IOOv, 30min,將電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)分析,若結(jié)果出現(xiàn)548bp大小片段的條帶，則為狂犬病毒屬病毒，對(duì)548bp大小片段的條帶測(cè)序，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :3所示則為阿拉萬(wàn)病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :4所示則為澳大利亞蝙蝠狂犬病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQID NO :5所示則為杜文海格病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :6所示則為歐洲蝙蝠狂犬病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :7所示則為伊爾庫(kù)特病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :8所示則為苦盞病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:9所示則為拉各斯蝙蝠病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 10所示則為奧澤爾狂犬病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :11所示則為莫科拉病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO12所示則為經(jīng)典狂犬病病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:13所示則為希莫尼蝙蝠病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO : 14所示則為高加索蝙幅病毒。以上PCR buffer、MgCl2、dNTP液、Taq酶液等反應(yīng)試劑均購(gòu)自大連寶生生物，引物由上海生工合成。根據(jù)Genbank上已有已分類具有L片段全片段基因7個(gè)基因型病毒株，選取12株代表性病毒株計(jì)引物對(duì)。從genbank中下載狂犬病毒屬各種病毒的L基因組片段的蛋白質(zhì)序列。將蛋白序列以FASTA格式保存，將下載的FASTA格式的氨基酸序列信息輸入進(jìn)行Block比對(duì)，得到高度保守的連續(xù)氨基酸區(qū)域。使用CodeHop引物捜索，篩選合適上下游引物。要求簡(jiǎn)并度低，上下游引物位置間距在500bp左右。利用primer和oligo軟件進(jìn)行引物分析，得到C0DEH0P引物I對(duì)KQZl和KQZ2。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于ー種檢測(cè)狂犬病毒屬病毒的C0DEH0P RT-PCR試劑及方法，引物溶液中含有核苷酸序列為TTTGTTTTCT GACAAGAATG ACAAATatha ayathaa的上游引物KQZ1，和核苷酸序列為TTTTGCTGCA TGTCTAACTT Cttgrtcnac cca的下游引物KQZ2，其中5'端非兼并共有序列夾和很短的3 '端根據(jù)保守氨基酸設(shè)計(jì)的核心簡(jiǎn)并區(qū)組成，5'端非兼并共有序列在不增加引物簡(jiǎn)并度的情況下其穩(wěn)定3 '兼并核心區(qū)與模板結(jié)合作用，允許在較高退火溫度下進(jìn)行，提高了兼并PCR反應(yīng)的特異性，通過(guò)RNA提取、RNA逆轉(zhuǎn)錄、PCR反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增產(chǎn)物序列長(zhǎng)度為548bp ;對(duì)特異性擴(kuò)增序列進(jìn)行測(cè)序，可以確認(rèn)阿拉萬(wàn)病毒、澳大利亞蝙蝠病毒、杜文海格病毒、歐洲蝙蝠狂犬病毒、伊爾庫(kù)特病毒、苦盞病毒、拉各斯蝙 蝠病毒、奧澤爾狂犬病毒、莫科拉病毒、經(jīng)典狂犬病病毒、希莫尼蝙蝠病毒和西高加索蝙蝠病毒等，同時(shí)能對(duì)狂犬病毒屬內(nèi)基因同源的未知病毒進(jìn)行檢測(cè)，所獲得的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)可以用于狂犬病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查研究。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)描述。實(shí)施例I :RT_PCR方法檢測(cè)狂犬病毒細(xì)胞培養(yǎng)物
1、RNA提取用RNA提取試劑盒(購(gòu)自Qiagen公司)提取狂犬病毒疫苗株Vero細(xì)胞(寧波榮安生物藥業(yè)有限公司饋贈(zèng))的RNA，得到RNA，具體提取方法依說(shuō)明書進(jìn)行，同時(shí)用正常VeiO細(xì)胞提取RNA作為陰性對(duì)照。用微量分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度和純度，0D260/280 ^ 1.9,表明RNA純度較高，無(wú)DNA和蛋白質(zhì)污染；
2、RNA逆轉(zhuǎn)錄用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)上述RNA進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，得到PCR模板在O. 2mL eppendorf 管中加入 oligo d (T) 15 primers IyL (50 μ M) , RNA 10 μ L, 72°C 10.min，加入 4yL RT buffer 5X、lyL dNTP (10mM)、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 I μ L (IOU/μ L)、RNaseInhibitor 0· 5 μ L、Rnase-free Water I. 5μ L,42°C lh,72°C IOmin0 反應(yīng)產(chǎn)物作為后續(xù)的PCR模板；
3、PCR反應(yīng)在 0. 2mL 印 pendorf 管中加入 10 XPCR buffer2. 5 μ L, MgCl2L 5μ L(25mM)、dNTP (IOmM) 0· 5 μ L、Taq (5U/μ L) O. 5 μ L、引物溶液(上、下游引物都為 25 μ M)14し？0 模板2レし,DDff 16 μし94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸Imin，35個(gè)循環(huán)，72 °C延伸7min，4°C保存PCR產(chǎn)物；
4、瓊脂糖凝膠電泳將RT-PCR產(chǎn)物用1-1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目標(biāo)條帯，電泳條件電壓100v，30min，將電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)分析。結(jié)果狂犬病毒疫苗株Vero細(xì)胞培養(yǎng)物出現(xiàn)548bp大小片段，而正常Vero細(xì)胞培養(yǎng)物無(wú)特異性目的條帶，測(cè)序其序列如序列表SEQ ID NO : 12所示，為經(jīng)典狂犬病病毒。RT-PCR方法靈敏性按照上述步驟1-4的方法進(jìn)行檢測(cè)，用分光光度計(jì)檢測(cè)提取狂
犬病毒疫苗株感染的VeiO細(xì)胞，步驟I提取的RNA濃度為SOng/yL，將RNA用Rnase-free Water 10倍梯度稀釋。結(jié)果顯示本檢測(cè)方法可以檢測(cè)出的最高稀釋度為1θΛ相當(dāng)于濃度50pg核酸的病毒RNA都可以檢測(cè)。RT-PCR方法特異性按照上述步驟1-4的方法，用狂犬病毒疫苗株RNA、漢坦病毒 RNA、甲型HlNl流感病毒RNA、柯薩奇病毒RNA、流行性こ型腦炎R(shí)NA，正常Vero細(xì)胞
RNA，作為檢測(cè)對(duì)象，用KQZl/ KQZ2引物對(duì)擴(kuò)增，結(jié)果只有狂犬病毒疫苗株核酸擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)一條548bp特異性條帶外，漢坦病毒、甲型HlNl流感病毒、柯薩奇病毒、流行性こ型腦炎病毒及正常Vero細(xì)胞RNA擴(kuò)增產(chǎn)物均未見特異性核酸條帶。實(shí)施例2、利用PCR方法檢測(cè)杜文海格病毒陽(yáng)性質(zhì)粒將人工合成的杜文海格病毒核酸(SEQ ID勵(lì):5)片段(寶生物合成)，連接至？1 18づ載體，轉(zhuǎn)化至DH5a大腸桿菌，挑取克隆酶切鑒定，選取陽(yáng)性克隆和陰性克隆增菌培養(yǎng)，使用質(zhì)粒提取試劑盒(購(gòu)自上海生エ)提取質(zhì)粒作為陽(yáng)性模板和陰性對(duì)照模板；再按實(shí)施例I步驟3的方法進(jìn)行PCR反應(yīng)，步驟4的方法進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果也得到548bp特異性條帶，陰性對(duì)照無(wú)目的條帶。實(shí)施例3、利用PCR方法檢測(cè)拉各斯蝙蝠病毒陽(yáng)性質(zhì)粒其方法與實(shí)施例2基本相同，所不同的只是為人工合成的拉各斯蝙蝠病毒核酸(SEQ ID N0:9)片段(寶生物合成)，結(jié)果也得到548bp特異性條帶，陰性對(duì)照無(wú)目的條帶。實(shí)施例4、利用PCR方法檢測(cè)莫科拉病毒陽(yáng)性質(zhì)粒其方法與實(shí)施例2基本相同，所不同的只是為人工合成的莫科拉病毒核酸(SEQ ID NO: 11)片段(寶生物合成)，結(jié)果也得到548bp特異性條帶，陰性對(duì)照無(wú)目的條帶。實(shí)施例5、利用PCR方法檢測(cè)澳大利亞蝙蝠狂犬病毒陽(yáng)性質(zhì)粒其方法與實(shí)施例2基本相同，所不同的只是為人工合成的澳大利亞蝙蝠狂犬病毒核酸(SEQ ID N0:4)片段(寶生物合成)，結(jié)果也得到548bp特異性條帶，陰性對(duì)照無(wú)目的條帶。實(shí)施例6、利用PCR方法檢測(cè)阿拉萬(wàn)病毒陽(yáng)性質(zhì)粒其方法與實(shí)施例2基本相同，所不同的只是為人工合成的阿拉萬(wàn)病毒核酸(SEQ ID N0:3)片段(寶生物合成)，結(jié)果也得 到548bp特異性條帶，陰性對(duì)照無(wú)目的條帶。實(shí)施例7、利用PCR方法檢測(cè)歐洲蝙蝠狂犬病毒陽(yáng)性質(zhì)粒其方法與實(shí)施例2基本相同，所不同的只是為人工合成的歐洲蝙蝠狂犬病毒核酸(SEQ ID N0:6)片段(寶生物合成)，結(jié)果也得到548bp特異性條帶，陰性對(duì)照無(wú)目的條帶。實(shí)施例8、利用PCR方法檢測(cè)伊爾庫(kù)特病毒陽(yáng)性質(zhì)粒其方法與實(shí)施例2基本相同，所不同的只是為人工合成的伊爾庫(kù)特病毒核酸(SEQ ID N0:7)片段(寶生物合成)，結(jié)果也得到548bp特異性條帶，陰性對(duì)照無(wú)目的條帶。實(shí)施例9、利用PCR方法檢測(cè)苦盞病毒陽(yáng)性質(zhì)粒其方法與實(shí)施例2基本相同，所不同的只是為人工合成的苦盞病毒核酸(SEQ ID N0:8)片段(寶生物合成)，結(jié)果也得到548bp特異性條帶，陰性對(duì)照無(wú)目的條帶。實(shí)施例10、利用PCR方法檢測(cè)奧澤爾狂犬病毒陽(yáng)性質(zhì)粒其方法與實(shí)施例2基本相同，所不同的只是為人工合成的奧澤爾狂犬病毒核酸(SEQ ID N0:10)片段(寶生物合成)，結(jié)果也得到548bp特異性條帶，陰性對(duì)照無(wú)目的條帶。實(shí)施例11、利用PCR方法檢測(cè)希莫尼蝙蝠病毒陽(yáng)性質(zhì)粒其方法與實(shí)施例2基本相同，所不同的只是為人工合成的希莫尼蝙蝠病毒核酸(SEQ ID N0:13)片段(寶生物合成)，結(jié)果也得到548bp特異性條帶，陰性對(duì)照無(wú)目的條帶。實(shí)施例12、利用PCR方法檢測(cè)高加索蝙蝠病毒陽(yáng)性質(zhì)粒其方法與實(shí)施例2基本相同，所不同的只是為人工合成的高加索蝙蝠病毒核酸(SEQ ID N0:14)片段(寶生物合成)，結(jié)果也得到548bp特異性條帶，陰性對(duì)照無(wú)目的條帶。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)狂犬病毒屬病毒的CODEHOP RT-PCR試劑，包括引物溶液，其特征在于所述引物溶液中含有核苷酸序列為TTTGTTTTCT GACAAGAATG ACAAATatha ayathaa的上游引物KQZ1，和核苷酸序列為TTTTGCTGCA TGTCTAACTT Cttgrtcnac cca的下游引物KQZ2，上述序列中其中h含義為a或c或tAi，y含義為c或tAi，r含義為g或a,η含義為g或a或c或t/u或其它。
2.利用權(quán)利要求I所述的ー種檢測(cè)狂犬病毒屬病毒的C0DEH0PRT-PCR試劑檢測(cè)狂犬病毒屬病毒的方法，其特征在于步驟如下 a、RNA提取用RNA提取試劑盒提取病毒的RNA，得到RNA，具體提取方法依說(shuō)明書進(jìn)行； b、RNA逆轉(zhuǎn)錄用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)上述RNA進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，得到PCR模板，具體 逆轉(zhuǎn)錄方法依說(shuō)明書進(jìn)行； c、PCR反應(yīng)在O.2mL eppendorf管中加入10XPCR緩沖液2. 5 μ L、濃度為25mM的MgCl2溶液I. 5 μ L、濃度為IOmM的dNTP液O. 5 μ L、濃度為5U/ μ L的Taq酶液O. 5 μ L、含濃度都為25 μ M的上游引物KQZl和下游引物KQZ2的引物溶液I μ L、上述PCR模板2 μ L，滅菌去離子水16 μ L，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸Imin，35個(gè)循環(huán)，72 °C延伸7min，4°C保存PCR產(chǎn)物； d、瓊脂糖凝膠電泳將上述PCR產(chǎn)物用重量百分濃度為1-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目標(biāo)條帶，電泳條件電壓IOOv, 30min,將電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)分析,若結(jié)果出現(xiàn)548bp大小片段的條帶，則為狂犬病毒屬病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO3所示則為阿拉萬(wàn)病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :4所示則為澳大利亞蝙蝠狂犬病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :5所示則為杜文海格病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :6所示則為歐洲蝙蝠狂犬病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :7所示則為伊爾庫(kù)特病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :8所示則為苦盞病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :9所示則為拉各斯蝙蝠病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO10所示則為奧澤爾狂犬病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :11所示則為莫科拉病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO : 12所示則為經(jīng)典狂犬病病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :13所示則為希莫尼蝙蝠病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :14所示則為西高加索蝙蝠病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)狂犬病毒屬病毒的CODEHOPRT-PCR試劑及方法，引物溶液中含有核苷酸序列為TTTGTTTTCTGACAAGAATGACAAATathaayathaa的上游引物KQZ1，和核苷酸序列為TTTTGCTGCATGTCTAACTTCttgrtcnaccca的下游引物KQZ2，其中5＇端非兼并共有序列夾和很短的3＇端根據(jù)保守氨基酸設(shè)計(jì)的核心簡(jiǎn)并區(qū)組成，5＇端非兼并共有序列在不增加引物簡(jiǎn)并度的情況下其穩(wěn)定3＇兼并核心區(qū)與模板結(jié)合作用，允許在較高退火溫度下進(jìn)行，提高了兼并PCR反應(yīng)的特異性，通過(guò)RNA提取、RNA逆轉(zhuǎn)錄、PCR反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增產(chǎn)物序列長(zhǎng)度為548bp；對(duì)特異性擴(kuò)增序列進(jìn)行測(cè)序，可以確認(rèn)已知病毒，同時(shí)能對(duì)狂犬病毒屬內(nèi)基因同源的未知病毒進(jìn)行檢測(cè)，所獲得的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)可以用于狂犬病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查研究。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102643929SQ201210097098
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月5日
發(fā)明者倪紅霞, 胡群, 謝東華, 郭利平, 馬思杰 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)大榭出入境檢驗(yàn)檢疫局