專利名稱：一種采用多手段提取桑樹根圍土壤微生物總dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生態(tài)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種桑園土壌微生物總DNA的提取方法。
背景技術(shù)：
長期以來，有關(guān)土壤微生物的多祥性研究是通過分離培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)的。然而，絕大多數(shù)微生物種群尚不能實(shí)現(xiàn)純培養(yǎng)，這成為土壤微生物多祥性研究的一個(gè)限制性因素。隨著土壌微生物群落結(jié)構(gòu)研究的不斷深入，借助現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的研究方法如PCR-RFLP、PCR-SSCP、PCR-DGGE等避免了傳統(tǒng)研究方法不能全面獲取土壤微生物多樣性信息的缺陷，可以通過土壤微生物DNA表現(xiàn)出的多樣性，真實(shí)地反映上壤微生物種群結(jié)構(gòu)情況，而土壤微生物群落基因組總DNA的高效、高品質(zhì)提取，是從分子生物學(xué)水平對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究的前提條件。由于土壤理化成分復(fù)雜，常含有腐殖酸、酚類化合物、重金屬離子等影響DNA分子操作的物質(zhì)，土壤樣品處理和實(shí)驗(yàn)條件較復(fù)雜，耗時(shí)長，以致從土壤環(huán)境中獲得高純度微生物基因組DNA具有一定難度，DNA提取技術(shù)創(chuàng)新因此備受關(guān)注。目前已經(jīng)報(bào)道了多種土壤微生物總DNA提取方法。從土壤提取微生物總DNA的方法大致分為兩類直接提取法和間接提取法。間接法提取的DNA純度高，但其缺點(diǎn)是得到的細(xì)菌只占總菌群的25 % 50 %，而直接法提取的DNA超過細(xì)菌總DNA的60 %。直接法由于能夠提取到較全的細(xì)菌DNA、省力、DNA產(chǎn)量高，因而發(fā)展很快。Tsai等使用SDS和溶菌酶裂解細(xì)胞提取總DNA，Tiedje等使用PVP (聚こ烯吡咯烷酮)和CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)去除腐殖酸，效果很好，Bourrain等人采用該方法從活性污泥中提取了 DNA，Reddy等人從堆肥中提取了 DNA。桑園土壤微生物的多祥性及生命活動(dòng)與桑園上壤結(jié)構(gòu)的形成和改良、土壌肥力演變、桑樹根部病害的發(fā)生、桑樹營養(yǎng)物質(zhì)供給和植株生長發(fā)育等密切相關(guān)，但目前尚未見應(yīng)用免培養(yǎng)法研究桑園土壤微生物多祥性的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于建立桑樹根圍土壌微生物群落結(jié)構(gòu)的分子生態(tài)學(xué)試驗(yàn)技術(shù)體系，借鑒已有的土壌微生物總DNA的提取方法，提供一種高效的可直接用于PCR分析的桑園土壤微生物總DNA提取方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了如下的技術(shù)方案一 .材料選擇供試土壤于2011年3月7日采自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所生產(chǎn)桑園(東經(jīng)114° 19'，北緯30° 29'，海拔29m)的桑樹根圍，桑樹品種為湖桑32號(hào)。采集土壤為 黃粘土，采樣深度為5 IOcm表土層，按5點(diǎn)法取樣，混勻后放入無菌袋中，4°C保存，24h內(nèi)完成土壌微生物基因組總DNA的提取。ニ.試劑選擇
本發(fā)明采用的主要試劑中十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、聚こ烯吡咯烷酮K30(PVP K30)、聚こニ醇8000 (PEG8000)、脲、去離子甲酰胺均購自華美生物工程有限公司；溶菌酶、蛋白酶均購自Sigma公司；硝酸銀購自中國人民解放軍第九五零九エ廠；ADNA/HindIII digest DNA Marker,2000DL DNA Marker 和 Taq HS 均購自大連寶生物工程有限公司；16SrDNA通用引物由上海英駿生物工程有限公司合成；土壤提取試劑盒 E.Z.N.A. Soil DNA Kit (50)購自 Omega 公司。三.土壤微生物總DNA直接裂解方法方法一 CTAB-蛋白酶-SDS-反復(fù)凍融法取5g 土樣，向其中加入 13. 5mL DNA 提取液 I (Tris-HCl I OOmmo I/L, EDTAIOOmmoI/L, Na3PO4 IOOmmoI/L, NaCl I. 5mol/L, 1% CTAB ；pH 8. O)和少許石英砂，漩渦振蕩器振蕩3min ;再加入20mg/mL蛋白酶K15 μ L，混勻，37°C、230r/min搖床中溫育Ih ;加入
I.5mL 10% SDS,65°C水浴Ih ;反復(fù)凍融3次,8500r/min離心IOmin ;取上清液,加入等體 積的酹/氯仿/異戍醇(體積比25 : 24 : I)抽提，8500r/min離心IOmin ;取上清液,カロ入等體積的氯仿/異戊醇(體積比24 I)再次抽提，8500r/min離心lOmin，取上清液，備用。方法ニ PVP預(yù)處理-CTAB-溶菌酶-蛋白酶-SDS-反復(fù)凍融法取5g 土樣加入20g/L偏磷酸鈉緩沖液(含10g/L PVP-K30 ；pH 8. 5) 30mL,搖床振蕩15min,8500r/min離心5min,取沉淀，重復(fù)洗漆3次；取沉淀,加入13. 5mL DNA提取液
I(Tris-HCl IOOmmoI/L，EDTA IOOmmoI/L，Na3PO4 100mmol/L, NaCl I. 5mol/L, 1% CTAB ；pH 8. O)和少許石英砂，漩渦振蕩器振蕩3min ;加入100mg/mL溶菌酶150 μ L，混勻，37°C、230r/min搖床中溫育Ih ;再加入20mg/mL蛋白酶K15 μ L，混勻，37°C水浴Ih ;加入I. 5mL10% SDSJS1O水浴Ih ;反復(fù)凍融3次,8500r/min離心IOmin ;取上清液,加入等體積的酹/氯仿/異戍醇(體積比25 24 I)抽提，8500r/min離心IOmin ;取上清液,加入等體積的氯仿/異戍醇(體積比24 I)再次抽提，8500r/min離心IOmin,取上清液,備用。方法三PVP預(yù)處理-CTAB、CaCl2, BSA-溶菌酶-蛋白酶-SDS-反復(fù)凍融法取5g 土樣加入20g/L偏磷酸鈉緩沖液(含10g/LPVP-K30 ；pH 8. 5) 30mL,搖床振蕩15min,8500r/min離心5min,取沉淀，重復(fù)洗漆3次；取沉淀,加入13. 5mL DNA提取液
II(Tris-HCl IOOmmoI/L，EDTA IOOmmoI/L，Na3PO4 100mmol/L, NaCl I. 5mol/L, 1% CTAB,2% CaCl2,1 μ g/mL BSA ；pH 8. 0)和少許石英砂，漩渦振蕩器振蕩3min。后續(xù)操作與方法ニ相同。方法四CTAB、PVP、CaCl2、BSA_溶菌酶、蛋白酶-SDS-反復(fù)凍融法取5g 土樣，加入 13. 5mL DNA 提取液 III (Tris-HCl IOOmmoI/L，EDTA IOOmmoI/L,Na3PO4 IOOmmoI/L, NaCl I. 5mol/L, 1% CTAB, 2% CaCl2,1 μ g/mL BSA,2% PVP ；pH 8. 0)和少許石英砂，鏇潤振蕩器震蕩3min ;加入150 μ L 100mg/mL溶菌酶、15 μ L 20mg/mL蛋白酶K，混勻，37°C、230r/min搖床中溫育lh。后續(xù)操作與方法二相同。方法五CTAB、CaCl2, BSA-溶菌酶、蛋白酶_SDS、PVP-反復(fù)凍融法取5g 土樣，加入 13. 5mL DNA 提取液 II (Tris-HCl IOOmmoI/L, EDTA IOOmmoI/L,Na3PO4 IOOmmoI/L, NaCl I. 5mol/L, 1% CTAB, 2% CaCl2,1 μ g/mL BSA ；pH 8. 0)和少許石英砂，鏇潤振蕩器振蕩3min ;加入100mg/mL溶菌酶150 μ L、20mg/mL蛋白酶K15 μ L,混勻，37°C、230r/min 搖床中溫育 Ih ;加入 I. 5mL 10% SDS 和 O. 3g PVP，混勻，65°C水浴 Ih ;反復(fù)凍融3次。后續(xù)操作與方法二相同。方法六試劑盒法采用Omega公司的土壤提取試劑盒E.Z.N.A. Soil DNA Kit (50)進(jìn)行提取。四.土壤微生物總DNA沉淀方法方法一異丙醇沉淀法在上清液中加入O. 7倍體積異丙醇和O. I倍體積NaAc，_20°C放置過夜，8500r/min,4°C離心20min,沉淀用70%こ醇洗漆，12500r/min離心IOmin,沉淀室溫晾干，加入200 μ LTE溶解沉淀，_20°C保存。方法ニ PEG8000沉淀法在上清液中加入O. 5倍體積25% PEG 8000和O. I倍體積5mol/L NaCl，4°C放置過夜，8500r/min, 4°C離心20min,沉淀用70%こ醇洗漆，12500r/min離心IOmin,沉淀室溫晾干，加入200 μ LTE溶解沉淀，_20°C保存。五.土壤微生物總DNA的質(zhì)量檢測I. DNA的純度和定量檢測用紫外分光光度計(jì)測量DNA溶液的D (230nm)、D (260nm)、D(280nm)值，根據(jù)公式dsDNA = D(260nm) X稀釋的倍數(shù)X50計(jì)算DNA的質(zhì)量濃度(ng/μ L)，換算出每克土提取的 DNA 量，且根據(jù) D (260nm) /D (230nm)、D (260nm) /D (280nm)檢測DNA的純度。同時(shí)用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。2. 16SrDNAV3片段PCR以提取的桑園土壤微生物總DNA為模板直接進(jìn)行PCR。正、反向引物分別為GC-F341(5' -CGCCCGCCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGGGCACGGGGGG CCT ACG GGA GGC AGC AG-3/ )和 R518(5' -ATTACC GCG GCT GCTGG-3')。反應(yīng)體系10XPCR buffer (含 Mg2+)3y L，2. 5mmol/L dNTPs 2. 4 μ L，10 μ mol/L 上、下游引物各
O.6 μ L，Taq 酶 1U，模板 DNA 30ng，最后加 ddH20 至 30 μ し PCR程序:94°C預(yù)變性 5min ；94°C變性lmin,退火Imin, 72 °C延伸Imin, 36個(gè)循環(huán)(退火溫度從65 °C 55 °C,姆ー循環(huán)降低
O.5°C，隨后15個(gè)循環(huán)保持55°C ) ;72°C最終延伸7min。PCR產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。重復(fù)三次。3.變性梯度凝膠電泳分離16SrDNA V3片段PCR產(chǎn)物應(yīng)用JY-TD331變性梯度凝膠電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)分離PCR產(chǎn)物。取15yL PCR產(chǎn)物，加入
10μ L6X loading buffer進(jìn)行變性梯度凝膠電泳(DGGE),電泳條件8%聚丙烯酰胺，電泳緩沖液為1XTAE，50% 80%變性劑(尿素和去離子甲酰胺)，溫度60°C，電壓100V，電泳時(shí)間17h。電泳結(jié)束后銀染顯色。六.結(jié)果分析I.桑樹根圍土壤微生物總DNA提取方法的初步篩選采用5種不同的細(xì)胞裂解方法和2種DNA沉淀方法進(jìn)行組合，從而得到8種不同的直接提取桑樹根圍土壤微生物總DNA的方法，并以試劑盒法提取的桑樹根圍土壤微生物總DNA為參照，利用紫外分光光度法測定其D (230nm)、D (260nm)、D (280nm)值。以D (260nm) /D (280nm)代表DNA的純度與質(zhì)量，以D (260nm)/D (230nm)代表DNA中腐殖酸污染的程度。表I數(shù)據(jù)顯示了不同提取方法的效果。 方法2以CTAB-蛋白酶-SDS-反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，獲得DNA產(chǎn)率較高，但是腐殖酸污染嚴(yán)重；方法3、4、5、6在方法2的基礎(chǔ)上均采用2%偏磷酸鈉緩沖液(含1% PVP-K30 ；PH8. 5)預(yù)洗滌，使微生物從土壤中充分釋放，以期提高DNA產(chǎn)率，但方法3、6并未達(dá)到理想效果，方法4、5效果較好，且對去除腐殖酸則起到了一定作用。其中，方法4和方法5在方法2的基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用BSAXaCl2去除腐殖酸，使得DNA的純度有所提高，腐殖酸的污染程度有所降低。方法8、9省去了 PVP預(yù)處理，PVP在其后的裂解步驟中加入，但影響并不大。試劑盒提取的DNA純度高，腐殖酸污染程度低，但是，DNA產(chǎn)率低，且試劑盒價(jià)格昂貴。由圖I可知，不同方法提取的DNA的分子質(zhì)量都在23kb以上，是基因組DNA，且DNA未被打斷，均為大片段DNA，可用于后續(xù)的分子生物學(xué)分析。綜合考慮DNA純度與質(zhì)量、腐殖酸污染程度和產(chǎn)率，方法4、5、8、9結(jié)合物理、化學(xué)、生物3種方法裂解細(xì)胞，在DNA提取液中添加PVP、BSA、CaCl2進(jìn)ー步去除腐殖酸，省去繁瑣的預(yù)洗滌步驟，獲得的DNA產(chǎn)率高于
11.2 μ g/g, D (260nm) /D (230nm)大于 2. ll，D(260nm)/D(280nm)大于 I. 71，在純度和腐殖酸污染程度上都達(dá)到了直接進(jìn)行PCR的要求。
表I幾種桑樹根圍土壤微生物總DNA提取方法的比較
DNA沉淀方‘DNA產(chǎn)率
、 ニD(260_j
編號(hào)細(xì)胞裂解方法￡)(260 nm)/ nm)/’ f
DNADNA
No.Cell lvsis methods/)(230 nm) ￡)(280
sedimentatioproduction
nm)
n methodsrate
,試劑盒法試劑盒法
1, . ..1.771.7010.0 Kit method Kit method
CTAB-蛋白酶-SDS-反復(fù)凍異丙醇
融/NaAc
20.841.2371.6 CTAB-proteinaseK- Isopropanol/
SDS-freezing thawNaAc
PVP預(yù)處理-CTAB-溶菌酶'
-蛋內(nèi)酶-SDS-反復(fù)凍融 て1
3PVP pretreatment-CT A B -1.271.6955.4 , Isopropanoi/ lvsosome-protemaseK-SDS
-freezing thaw他な
權(quán)利要求
1.一種采用多手段提取桑樹根圍土壌微生物總DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟 所述的方法具體為PVP預(yù)處理-CTAB、CaCl2、BSA-溶菌酶-蛋白酶-SDS-反復(fù)凍融法，取5g土樣加入20g/L偏磷酸鈉緩沖液30mL,搖床振蕩15min, 8500r/min離心5min,取沉淀，重復(fù)洗滌3次；取沉淀，加入13. 5mL DNA提取液II和少許石英砂，漩渦振蕩器振蕩3min ；加入100mg/mL溶菌酶150 μ L,混勻，37°C、230r/min搖床中溫育Ih ;再加入20mg/mL蛋白酶Κ15μ L，混勻，37°C水浴Ih ;加入I. 5mL 10% SDS，65°C水浴Ih ;反復(fù)凍融3次，8500r/min離心IOmin ;取上清液,加入等體積的酹/氯仿/異戍醇(體積比25 : 24 : I)抽提，8500r/min離心IOmin ;取上清液,加入等體積的氯仿/異戍醇(體積比24 I)再次抽提，8500r/min離心lOmin，取上清液，在上清液中加入O. 5倍體積25% PEG 8000和O. I倍體積5mol/L NaCl，4°C放置過夜，8500r/min，4°C離心 20min，沉淀用 70% こ醇洗滌，12500r/min離心lOmin，沉淀室溫晾干，加入200 μ L TE溶解沉淀，_20°C保存；即獲得桑樹根圍土壤微 生物總DNA。所述 DNA 提取液 II 成分為 Tris-HCl IOOmmoI/L, EDTA IOOmmoI/L, Na3PO41OOmmoI/L，NaCl I. 5mol/L, 1% CTAB,2% CaCl2,1 μ g/mL BSA ；pH 8. O0 所述的土樣，采自桑樹根圍土壤，深度為5 IOcm表土層，按5點(diǎn)法取樣，混勻后放入無菌袋中，4°C保存。
2.如權(quán)利要求I所述的提取DNA的方法的用途，其特征在于該方法在進(jìn)行16SrDNA的擴(kuò)增及DGGE圖譜分析，與RDP數(shù)據(jù)庫中已有的序列進(jìn)行比對，或通過建立新的序列探針識(shí)別未知菌，從而確定微生物群落結(jié)構(gòu)組成、結(jié)構(gòu)多樣性及其生態(tài)功能。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種采用多手段提取桑樹根圍土壤微生物總DNA的方法，利用PVP預(yù)洗滌去除腐殖酸，CTAB、溶菌酶、蛋白酶和SDS共同作用以裂解細(xì)胞的同時(shí)對其反復(fù)凍融，獲得了良好的細(xì)胞裂解效果，利用PEG8000沉淀DNA，獲得的DNA純度高。所用方法簡單方便，不經(jīng)純化即可用于后續(xù)的PCR分析和DGGE分析。提取的DNA純度達(dá)到直接進(jìn)行后續(xù)分子生物學(xué)研究的需要，提取的DNA片段可進(jìn)行16SrDNA的擴(kuò)增及DGGE圖譜分析，并可對DGGE譜帶的特異條帶切膠回收、堿基測序，與RDP數(shù)據(jù)庫中已有的序列進(jìn)行比對，或通過建立新的序列探針識(shí)別未知菌，從而確定微生物群落結(jié)構(gòu)組成，為今后研究桑樹根圍土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性與生態(tài)功能奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102643794SQ20121009682
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月5日
發(fā)明者于翠, 葉楚華, 彭波, 李勇, 熊超, 胡興明, 鄧文 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所