專利名稱：南極假單胞菌生防菌株及其生防制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及是生物農(nóng)藥技術(shù)，更詳細(xì)地講是用生物技術(shù)防止農(nóng)作物病蟲害發(fā)生，從南極海泥或海冰微生物中獲取的南極假單胞菌生防菌株及其生防制劑的制備方法。
背景技術(shù)：
眾所周知，傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥存在安全性低、殘留量大，毒素難以降解等問題，不合理的使用往往會(huì)造成了水體、土壤、大氣污染和農(nóng)產(chǎn)品中有毒物質(zhì)殘留，嚴(yán)重危及生態(tài)系統(tǒng)和人類健康，已成為制約人類環(huán)境治理、健康生存、農(nóng)業(yè)穩(wěn)步增長和可持續(xù)發(fā)展的重要因素。目前，世界各國均重視開發(fā)安全性高、殘留量低、無公害、生物活性高、選擇性強(qiáng)的生物農(nóng)藥，以替代目前廣泛使用的化學(xué)農(nóng)藥或減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量。由于南極的地理環(huán)境具有獨(dú)特的地質(zhì)及氣候特征，形成低溫、高鹽、強(qiáng)輻射等自然環(huán)境，造就了極地微生物在基因組成、酶學(xué)特性以及代謝調(diào)控等方面獨(dú)特的分子生物學(xué)機(jī)制與生理生化特性，是世界上結(jié)構(gòu)新穎、功能獨(dú)特的化學(xué)物質(zhì)的發(fā)源地。近幾年我國學(xué)者從極地海洋環(huán)境，篩選獲得對植物病原真菌具有抑制作用，或者對害蟲具有較強(qiáng)觸殺和胃毒作用的微生物，說明極地微生物在生物農(nóng)藥應(yīng)用上具有極大的潛力。因此從極地微生物中發(fā)現(xiàn)不同種類的菌株應(yīng)用于植物病害的生物防治，對極地微生物資源的開發(fā)利用具有重要的意義。假單胞菌能產(chǎn)生多種抗生素和其它化學(xué)物質(zhì)，能改善植物營養(yǎng)，促進(jìn)植物生長，且能降解土壤中的有毒物質(zhì)，對植物促生長和防病作用顯著，部分假單胞菌株還具有殺蟲功能。從海冰或海泥中獲取假單胞菌菌株是生物農(nóng)藥技術(shù)的重大突破，也是研發(fā)和利用南極海冰資源的迫切需要。因此，從南`極海冰或海泥中，獲取假單胞菌菌株、進(jìn)一步開發(fā)假單胞菌系列生物農(nóng)藥產(chǎn)品，是目前人類整治生存環(huán)境、防止農(nóng)作物污染，確保食品安全的迫切需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能消除上述缺點(diǎn)，具有方法簡單、結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特、性能穩(wěn)定、功能奇特、成本低廉、殺菌率高、農(nóng)用藥效價(jià)值大，可促進(jìn)生物生長、降解有毒物質(zhì)等特點(diǎn)的南極假單胞菌生防菌株及其生防制劑的制備方法。尤其是采用液體深層發(fā)酵等科學(xué)的試驗(yàn)手段，首創(chuàng)性的從海冰或海泥中獲得微生物-假單胞菌菌株，進(jìn)而研發(fā)出其保存和制備方法，開創(chuàng)了假單胞菌菌株農(nóng)藥綜合利用的新方法和途徑，開發(fā)了南極海泥或海冰微生物的在農(nóng)業(yè)上的藥用價(jià)值和用途，實(shí)現(xiàn)了從南極海泥或海冰中獲取假單胞菌后制備生防菌株的方法，有效地預(yù)防和抑制農(nóng)作物等植物病蟲害和病菌的發(fā)生，同時(shí)自然資源得到有效地開發(fā)和利用，降低了生產(chǎn)和使用成本，提高了社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益，從海泥或海冰的微生物中獲得假單胞菌菌種是生物農(nóng)藥技術(shù)的重大突破，為開發(fā)研究以防止農(nóng)作物污染、確保食品源安全為宗旨的農(nóng)藥產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)，是理想的從南極海泥或海冰中獲取假單胞菌生防菌株的制備方法。
本發(fā)明的南極假單胞菌生防菌株，是從南極海冰或海泥中分離獲得的海洋細(xì)菌，2011年10月14日已在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記入冊編號CGMCC No. 5346，經(jīng)鑒定參椐的生物材料(株)P4_11，分類命名為假單胞菌Pseudomonassp.。是用于植物病害生物防治的海洋細(xì)菌。所述的海洋細(xì)菌，其保存方法是采用試管斜面法，培養(yǎng)基蛋白胨3-5g，酵母粉0. 5-lg，瓊脂粉15-17g，陳海水120-200毫升，自來水800-880毫升，pH值7. 0-7. 2。在試管斜面上劃線接種生防菌株，于10_15°C，培養(yǎng)24-48小時(shí)后，于3-5°C保存。專用于南極假單胞菌生防菌株的生防制劑的制備方法，其保存的生防菌株制備發(fā)酵種子液，是將試管斜面保存的生防菌株接種于種子培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基的組分為蛋白胨3-5g，酵母粉0. 5-lg，陳海水120-200毫升，自來水800-880毫升，pH值7. 0-7. 2，于10-15°C，150轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)24-48小時(shí)后進(jìn)行深層發(fā)酵獲得。其制備的發(fā)酵種子液進(jìn)行深層發(fā)酵，是在培養(yǎng)基麩皮5-6g，酵母粉3g-4g，陳海水150毫升，自來水850毫升，滅菌后pH值為7.0-7. 2條件下進(jìn)行。100L發(fā)酵罐的加料量為70L，按以5-7%質(zhì)量百分?jǐn)?shù)接種制備的種子液。發(fā)酵溫度利用外接低溫循環(huán)水控制，罐內(nèi)溫度保持在13°C 土 TC ;罐內(nèi)壓力控制在0. 02Pa;攪拌速度為220-250轉(zhuǎn)/分，通過空氣壓縮機(jī)向罐內(nèi)通入壓縮空氣，以提供發(fā)酵過程中需要的氧氣；在培養(yǎng)基中加入300-350毫升豆油作為消泡劑，以消除在攪拌過程中產(chǎn)生的氣泡。發(fā)酵96-120小時(shí)菌株數(shù)量可達(dá)IO9個(gè)/毫升。其深層發(fā)酵的發(fā)酵液制備生防制劑，是將假單胞菌Pseudomonas sp. P4-11菌株的發(fā)酵液，添加生長營養(yǎng)元素后，制成生防菌株制劑，于常溫保存，該生長營養(yǎng)元素包括硫酸銨0. 15-0. 19克，硫酸鋅0. 4-0. 54克，磷酸鈣0. 3-0. 59克，硝酸鉀0. 82-0. 92克，過磷酸鈣0. 2-0. 33克，硫酸鐵0. 10-0. 12克；硼酸、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅分別為0. 0006克；生防菌株發(fā)酵液1000mL。菌株制劑外觀為淡黃色液體，活菌數(shù)量達(dá)IO9個(gè)/毫升。使用南極假單胞菌生防菌株專用生防制劑的制備方法，所制備的生防制劑可有效地抑制或預(yù)防尖刀鐮孢菌、辣椒疫霉和大麗輪枝菌的植物病原真菌的產(chǎn)生。所制備的生防制劑稀釋5-10倍后，用于大棚黃瓜白粉病的防治。 本發(fā)明首先提供南極假單胞菌Pseudomonas sp. P4-11為生防菌株,通過液體深層發(fā)酵制備，獲得生防菌株制劑，并測定其生物活性，為其在農(nóng)作物病害生物防治技術(shù)領(lǐng)域的
應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下(I)生防菌株的獲得與鑒定該生防菌株來自中國第24次南極科學(xué)考察烏拉圭站(S62° 11’ 50.52”，W58° 55. ’ 50. 4”)采集的海冰樣品中，采用佐貝爾2216E培養(yǎng)基分離獲得，經(jīng)16S rDNA鑒定為假單胞菌屬(Pseudomonas),命名為Pseudomonas sp. P4-11 (中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記入冊編號CGMCC No. 5346)。(2)生防菌株的保存該生防菌株P(guān)seudomonas sp. P4-11是采用試管斜面,于4°C保存。試管斜面保存菌株的制作具體步驟如下培養(yǎng)基蛋白胨3_5g，酵母粉0. 5-lg，瓊脂粉15_17g，陳海水150毫升，自來水850毫升，pH值7. 0-7.2。培養(yǎng)基滅菌后，在試管斜面上劃線接種Pseudomonas sp. P4-11生防菌株，于10_15°C，培養(yǎng)24-36小時(shí)，貯存于4°C。(3)生防菌株發(fā)酵種子液的制備
該生防菌株的發(fā)酵和制備，首先是將菌株接種于種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基組成蛋白胨3-5g，酵母粉0. 5-lg，陳海水150毫升，自來水850毫升，pH值7. 0-7. 2。培養(yǎng)基100-120°C滅菌30-50分鐘，冷卻后，將試管斜面保存的生防菌株P(guān)seudomonas sp.P4_ll接種到500毫升三角瓶中(含300毫升培養(yǎng)基)，于10-15°C，150轉(zhuǎn)速/分鐘振蕩培養(yǎng)24-48小時(shí)后，得發(fā)酵種子液。(4)生防菌株深層發(fā)酵液的制備在獲得發(fā)酵種子液的基礎(chǔ)上，準(zhǔn)備深層發(fā)酵培養(yǎng)基麩皮5_6g，酵母粉3g_4g，陳海水150毫升，自來水850毫升。100升發(fā)酵罐，裝70升培養(yǎng)基，滅菌后pH值為7. 0-7. 2。按5-7%質(zhì)量百分?jǐn)?shù)將Pseudomonas sp. P4-11種子液接種于發(fā)酵罐內(nèi)的深層發(fā)酵培養(yǎng)基，通過空氣壓縮機(jī)向罐內(nèi)通入壓縮空氣，以提供發(fā)酵過程中需要的氧氣，罐內(nèi)壓力控制在
0.02Pa ;發(fā)酵溫度保持在13 土 1°C，管內(nèi)溫度通過低溫冷凍循環(huán)機(jī)控制；加入300-350毫升滅菌的豆油作為消泡劑來消除在攪拌過程中產(chǎn)生的氣泡。攪拌速度為220-250轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵96-120小時(shí)。由此可得到70L菌株數(shù)量為IO9個(gè)/暈升的發(fā)酵液。(5)生防菌株制劑的制備將假單胞菌Pseudomonas sp. P4-11菌株的發(fā)酵液適當(dāng)添加生長營養(yǎng)元素后，制成菌株生防制劑，該制劑可于常溫保存。制劑外觀為淡黃色液體，活菌數(shù)量達(dá)IO9個(gè)/毫升。

(6)生防菌株制劑對植物病原的抑制作用的分析方法和應(yīng)用效果植物病原以真菌尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)等常見病原菌為指示菌。將植物病原真菌接種于PDA固體培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)48小時(shí)后，取一塊菌絲體，加至含無菌水的試管中充分振蕩，用兩層滅菌紗布過濾菌絲后，稀釋獲得植物病原真菌孢子懸浮液(IO5個(gè)/暈升)。采用平板擴(kuò)散法測定生防菌株制劑抑菌活性。將PDA培養(yǎng)基融化后冷卻至45°C，以1: 100 (v/v)倒入各種植物病原真菌的孢子懸浮液，混勻后傾注到平皿中，每皿約20毫升。冷卻后，用打孔器呈十字形打孔(直徑7毫米)；再用冷卻至適當(dāng)溫度的PDA培養(yǎng)基封底，將生防制劑以清水適當(dāng)稀釋后，每孔加入50微升，于22°C培養(yǎng)48小時(shí)后，測量抑菌圈大小。結(jié)果表明假單胞菌Pseudomonas sp. P4-11對尖刀鐮孢菌、辣椒疫霉、大麗輪枝菌等植物病原真菌的抑菌直徑在19-34毫米，為強(qiáng)抑制作用。(7)生防菌株制劑的應(yīng)用將生防菌株制劑以清水適當(dāng)稀釋后，用噴霧器對農(nóng)田或大棚栽培的果蔬施藥，將藥液均勻噴施于黃瓜植株全株，可獲得68. 26%的防治效果。本發(fā)明的一種南極假單胞菌生防菌株是分離于南極海泥或海冰中，經(jīng)分子鑒定確定為假單胞菌屬，是取自極地極端環(huán)境的南極菌株。該菌株屬于能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)的假單胞菌屬。將該菌株保存后進(jìn)行深層發(fā)酵，可有效地對農(nóng)作物病害進(jìn)行生物防治，制備可用于防治農(nóng)業(yè)果蔬植物病害的生防制劑具有廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明的特點(diǎn)在于1.首次以南極假單胞菌(Pseudomonas)屬作為果蔬病害的生防菌株,并建立該菌株的100L體積發(fā)酵罐的發(fā)酵工藝。2.提供了南極假單胞菌Pseudomonas sp. P4-11的潛在用途抑菌實(shí)驗(yàn)表明，生防菌株制劑對多種植物病原具有抑制作用；對大棚黃瓜黃瓜白粉病的防治效果達(dá)68. 26%,與I %武夷菌素水劑500倍稀釋液63. 71%的防效相當(dāng)。說明本發(fā)明中的菌株在植物病害的無公害生 物防治中具有潛在的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1.菌株的種屬鑒定和保存南極假單胞菌Pseudomonas sp. P4-11源自中國第24次南極科學(xué)考察烏拉圭站(S62° 11’ 50. 52”，W58° 55. ’ 50. 4”)采集的海冰樣品，采用佐貝爾2216E培養(yǎng)基篩選、分離獲得。通過16S rDNA鑒定種屬。保存條件為試管斜面4°C保存。試管斜面培養(yǎng)基蛋白胨3-5g，酵母粉0. 5-lg，瓊脂粉15-17g，陳海水150毫升，自來水850毫升，pH值7. 0-7. 2。實(shí)施例2.生防菌株的發(fā)酵和制備方法(I)種子制備采用4°C斜面保存的生防菌株，首先將試管斜面保存的生防菌株P(guān)seudomonassp. P4-11接種于種子培養(yǎng)基中(蛋白胨3-5g，酵母粉0. 5-lg，陳海水150毫升，自來水850毫升，PH值7. 0-7. 2)。于10-15°C，150轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)24-48小時(shí)后，得發(fā)酵種子液。(2)生防菌株的深層發(fā)酵深層發(fā)酵培養(yǎng)基麩皮5_6g，酵母粉3g_4g，陳海水150毫升，自來水850毫升。100升發(fā)酵罐的加料量為70升，滅菌后pH值為7. 0-7. 2。按5-7%質(zhì)量百分?jǐn)?shù)接種生防菌株種子液，發(fā)酵溫度利用低溫冷凍循環(huán)機(jī)控制，罐內(nèi)溫度保持在在13土1°C ;通過空氣壓縮機(jī)向罐內(nèi)通入壓縮空氣，以提供發(fā)酵過程中需要的氧氣，罐內(nèi)壓力控制在0. 02Pa ；;攪拌速度為220-250轉(zhuǎn)/分，加入300-350毫升滅菌的豆油作為消泡劑來消除在攪拌過程中產(chǎn)生的氣泡。發(fā)酵96-120小時(shí),菌株數(shù)量可達(dá)IO9個(gè)/暈升。(3)生防菌株制劑的制備上述假單胞菌Pseudomonas sp. P4-11菌株的發(fā)酵液，適當(dāng)添加生長營養(yǎng)元素后，制成生防菌株制劑，于常溫保存。生長營養(yǎng)元素包括硫酸銨1. 5-1. 9克，硫酸鋅4. 0-5. 4克，磷酸鈣3. 0-5. 9克，硝酸鉀8. 2-9. 2克，過磷酸鈣2. 0-3. 3克，硫酸鐵1. 0-1. 2克；硼酸、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅分別為0. 006克；生防菌株發(fā)酵液1000mL。菌株制劑外觀為淡黃色液體，活菌數(shù)量達(dá)IO9個(gè)/毫升。實(shí)施例3.生防菌株制劑的抑菌范圍假單胞菌Pseudomonas sp. P4-11生防菌株制劑,用以測定對植物病原的抑制效果。植物病原真菌以尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)等常見植物病原菌為指示菌。病原真菌接種于PDA固體培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)48小時(shí)后，取一塊菌絲體，加至含無菌水的試管中充分振蕩，用兩層滅菌紗布過濾菌絲后，稀釋獲得植物病原真菌孢子懸浮液(IO5個(gè)/毫升)。采用平板擴(kuò)散法測定菌株抑菌活性。將PDA培養(yǎng)基融化后冷卻至45°C，以I 100 (v/v)倒入各種植物病原真菌的孢子懸浮液，混勻后傾注到平皿中，每皿約20毫升。冷卻后，用打孔器呈十字形打孔(直徑7毫米)；再用冷卻至適當(dāng)溫度的PDA培養(yǎng)基封底，將生防菌株制劑適當(dāng)稀釋后，每孔加入50微升，22°C培養(yǎng)48小時(shí)后，測量抑菌圈大小。結(jié)果表明假單胞菌Pseudoalteromonas sp. P4-11菌株對尖鐮孢菌、辣椒疫霉、大麗輪枝菌、水稻紋枯病菌和瓜亡革菌均有抑制作用(表I)。表I假單胞菌Pseudomonas sp. P4-11-07-1制劑對植物病原真菌的抑菌范圍
權(quán)利要求
1.一種南極假單胞菌生防菌株，其特征在于是從南極海冰或海泥中分離獲得的海洋細(xì)菌，鑒定確認(rèn)為參椐的生物材料(株)P4-11，分類命名為假單胞菌Pseudomonas sp.，分子鑒定確認(rèn)為假單胞菌Pseudomonas屬，命名為Pseudomonas sp. P4-11。
2.如權(quán)利要求1所述的一種南極假單胞菌生防菌株，其特征在于所述的海洋細(xì)菌，其保存方法是采用試管斜面法，培養(yǎng)基蛋白胨3-5g，酵母粉O. 5-lg，瓊脂粉15-17g，陳海水120-200毫升，自來水800-880毫升，pH值7. 0_7. 2，在試管斜面上劃線接種生防菌株，于I O-15 °C，培養(yǎng)24-48小時(shí)后，于3_5°C保存。
3.專用于南極假單胞菌生防菌株的生防制劑的制備方法，其特征在于保存的生防菌株制備發(fā)酵種子液，是將試管斜面保存的生防菌株接種于種子培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基的組分為蛋白胨3-5g,酵母粉0. 5-lg,陳海水120-200毫升，自來水800-880毫升，pH值7. 0-7. 2，于10-15°C，150轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)24-48小時(shí)后進(jìn)行深層發(fā)酵獲得。
4.如權(quán)利要求3所述的專用于南極假單胞菌生防菌株的生防制劑的制備方法，其特征在于制備的發(fā)酵種子液進(jìn)行深層發(fā)酵，是在培養(yǎng)基麩皮5-6g，酵母粉3g-4g，陳海水150毫升，自來水850毫升，滅菌后pH值為7. 0-7. 2條件下進(jìn)行，100L發(fā)酵罐的加料量為70L，按以5-7%質(zhì)量百分?jǐn)?shù)接種制備的種子液，發(fā)酵溫度利用外接低溫循環(huán)水控制，罐內(nèi)溫度保持在13°C ±1°C ;罐內(nèi)壓力控制在0. 02Pa ;攪拌速度為220-250轉(zhuǎn)/分，通過空氣壓縮機(jī)向罐內(nèi)提供發(fā)酵過程中需要的氧氣；在培養(yǎng)基中加入300-350毫升豆油作為消泡劑，發(fā)酵96-120小時(shí)菌株數(shù)量可達(dá)IO9個(gè)/毫升。
5.如權(quán)利要求3或4所述的專用于南極假單胞菌生防菌株的生防制劑的制備方法，其特征在于深層發(fā)酵的發(fā)酵液制備生防制劑，是將假單胞菌Pseudomonas sp. P4-11菌株的發(fā)酵液，添加生長營養(yǎng)元素后，制成生防菌株制劑，于常溫保存，該生長營養(yǎng)元素包括硫酸銨0. 15-0. 19克，硫酸鋅0. 4-0. 54克，磷酸鈣0. 3-0. 59克，硝酸鉀0. 82-0. 92克，過磷酸鈣0. 2-0. 33克，硫酸鐵0. 10-0. 12克；硼酸、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅分別為0. 0006克；生防菌株發(fā)酵液IOOOmL,菌株制劑外觀為淡黃色液體，活菌數(shù)量達(dá)IO9個(gè)/毫升。
6.如權(quán)利要求5所述的專用于南極假單胞菌生防菌株的生防制劑的制備方法，其特征在于所制備的生防制劑可抑制或預(yù)防尖刀鐮孢菌、辣椒疫霉和大麗輪枝菌的植物病原真菌的產(chǎn)生。
7.如權(quán)利要求5所述的專用于南極假單胞菌生防菌株的生防制劑的制備方法，其特征在于所制備的生防制劑稀釋5-10倍后，用于大棚黃瓜白粉病的防治。
全文摘要
南極假單胞菌生防菌株是從南極海冰或海泥中分離獲得海洋細(xì)菌，分子鑒定為假單胞菌Pseudomonas屬，命名為Pseudomonas sp.P4-11。利用該菌株制備生防制劑具有方法簡單、活性獨(dú)特、功能奇特、農(nóng)用藥效價(jià)值大，降解有毒物質(zhì)等特點(diǎn)。采用液體深層發(fā)酵等科學(xué)的試驗(yàn)手段，首創(chuàng)性的從海冰或海泥中獲得假單胞菌生防菌株，實(shí)現(xiàn)了獲取和保存假單胞菌生防菌株的方法，開創(chuàng)了假單胞菌生物農(nóng)藥綜合利用，預(yù)防和抑制農(nóng)作物病蟲害，自然資源得到開發(fā)和利用，降低了成本，提高了社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。從海冰微生物獲得假單胞菌是生物農(nóng)藥技術(shù)的重大突破，為研究開發(fā)防止農(nóng)作物污染和確保食品源安全的農(nóng)藥產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12R1/38GK103031257SQ20121009701
公開日2013年4月10日 申請日期2012年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月17日
發(fā)明者何培青, 林學(xué)政, 黃曉航, 沈繼紅 申請人:國家海洋局第一海洋研究所