番鴨呼腸孤病毒通用型rt-pcr檢測(cè)引物及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種番鴨呼腸孤病毒通用型RT-PCR檢測(cè)引物及檢測(cè)方法，屬于鴨類病毒檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。該通用型RT-PCR檢測(cè)引物為上游引物：5’-CACAGTGCTACCATC-3’，下游引物：5’-CTGCTGATCATAATT-3’。檢測(cè)方法是用番鴨呼腸孤病毒通用型RT-PCR檢測(cè)引物與待測(cè)樣品RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，如果擴(kuò)增產(chǎn)物包含436bp的片段，則待測(cè)樣品包含番鴨呼腸孤病毒。本發(fā)明根據(jù)番鴨呼腸孤病毒σA基因序列進(jìn)行比對(duì)后，優(yōu)化設(shè)計(jì)了通用引物，并進(jìn)一步優(yōu)化了一步法RT-PCR。該方法不僅能同時(shí)檢測(cè)MDRV和NDRV兩種番鴨呼腸孤病毒，還具有重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、敏感性高的特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】番鴨呼腸孤病毒通用型RT-PCR檢測(cè)引物及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及番鴨病毒檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種番鴨呼腸孤病毒通用型RT-PCR檢測(cè)引物及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]番鴨呼腸孤病毒病是由番鴨呼腸孤病毒(Muscovy duck reovirus, MDRV)引起的番鴨、半番鴨及鵝的一種急性傳染病，臨床主要病變特征有軟腳、腹瀉和生長(zhǎng)發(fā)育不良，以肝、脾表面有大量灰白色壞死點(diǎn)為主要病變表現(xiàn)，俗稱番鴨肝“白點(diǎn)病”或“花肝病”，本病多發(fā)于10~45日齡的番鴨，發(fā)病率通常為30%~90%，病死率一般為60%~80%，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致全群死亡，造成番鴨養(yǎng)殖業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]1972年法國(guó)學(xué)者首次從患病番鴨中分離鑒定了番鴨呼腸孤病毒，其后，以色列(1981)、意大利(1984)、德國(guó)(1992)等地相繼報(bào)道并證實(shí)了本病。從1997年開(kāi)始，該病在我國(guó)的福建、浙江、廣東、江蘇和江西等番鴨飼養(yǎng)區(qū)爆發(fā)流行。此外，2005年以來(lái)，在福建省的莆田、福州、廣東省佛山和浙江省等地的番鴨、半番鴨、野鴨、麻鴨和鵝群又發(fā)生一種以肝臟不規(guī)則壞死和出血混雜、心肌出血、脾臟腫大斑塊狀壞死、腎臟和法氏囊出血為主要特征的新型鴨呼腸孤病毒(novel duck reovirus, NDRV)(鴨出血性壞死性肝炎)。
[0004]動(dòng)物傳染病確診的傳統(tǒng)方法主要通過(guò)病原的分離、電鏡觀察、血清學(xué)鑒定等方法，但該方法繁瑣、費(fèi)時(shí)，不利于疾病的早期診斷及快速控制。隨著分子生物學(xué)的興起，PCR、RT-PCR技術(shù)因具有特異性強(qiáng)、敏感性好、快速等優(yōu)點(diǎn)已廣泛用于動(dòng)物病原微生物的檢測(cè)，常見(jiàn)的動(dòng)物傳染病都已建立其相應(yīng)的PCR或RT-PCR的檢測(cè)方法。
[0005]2004年，胡奇林等人根據(jù)SI基因序列設(shè)計(jì)引物，建立了番鴨呼腸孤病毒的臨床快速診斷方法，在此基礎(chǔ)上，2011年王劭等人又為了鑒別診斷MDRV及NDRV，利用NDRV S3基因變異區(qū)作為RT-PCR診斷的靶區(qū)段設(shè)計(jì)引物，建立了檢測(cè)NDRV的RT-PCR方法。但上述建立的RT-PCR方法是基于鑒別診斷而設(shè)計(jì)的，只能擴(kuò)增出各自相應(yīng)病毒的條帶，單獨(dú)檢測(cè)MDRV或NDRV，無(wú)法建立番鴨呼腸孤病毒通用的RT-PCR檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供了一種特異性強(qiáng)、敏感性高的番鴨呼腸孤病毒通用型RT-PCR檢測(cè)引物。
[0007]一對(duì)引物，包括:
[0008]上游引物:5’-CACAGTGCTACCATC-3’ ；
[0009]下游引物:5’ -CTGCTGATCATAATT-3 ’。
[0010]本發(fā)明還提供了一種包含所述引物的RT-PCR試劑盒。
[0011]本發(fā)明還提供了所述RT-PCR試劑盒在檢測(cè)番鴨呼腸孤病毒中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明又提供了一種檢測(cè)番鴨呼腸孤病毒的方法，利用待檢測(cè)樣品的RNA和所述的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，如果擴(kuò)增產(chǎn)物包含436bp的片段，則待測(cè)樣品包含番鴨呼腸孤病毒。
[0013]優(yōu)選的，所述RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:
[0014]
【權(quán)利要求】
1.一對(duì)引物，其特征在于:
上游引物:5 ’ -CACAGTGCTACCATC-3 ’ ； 下游引物:5’ -CTGCTGATCATAATT-3’。
2.一種包含權(quán)利要求1所述引物的RT-PCR試劑盒。
3.如權(quán)利要求2所述的RT-PCR試劑盒在檢測(cè)番鴨呼腸孤病毒中的應(yīng)用。
4.一種檢測(cè)番鴨呼腸孤病毒的方法，其特征在于，利用待檢測(cè)樣品的RNA和權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，如果擴(kuò)增產(chǎn)物包含436bp的片段，則待測(cè)樣品包含番鴨呼腸孤病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，RT-PCR的反應(yīng)條件為:
(1)50°C30min ； (2)預(yù)變性:95°C4min ； (3)變性:94°C45s ;退火:56°C 45s ;延伸:72°C 45s ;共進(jìn)行30次循環(huán)； (4)延伸:72°CIOmin0
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK103966359SQ201410178463
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年4月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月29日
【發(fā)明者】葉偉成, 余斌, 張存, 云濤, 陳柳, 倪征, 華炯鋼 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院