一種鑒定雞細(xì)小病毒和禽呼腸孤病毒的引物組合及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鑒定雞細(xì)小病毒和禽呼腸孤病毒的引物組合及其應(yīng)用
【背景技術(shù)】
[0002] 雞細(xì)小病毒(Chincken parvovirus，ChPV)是一種單鏈DNA病毒，為引起雞腸道疾 病的主要病原體之一，可以引起以腹瀉、精神抑郁、體溫調(diào)節(jié)障礙、生長遲緩、增加飼料消耗 等為特征的急性或慢性腸道性疾病、矮小綜合癥、營養(yǎng)不良綜合癥。ChPV在雞群中普遍存 在，主要侵害雛雞，但以商品肉雞感染率較高、蛋雞或種雞次之，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì) 損失。自2010年以來，北美、波蘭、匈牙利、克羅地亞、南韓等國家相繼暴發(fā)了該病，給養(yǎng)雞業(yè) 造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。禽呼腸孤病毒(Avian reoviruses，ARV)是引起禽類法氏囊胸腺收 縮、關(guān)節(jié)炎、骨骼異常發(fā)育、產(chǎn)蛋率下降以及營養(yǎng)吸收障礙綜合征等疾病的一種雙鏈RNA病 毒，不同性別和日齡的雞群均可感染。ChPV與ARV是危害養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的主要病原，均能引起 雛雞腸道性疾病、矮小綜合癥以及營養(yǎng)吸收障礙綜合征等疾病，因此建立一種ChPV與ARV快 速鑒別診斷方法對養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。
[0003] 目前，實驗室診斷檢測上述兩種病原的方法以傳統(tǒng)的病毒分離、瓊脂擴(kuò)散試驗、間 接熒光試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等為主，但這些檢測方法存在耗時長、敏感性低、 標(biāo)準(zhǔn)化難等缺點，在實際應(yīng)用中具有一定的局限性，因此越來越多的學(xué)者致力于PCR檢測方 法。與常規(guī)PCR相比，多重PCR具有可同時檢測、鑒別多種病原體的特點，在多種病原混合感 染的鑒別診斷中具有獨(dú)特的優(yōu)勢和很高的臨床實用價值，但目前尚無可快速鑒別診斷ChPV 與ARV的多重PCR檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種鑒定雞細(xì)小病毒和禽呼腸孤病毒的引物組合及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明提供了一種引物組合，由引物對I和引物對II組成；
[0006] 所述引物對I由引物ChPV-F和引物ChPV-R組成；
[0007] 所述引物ChPV-F為如下(al)或(a2);
[0008] (al)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；
[0009] (a2)將序列1經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有 相同功能的DNA分子；
[0010] 所述引物ChPV-R為如下(a3)或(a4);
[0011] (a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；
[0012] (a4)將序列2經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有 相同功能的DNA分子；
[0013 ] 所述引物對11由引物ARV-F和引物ARV-R組成；
[0014] 所述引物ARV-F為如下(bl)或(b2);
[0015] (bl)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；
[0016] (b2)將序列3經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有 相同功能的DNA分子；
[0017] 所述引物ARV-R為如下(b3)或(b4);
[0018] (b3)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；
[0019] (b4)將序列4經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有 相同功能的DNA分子。
[0020] 所述引物組合的用途為如下（cl)至(c6)中的任意一種：
[0021] (cl)鑒別雞細(xì)小病毒和禽呼腸孤病毒；
[0022] (c2)制備用于鑒別雞細(xì)小病毒和禽呼腸孤病毒的試劑盒；
[0023] (c3)鑒定待測病毒是否為雞細(xì)小病毒或禽呼腸孤病毒；
[0024] (c4)制備用于鑒定待測病毒是否為雞細(xì)小病毒或禽呼腸孤病毒的試劑盒；
[0025] (c5)鑒定待測樣本是否感染了雞細(xì)小病毒和/或禽呼腸孤病毒；
[0026] (c6)制備用于鑒定待測樣本是否感染了雞細(xì)小病毒和/或禽呼腸孤病毒的試劑 盒。
[0027] 本發(fā)明還保護(hù)所述引物組合的應(yīng)用，為如下(cl)至(c6)中的任意一種：
[0028] (cl)鑒別雞細(xì)小病毒和禽呼腸孤病毒；
[0029] (c2)制備用于鑒別雞細(xì)小病毒和禽呼腸孤病毒的試劑盒；
[0030] (c3)鑒定待測病毒是否為雞細(xì)小病毒或禽呼腸孤病毒；
[0031] (c4)制備用于鑒定待測病毒是否為雞細(xì)小病毒或禽呼腸孤病毒的試劑盒；
[0032] (c5)鑒定待測樣本是否感染了雞細(xì)小病毒和/或禽呼腸孤病毒；
[0033] (c6)制備用于鑒定待測樣本是否感染了雞細(xì)小病毒和/或禽呼腸孤病毒的試劑 盒。
[0034] 所述(c3)或所述(c4)中，所述待測病毒具體可為雞細(xì)小病毒、禽呼腸孤病毒、馬立 克病毒、傳染性喉氣管炎病毒、雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒或傳染性支氣管炎病毒。
[0035] 所述(c5)或所述(c6)中，所述待測樣本具體可為雞病料，例如雞口腔拭子、雞泄殖 腔拭子、生鮮雞肉、生鮮雞內(nèi)臟、雞肉加工品、雞內(nèi)臟加工品等。
[0036] 本發(fā)明還保護(hù)含有所述引物組合的試劑盒;所述試劑盒的用途為如下(dl)或(d2) 或(d3):
[0037] (dl)鑒別雞細(xì)小病毒和禽呼腸孤病毒；
[0038] (d2)鑒定待測病毒是否為雞細(xì)小病毒或禽呼腸孤病毒；
[0039] (d3)鑒定待測樣本是否感染了雞細(xì)小病毒和/或禽呼腸孤病毒。
[0040] 所述(d2)中，所述待測病毒具體可為雞細(xì)小病毒、禽呼腸孤病毒、馬立克病毒、傳 染性喉氣管炎病毒、雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒或傳染性支氣管炎病毒。
[0041] 所述(d3)中，所述待測樣本具體可為雞病料，例如雞口腔拭子、雞泄殖腔拭子、生 鮮雞肉、生鮮雞內(nèi)臟、雞肉加工品、雞內(nèi)臟加工品等。
[0042] 本發(fā)明還保護(hù)所述試劑盒的制備方法，包括將各條引物單獨(dú)包裝的步驟。
[0043] 本發(fā)明還保護(hù)一種鑒別待測病毒為雞細(xì)小病毒還是禽呼腸孤病毒的方法(方法 甲），包括如下步驟：
[0044] (1)將待測病毒的基因組DNA和所述待測病毒的cDNA混合，得到混合樣本；
[0045] (2)以步驟(1)得到的混合樣本為模板，采用所述引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果采用 所述引物對I可以實現(xiàn)對所述模板的特異性擴(kuò)增、待測病毒為雞細(xì)小病毒，如果采用所述引 物對II可以實現(xiàn)對所述模板的特異性擴(kuò)增、待測病毒為禽呼腸孤病毒。
[0046] 所述方法甲中，所述待測病毒為雞細(xì)小病毒或禽呼腸孤病毒。
[0047] 本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定待測病毒是否為雞細(xì)小病毒或禽呼腸孤病毒的方法(方法 乙），包括如下步驟：
[0048] (1)將待測病毒的基因組DNA和所述待測病毒的cDNA混合，得到混合樣本；
[0049] (2)以步驟(1)得到的混合樣本為模板，采用所述引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果采用 所述引物對I可以實現(xiàn)對所述模板的特異性擴(kuò)增、待測病毒為或候選為雞細(xì)小病毒，如果采 用所述引物對II可以實現(xiàn)對所述模板的特異性擴(kuò)增、待測病毒為或候選為禽呼腸孤病毒， 如果采用所述引物對I不能實現(xiàn)對所述模板的特異性擴(kuò)增且采用所述引物對II不能實現(xiàn)對 所述模板的特異性擴(kuò)增、待測病毒為或候選為非雞細(xì)小病毒且非禽呼腸孤病毒的病毒。
[0050] 所述方法乙中，所述待測病毒具體可為雞細(xì)小病毒、禽呼腸孤病毒、馬立克病毒、 傳染性喉氣管炎病毒、雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒或傳染性支氣管炎病毒。
[0051] 本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定待測樣本是否感染雞細(xì)小病毒和/或禽呼腸孤病毒的方法 (方法丙），包括如下步驟：
[0052] (1)將待測樣本的總DNA和所述待測樣本的cDNA混合，得到混合樣本；
[0053] (2)以步驟（1)得到的混合樣本為模板，采用所述引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果采用 所述引物對I可以實現(xiàn)對所述模板的特異性擴(kuò)增、待測樣本感染或疑似感染雞細(xì)小病毒，如 果采用所述引物對II可以實現(xiàn)對所述模板的特異性擴(kuò)增、待測樣本感染或疑似感染禽呼腸 弧病毒述引物對I可以實現(xiàn)對所述模板的特異性擴(kuò)增且采用所述引物對II可以實現(xiàn)對所述 模板的特異性擴(kuò)增、待測樣本感染或疑似感染雞細(xì)小病毒和禽呼腸孤病毒，如果采用所述 引物對I不能實現(xiàn)對所述模板的特異性擴(kuò)增且如果采用所述引物對II不能實現(xiàn)對所述模板 的特異性擴(kuò)增、待測樣本疑似未感染雞細(xì)小病毒且疑似未感染禽呼腸孤病毒。
[0054]所述方法丙中，所述待測樣本具體可為雞病料，例如雞口腔拭子、雞泄殖腔拭子、 生鮮雞肉、生鮮雞內(nèi)臟、雞肉加工品、雞內(nèi)臟加工品等。
[0055]本發(fā)明還保護(hù)所述引物對I。
[0056] 本發(fā)明還保護(hù)所述引物對I的應(yīng)用，為如下(el)或(e2):
[0057] (el)鑒定待測病毒是否為雞細(xì)小病毒；
[0058] (e2)鑒定待測樣本是否感染了雞細(xì)小病毒。
[0059] 本發(fā)明還保護(hù)含有所述引物對I的試劑盒;所述試劑盒的用途為如下(el)或(e2):
[0060] (el)鑒定待測病毒是否為雞細(xì)小病毒；
[0061] (e2)鑒定待測樣本是否感染了雞細(xì)小病毒。
[0062] 所述(el)中，所述待測病毒具體可為雞細(xì)小病毒、禽呼腸孤病毒、馬立克病毒、傳 染性喉氣管炎病毒、雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒或傳染性支氣管炎病毒。
[0063] 所述(e2)中，所述待測樣本具體可為雞病料，例如雞口腔拭子、雞泄殖腔拭子、生 鮮雞肉、生鮮雞內(nèi)臟、雞肉加工品、雞內(nèi)臟加工品等。
[0064]本發(fā)明還保護(hù)所述引物