R的產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳并拍照。
[0177] 結(jié)果見圖4。圖4中，泳道1-9依次對應(yīng)采用反應(yīng)體系1-9時二重PCR的擴增產(chǎn)物，Μ對 應(yīng)lOObp DNA Marker，N對應(yīng)陰性對照的二重PCR的擴增產(chǎn)物。結(jié)果表明，最低能同時檢測到 58fg的ChPV和53fg的ARV。
[0178] 實施例5、臨床樣品檢測
[0179] 2014年10月-2015年12月采集50份雞病料（口腔+泄殖腔雙棉拭子），按如下步驟進(jìn) 行鑒定：
[0180] 1、取病料，提取總DNA。
[0181] 2、取病料，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。
[0182] 3、將步驟1得到的基因組DNA( DNA含量為Xng)和步驟2得到的cDNA混合(DNA含量也 為Xng)，得到混合樣本。
[0183] 4、將步驟3得到的混合樣本作為模板，采用實施例1制備的引物組合進(jìn)行二重PCR。
[0184] 二重PCR的反應(yīng)體系（25.0yL):包含2XPCR Mix 12.5yL，模板2.0yL(DNA含量為 0.5-2ng)，引物對I和引物對II，最后用ddH20補足至25. OyL。二重PCR的反應(yīng)體系中，ChPV-F 和ChPV-R的濃度均為0.4pmolAiL，ARV-F和ARV-R的濃度均為0.4pmolAiL。設(shè)置用等體積水 代替混合樣本的陰性對照。設(shè)置用等體積的實施例二步驟一得到的混合樣本代替步驟3得 到的混合樣本的陽性對照。
[0185] 二重 PCR 的反應(yīng)程序：95°C 預(yù)變性 51^11;95°(：1111丨11、56.1°(：1111丨11、72°(：1111丨11，進(jìn)行35 個循環(huán);72°C延伸lOmin。
[0186] 將二重PCR的產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳并拍照。
[0187] 部分檢測結(jié)果見圖5。圖5中，P對應(yīng)陽性對照的二重PCR的擴增產(chǎn)物，Μ對應(yīng)100bp DNA Marker，N對應(yīng)陰性對照的二重PCR的擴增產(chǎn)物，泳道1-22依次對應(yīng)50份雞病料中22份 的檢測結(jié)果(泳道5、11、13、14、15、17和18顯示ChPV陽性結(jié)果）。統(tǒng)計結(jié)果，50份雞病料中共 檢出8份ChPV陽性病料，未檢出ARV陽性病料。
[0188] 五次重復(fù)檢測，結(jié)果一致。
[0189] 將顯示ChPV陽性結(jié)果的泳道中的特異條帶回收并測序，其測序結(jié)果與序列5的同 源性高達(dá)98 %。
[0190]采用傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)法鑒定上述50份樣本，結(jié)果與本發(fā)明建立的方法的結(jié)果 完全一致。
【主權(quán)項】
1. 引物組合，由引物對I和引物對II組成； 所述引物對I由引物ChPV-F和引物ChPV-R組成； 所述引物ChPV-F為如下(a 1)或(a2); (al)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子； (a2)將序列1經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同 功能的DNA分子； 所述引物ChPV-R為如下(a3)或(a4); (a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子； (a4)將序列2經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同 功能的DNA分子； 所述引物對Π 由引物ARV-F和引物ARV-R組成； 所述引物ARV-F為如下(bl)或(b2); (bl)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子； (b2)將序列3經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同 功能的DNA分子； 所述引物ARV-R為如下(b3)或(b4); (b3)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子； (b4)將序列4經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同 功能的DNA分子。2. 權(quán)利要求1所述引物組合的應(yīng)用，為如下(cl)至(c6)中的任意一種： (cl)鑒別雞細(xì)小病毒和禽呼腸孤病毒； (c2)制備用于鑒別雞細(xì)小病毒和禽呼腸孤病毒的試劑盒； (c3)鑒定待測病毒是否為雞細(xì)小病毒或禽呼腸孤病毒； (c4)制備用于鑒定待測病毒是否為雞細(xì)小病毒或禽呼腸孤病毒的試劑盒； (c5)鑒定待測樣本是否感染了雞細(xì)小病毒和/或禽呼腸孤病毒； (c6)制備用于鑒定待測樣本是否感染了雞細(xì)小病毒和/或禽呼腸孤病毒的試劑盒。3. 含有權(quán)利要求1所述引物組合的試劑盒；所述試劑盒的用途為如下（dl)或（d2)或 (d3)： (dl)鑒別雞細(xì)小病毒和禽呼腸孤病毒； (d2)鑒定待測病毒是否為雞細(xì)小病毒或禽呼腸孤病毒； (d3)鑒定待測樣本是否感染了雞細(xì)小病毒和/或禽呼腸孤病毒。4. 權(quán)利要求3所述試劑盒的制備方法，包括將各條引物單獨包裝的步驟。5. -種鑒別待測病毒為雞細(xì)小病毒還是禽呼腸孤病毒的方法，包括如下步驟： (1) 將待測病毒的基因組DNA和所述待測病毒的cDNA混合，得到混合樣本； (2) 以步驟（1)得到的混合樣本為模板，采用權(quán)利要求1所述引物組合進(jìn)行PCR擴增，如 果采用所述引物對I可以實現(xiàn)對所述模板的特異性擴增、待測病毒為雞細(xì)小病毒，如果采用 所述引物對II可以實現(xiàn)對所述模板的特異性擴增、待測病毒為禽呼腸孤病毒。6. -種鑒定待測病毒是否為雞細(xì)小病毒或禽呼腸孤病毒的方法，包括如下步驟： (1)將待測病毒的基因組DNA和所述待測病毒的cDNA混合，得到混合樣本； (2)以步驟（1)得到的混合樣本為模板，采用權(quán)利要求1所述引物組合進(jìn)行PCR擴增，如 果采用所述引物對I可以實現(xiàn)對所述模板的特異性擴增、待測病毒為或候選為雞細(xì)小病毒， 如果采用所述引物對II可以實現(xiàn)對所述模板的特異性擴增、待測病毒為或候選為禽呼腸孤 病毒，如果采用所述引物對I不能實現(xiàn)對所述模板的特異性擴增且采用所述引物對II不能 實現(xiàn)對所述模板的特異性擴增、待測病毒為或候選為非雞細(xì)小病毒且非禽呼腸孤病毒的病 毒。7. -種鑒定待測樣本是否感染雞細(xì)小病毒和/或禽呼腸孤病毒的方法，包括如下步驟： (1) 將待測樣本的總DNA和所述待測樣本的cDNA混合，得到混合樣本； (2) 以步驟（1)得到的混合樣本為模板，采用權(quán)利要求1所述引物組合進(jìn)行PCR擴增，如 果采用所述引物對I可以實現(xiàn)對所述模板的特異性擴增、待測樣本感染或疑似感染雞細(xì)小 病毒，如果采用所述引物對II可以實現(xiàn)對所述模板的特異性擴增、待測樣本感染或疑似感 染禽呼腸孤病毒，如果采用所述引物對I可以實現(xiàn)對所述模板的特異性擴增且采用所述引 物對II可以實現(xiàn)對所述模板的特異性擴增、待測樣本感染或疑似感染雞細(xì)小病毒和禽呼腸 孤病毒;如果采用所述引物對I不能實現(xiàn)對所述模板的特異性擴增且如果采用所述引物對 II不能實現(xiàn)對所述模板的特異性擴增、待測樣本疑似未感染雞細(xì)小病毒且疑似未感染禽呼 腸孤病毒。8. 引物對I或引物對II; 所述引物對I由引物ChPV-F和引物ChPV-R組成； 所述引物ChPV-F為如下(a 1)或(a2); (al)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子； (a2)將序列1經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同 功能的DNA分子； 所述引物ChPV-R為如下(a3)或(a4); (a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子； (a4)將序列2經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同 功能的DNA分子； 所述引物對Π 由引物ARV-F和引物ARV-R組成； 所述引物ARV-F為如下(bl)或(b2); (bl)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子； (b2)將序列3經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同 功能的DNA分子； 所述引物ARV-R為如下(b3)或(b4); (b3)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子； (b4)將序列4經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同 功能的DNA分子。9. 權(quán)利要求8所述引物對I在制備試劑盒甲中的應(yīng)用，或，所述引物對II在制備試劑盒 乙中的應(yīng)用； 所述試劑盒甲的用途為如下(el)或(e2): (el)鑒定待測病毒是否為雞細(xì)小病毒； (e2)鑒定待測樣本是否感染了雞細(xì)小病毒； 所述試劑盒乙的用途為如下(e3)或(e4): (e3)鑒定待測病毒是否為禽呼腸孤病毒； (e4)鑒定待測樣本是否感染了禽呼腸孤病毒。10.含有權(quán)利要求8所述引物對I的試劑盒甲，或，含有權(quán)利要求8所述引物對II的試劑 盒乙； 所述試劑盒甲的用途為如下(el)或(e2): (el)鑒定待測病毒是否為雞細(xì)小病毒； (e2)鑒定待測樣本是否感染了雞細(xì)小病毒； 所述試劑盒乙的用途為如下(e3)或(e4): (e3)鑒定待測病毒是否為禽呼腸孤病毒； (e4)鑒定待測樣本是否感染了禽呼腸孤病毒。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒定雞細(xì)小病毒和禽呼腸孤病毒的引物組合及其應(yīng)用。本發(fā)明的引物組合由引物對I和引物對II組成。引物對I由引物ChPV-F和ChPV-R組成，分別如序列表1、2所示。引物對II由引物ARV-F和ARV-R組成，分別如序列表3、4所示。本發(fā)明還保護(hù)所述引物組合在鑒別雞細(xì)小病毒和禽呼腸孤病毒中的應(yīng)用、鑒定待測病毒是否為雞細(xì)小病毒或禽呼腸孤病毒中的應(yīng)用、鑒定待測樣本是否感染了雞細(xì)小病毒和/或禽呼腸孤病毒中的應(yīng)用。本發(fā)明建立的二重PCR可用于快速檢測雞細(xì)小病毒和禽呼腸孤病毒的混合感染，適于大批量檢測，既可節(jié)約成本和節(jié)省時間，又能減少污染，具有很高的實用價值。
【IPC分類】C12R1/93, C12Q1/70, C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105567877
【申請?zhí)枴緾N201610132391
【發(fā)明人】謝芝勛, 奉彬, 鄧顯文, 張艷芳, 黃嬌玲, 王盛, 范晴, 謝志勤, 黃莉, 謝麗基, 曾婷婷, 羅思思, 劉加波
【申請人】廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年3月9日