專利名稱：一種呼腸孤病毒疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種病毒疫苗及制備方法，具體的說，是一種呼腸孤病毒及疫苗的制備方法，屬醫(yī)用制品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
禽呼腸孤病毒(Avianreovirus，ARV)是雞病毒性關(guān)節(jié)炎和腱鞘炎的主要病原之一，屬呼腸孤病毒科，呼腸孤病毒屬的一個成員。自Fahey和Grawly(1954)首次從患慢性呼吸道病的雞呼吸道分離到(ARV)以來，許多ARV分離株相繼被報道。隨著研究的深入開展，ARV與其它疾病的關(guān)系也為人們所關(guān)注。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)除病毒性關(guān)節(jié)炎和腱鞘炎外，ARV在呼吸道病、腸道病、心肝病損、藍(lán)翅病、肉雞矮小綜合癥、暫時性消化系統(tǒng)紊亂等疾病的發(fā)生上起某種程度的作用，從患這些疾病的雞體內(nèi)均能分離到ARV。ARV在世界范圍內(nèi)存在，廣泛流行于雞、火雞中，其它禽類感染ARVS也有報道。經(jīng)濟(jì)上的損失常是由于關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎造成廢棄率高和生長抑制，飼料轉(zhuǎn)化率低。隨著養(yǎng)禽業(yè)的蓬勃發(fā)展，ARV的影響越來越大，其引起的疾病發(fā)病率上升，復(fù)雜性增大。目前，控制禽群ARV發(fā)病的主要手段是使用減毒活疫苗或滅活全病毒疫苗通過免疫接種來控制典型的雞呼腸孤病毒感染。但由于該病毒為RNA病毒，有多個分段，在商品禽群中普遍存在，不同毒株間在抗原結(jié)構(gòu)、致病性、細(xì)胞培養(yǎng)特性、對胰蛋白酶敏感性以及宿主特異性上存在一定的差異。在遺傳進(jìn)化時，容易發(fā)生變異，不同區(qū)域的兩種病毒之間的差異更大。使用國外疫苗對于本土該病毒的預(yù)防和治療并不是非常理想，且價格很高。因此，針對我國特定存在的該病毒的血清型，開發(fā)生產(chǎn)前者所沒有的特異優(yōu)勢的疫苗，無疑可對控制本土禽群ARV發(fā)病起到積極的作用，且能夠產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種免疫產(chǎn)生迅速、持續(xù)時間長、免疫力強(qiáng)、針對本土禽群病毒性關(guān)節(jié)炎疾病的呼腸孤病毒疫苗及制備方法。
本發(fā)明所稱問題是由以下技術(shù)方案解決的
一種呼腸孤病毒，所述病毒為禽呼腸孤病毒(Avianreovirus，簡稱ARV)，毒株為RS13株，保藏號為CGMCC No.1713，于2006年5月16日保藏在中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心。
上述呼腸孤病毒，所述病毒無囊膜，呈20面體對稱，基因組由10個雙鏈RNA分段構(gòu)成，能耐受60℃8～10h，對乙醚不敏感，對氯仿輕度敏感，對堿敏感，3％氫氧化鈉作用1h，即可殺死病毒，無血凝特性。
一種呼腸孤病毒疫苗制備方法，它包括如下步驟a.分離病毒在患有病毒性關(guān)節(jié)炎病的病雞的糞便、泄殖腔拭子、氣管、腱鞘等部位分離病毒，用PBS緩沖液洗滌，過濾，反復(fù)凍融3～5次，釋放出病毒，將病毒在雞胚或雞胚成纖維細(xì)胞上中增殖傳代，使病毒效價達(dá)到109.5ELD50/0.2ml，作為生產(chǎn)用病毒種子；b.血清檢測用S1133陽性血清中和后，接種10日齡SPF雞胚或雞胚成纖維細(xì)胞中，不出現(xiàn)相應(yīng)的雞胚體和內(nèi)臟病變或相應(yīng)的細(xì)胞病變，證實該病毒的血清型與S1133相同；c.病毒繁殖將毒種通過雞胚或雞胚成纖維細(xì)胞繁殖傳代，病毒效價檢測達(dá)到109.5ELD50/0.2ml；d.混合凍干將病毒稀釋到106.5ELD50/ml，按照1∶1.2比例加入5％奶粉保護(hù)劑和病毒液體，凍干，制成呼腸孤病毒凍干活疫苗。
上述呼腸孤病毒疫苗制備方法，所述病毒繁殖傳代50～70代。
本發(fā)明從本土禽群感染ARV的病雞中分離出呼腸孤病毒，將分離得到的呼腸孤病毒在雞胚上傳代，制成凍干活疫苗，將其應(yīng)用于免疫雞只，1周內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，2周內(nèi)即可產(chǎn)生堅強(qiáng)的免疫力，免疫期為2～2.5個月，免疫期間攻毒保護(hù)率為94.8％～98.8％，明顯高于國外進(jìn)口疫苗保護(hù)率。本疫苗對我國該病毒的預(yù)防和治療是更為理想的選擇，適應(yīng)于國內(nèi)各養(yǎng)禽場，安全可靠，具有很大實際應(yīng)用價值，可彌補(bǔ)目前國內(nèi)在呼腸孤病毒感染方面疫苗空缺的缺陷，為該病的防治提供一種可以切實可行的疫苗及制備方法。
具體實施例方式
本發(fā)明疫苗針對本土呼腸孤病毒RS13株，該病毒無囊膜，呈20面體對稱，基因組由10個雙鏈RNA分段構(gòu)成，對熱有抵抗力，能耐受60℃8～10h，對乙醚不敏感，對氯仿輕度敏感，對堿敏感，3％氫氧化鈉作用1h，即可殺死病毒，該病毒無血凝特性。
該病毒容易在雞胚中生長，初次分離時可選用卵黃囊接種，一般在接種后3～5天雞胚死亡，雞胚因廣泛皮下出血而呈紫色。絨毛尿囊膜接種時，通常7～8天死亡，絨毛尿囊膜有稍隆起的、分散的白色病灶，雞胚輕度發(fā)育不良。
該病毒也可在雞胚成纖維細(xì)胞上繁殖，但需要適應(yīng)，即吸附細(xì)胞1h，常形成合胞體，最早出現(xiàn)于24～48小時，隨后單層細(xì)胞變性后出現(xiàn)空洞，巨細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中。
以下給出制備疫苗的實施例a.分離病毒從病雞的腱鞘中分離病毒，將病雞的腱鞘(若為其它病雞，則在其它病變部位提取)攪碎，使用5ml PBS(磷酸鹽緩沖液)稀釋，稀釋液中加入青鏈霉素，以消除其他雜菌污染。反復(fù)凍融5次，將病毒從組織中釋放出來。3000轉(zhuǎn)/min離心20分鐘，去除組織塊。上清液中含有病毒，即為分離到的病毒。將此病毒在雞胚上連續(xù)繁殖70代，檢測病毒效價，達(dá)到109.5ELD50/0.2ml，取第70代收獲病毒，作為生產(chǎn)用病毒種子。
呼腸孤病毒的效價檢測，其檢測方法為TCID50(細(xì)胞半數(shù)感染量)和ELD50(雞胚半數(shù)致死量)。雞胚傳代病毒在10-8和10-9出現(xiàn)病變孔分別為5孔和2孔，即TCID50＝10-8.9/0.1ml，雞胚傳代病毒在10-9梯度全部死亡，即ELD50＝10-9.5/0.2ml。
b.血清檢測用S1133陽性血清中和后，接種10日齡SPF(無特定病原微生物)雞胚，不出現(xiàn)相應(yīng)的雞胚體和內(nèi)臟病變，證實該病毒的血清型與S1133相同。
c.病毒繁殖將毒種通過雞胚繁殖，取發(fā)育良好的SPF雞胚20枚，0.2ml/枚注射，在雞胚大血管附近抽出人工氣室，將用PBS緩沖液稀釋到1∶10000(重量比例，即g/ml)的病毒注入到人工氣室中，37.5℃～38.5℃條件培養(yǎng)，收獲24小時以后死亡雞胚和有病變的活雞胚的絨毛尿囊膜，1∶10比例稀釋，-20℃凍存?zhèn)溆谩＿B續(xù)傳代。
在本發(fā)明進(jìn)行的試驗中，當(dāng)病毒經(jīng)連續(xù)傳代70代，毒力明顯比剛分離時減弱。將傳代病毒從第50代到70代連續(xù)20代的病毒進(jìn)行效價檢測，均可達(dá)到很高的數(shù)值，即109.5ELD50/0.2ml左右，說明該病毒已經(jīng)適應(yīng)在雞胚中增殖，且非常穩(wěn)定。從毒力減弱、病毒增殖穩(wěn)定、安全、有效，證明該病毒適合在生產(chǎn)上大規(guī)模應(yīng)用。同時，臨床試驗的研究結(jié)果也與此結(jié)論一致。
d.混合凍干將病毒稀釋到106.5ELD50/ml，按照1∶1.2比例加入5％奶粉保護(hù)劑和病毒液體，凍干，制成呼腸孤病毒凍干活疫苗。
所制備的凍干活疫苗，每西林瓶中含病毒量106.5ELD50/1000羽份。
安檢取使用劑量的10倍量即104.5ELD50/0.2ml足墊免疫1日齡SPF雞，觀察2周，足墊接種部位無炎癥反應(yīng)等情況出現(xiàn)。
效檢取使用劑量即103.5ELD50/0.2ml頸背部皮下免疫1日齡雞，2周后，用強(qiáng)毒攻擊，保護(hù)率達(dá)到100％。凍干疫苗免疫雞只1周內(nèi)，即可產(chǎn)生堅強(qiáng)的免疫力，免疫期為2.5個月，免疫期間攻毒保護(hù)率為94.8％～98.3％。
真空度檢測隨機(jī)取10瓶凍干疫苗，用高頻火花真空測定器測定該樣品的真空度，疫苗瓶中均出現(xiàn)紫色輝光，說明該凍干疫苗的真空度合格。
剩余水分測定采用真空烘干法測定，具體操作參閱《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(2000年版)438頁進(jìn)行。各隨機(jī)抽樣檢測凍干疫苗樣品的剩余水分均低于4.0％，說明該凍干疫苗剩余水分合格，達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種呼腸孤病毒，其特征在于所述病毒為禽呼腸孤病毒，Avianreovirus，簡稱ARV，毒株為RS13株，保藏號為CGMCC No.1713，于2006年5月16日保藏在中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呼腸孤病毒疫苗，其特征在于所述病毒無囊膜，呈20面體對稱，基因組由10個雙鏈RNA分段構(gòu)成，能耐受60℃8～10h，對乙醚不敏感，對氯仿輕度敏感，對堿敏感，3％氫氧化鈉作用1h，即可殺死病毒，無血凝特性。
3.一種呼腸孤病毒疫苗制備方法，其特征在于，它包括如下步驟a.分離病毒在患有病毒性關(guān)節(jié)炎病的病雞的糞便、泄殖腔拭子、氣管、腱鞘等部位分離病毒，用PBS緩沖液洗滌，過濾，反復(fù)凍融3～5次，釋放出病毒，將病毒在雞胚或雞胚成纖維細(xì)胞上中增殖傳代，檢測其病毒效價達(dá)到109.5ELD50/0.2ml，作為生產(chǎn)用病毒種子；b.血清檢測用S1133陽性血清中和后，接種10日齡SPF雞胚或雞胚成纖維細(xì)胞中，不出現(xiàn)相應(yīng)的雞胚體和內(nèi)臟病變或相應(yīng)的細(xì)胞病變，證實該病毒的血清型與S1133相同；c.病毒繁殖將毒種通過雞胚或雞胚成纖維細(xì)胞繁殖傳代，病毒效價檢測達(dá)到109.5ELD50/0.2ml；d.混合凍干將病毒稀釋到106.5ELD50/ml，按照1∶1.2比例加入5％奶粉保護(hù)劑和病毒液體，凍干，制成呼腸孤病毒凍干活疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的呼腸孤病毒疫苗制備方法，其特征在于所述所述病毒繁殖傳代50～70代。
全文摘要
一種呼腸孤病毒疫苗及制備方法，屬醫(yī)用制品技術(shù)領(lǐng)域，用于解決本土禽群呼腸孤病毒感染的疫苗問題。所分離的呼腸孤病毒保藏號為CGMCC No.1713，于2006年5月16日保藏在中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心。該疫苗通過從病雞器官中分離病毒、血清檢測、病毒繁殖傳代、凍干等步驟制備而成。本發(fā)明從本土禽群感染ARV的病雞中分離出病毒并制成疫苗，將其應(yīng)用于免疫雞只，1周內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，2周內(nèi)即可產(chǎn)生堅強(qiáng)的免疫力，免疫期為2～2.5個月，免疫期間攻毒保護(hù)率為94.8％～98.8％，明顯高于國外進(jìn)口疫苗保護(hù)率，可彌補(bǔ)目前國內(nèi)在呼腸孤病毒感染方面疫苗空缺的缺陷。
文檔編號A61P31/00GK1884497SQ20061001279
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月6日
發(fā)明者厲從志, 馮秀麗 申請人:瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司