檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒的qRT-PCR及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及PCR檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及用于檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒的靶序列、 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR引物和探針，本發(fā)明還涉及利用該靶序列進(jìn)行水稻黑條矮縮病毒檢測(cè) 的方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米粗縮病(Maize rough dwarf disease,MRDD)是世界性的玉米病毒病害，也是 危害玉米最嚴(yán)重的病害之一。玉米粗縮病的典型癥狀是葉片變寬變短，葉夾角變小，葉色深 綠，葉鞘及苞葉出現(xiàn)蠟白色突起，有明顯的粗糙感;整個(gè)植株節(jié)間變粗、縮短，植株矮小、發(fā) 育不良或畸形;根系不發(fā)達(dá)，不能抽雄或無花粉、雌穗變小或不能抽穗結(jié)實(shí)，發(fā)病嚴(yán)重的植 株可能提前枯死，導(dǎo)致絕產(chǎn)。
[0003] 玉米粗縮病病原主要為呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟(jì)病毒屬(Fiji virus)的水 稻黑條矮縮病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)，南方水稻黑條矮縮病毒 (Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)，玉米粗縮病毒（Maize rough dwarf virus，MRDV)和馬德里約柯托病毒(Mai de Rio Cuarto virus，MRCV)。在亞洲導(dǎo)致 玉米粗縮病的病原是RBSDV或SRBSDV;在歐洲，病原是MRDV;在南美洲，病原是MRCV。以上病 毒是以灰飛虱（Laodelphax striatellus，SBPH)或白背飛虱（Sogatella furcifera)為介 體持久性傳播的病毒，同時(shí)也是水稻黑條矮縮病(Rice black-streaked dwarf disease, RBSDD)和小麥綠矮病(Wheat green dwarf disease，WGDD)等病害的主要病原。在我國(guó)黃淮 海等地區(qū)導(dǎo)致MRDD的主要病原是RBSDV ABSDV完整病毒粒子為等軸的20面球體，直徑約為 70-80nm，其基因組由10條線性雙鏈RNA(dsRNA)組成，10條雙鏈dsRNA按在PAGE電泳中迀移 率由慢到快分別命名為S1-S10,大小從4.5kb到1.8kb。
[0004] 目前，常用的檢測(cè)植物病毒的方法主要包含:分子方法檢測(cè)，電鏡觀察，血清學(xué)檢 測(cè)以及生物學(xué)接種試驗(yàn)等。但以上檢測(cè)方法只能在RBSDV侵染植物的后期檢測(cè)到，且只能半 定量的確定有或者無，不能準(zhǔn)確定量RBSDV的拷貝數(shù)。人工接種實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RBSDV的最佳接種 時(shí)間是在玉米的三葉期，但常規(guī)檢測(cè)方法需至少在人工接種25天以上才能檢測(cè)到RBSDV，使 得發(fā)病初期機(jī)制及RBSDV侵染玉米的基礎(chǔ)研究等受到限制。
[0005] 國(guó)內(nèi)外已有應(yīng)用TaqMan探針熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)病毒拷貝數(shù)的研究。TaqMan探 針法是高度特異的定量PCR技術(shù)，其核心是利用Taq酶的3 ' -5 '外切核酸酶活性，切斷探針， 產(chǎn)生熒光信號(hào)。由于探針與模板是特異性結(jié)合，所以熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量。 TaqMan探針法的定量PCR反應(yīng)體系包含一對(duì)PCR引物和一條探針。探針只與模板特異性的結(jié) 合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告基因（Reporter，R)，如FAM、VIC等， 3 '端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)（Quencher，Q)，如TAMRA等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射 的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，一起檢測(cè)不到信號(hào)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在延伸過程中遇到 與模板結(jié)合的探針，其3'_5'外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)原來淬滅基團(tuán)，其 能量不能夠被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)。每經(jīng)過一個(gè)PCR循環(huán)，熒光信號(hào)也和目的片段一樣，有 一個(gè)同步指數(shù)增長(zhǎng)的過程，信號(hào)的強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。Log(起始濃度)與循環(huán) 數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得到改擴(kuò)增反應(yīng)存在的 線性關(guān)系，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量，即拷貝數(shù)。相對(duì)于SYBR GreenI的方法，TaqMan方法具有特異性高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。此檢測(cè)方法極大地提高了檢測(cè) 的靈敏度，且精確性好，甚至可檢測(cè)單拷貝情況，且檢測(cè)簡(jiǎn)便，快速，可重復(fù)性高。為了提高 水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)早期感染檢測(cè)的準(zhǔn)確性， 有必要建立靈敏度更好、特異性更好的檢測(cè)方法來檢測(cè)RBSDV。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供用于檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒的特異、靈敏、快速、簡(jiǎn)便的方 法及其應(yīng)用。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過對(duì)多年多點(diǎn)水稻黑條矮縮病毒基因核苷酸區(qū)段進(jìn)行 測(cè)序和比對(duì)，確定了保守區(qū)S5區(qū)段序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，該靶序列是檢 測(cè)水稻黑條矮縮病毒的遺傳標(biāo)記物。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，該序列的特異性區(qū)段 也可以作為檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒的遺傳標(biāo)記物。本發(fā)明根據(jù)該保守序列，通過反復(fù)對(duì)比、 篩選，設(shè)計(jì)了用于檢測(cè)該遺傳標(biāo)志物的特異性引物對(duì)和探針。
[0008] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選的特異性引物對(duì)的序列為：
[0009] S5-F:ATCAGACGAAAATATTGGACGTA(SEQ ID N0.1)(S5中位置：1989-2011)
[0010] S5-R:AATCACGTATTGAGTAACTGAACC(SEQ ID N0.2)(S5中位置：2077-2100)
[0011] Taqman熒光探針序列為：
[0012] S5-P:AAACCAAGCAGCAAAACACGTCA(SEQ ID NO.3)(S5中位置：2020-2042)
[0013] 5 '端用FAM標(biāo)記，3 '端用TAMARA標(biāo)記。
[0014] 本發(fā)明提供了上述特異性引物對(duì)和Taqma熒光探針在檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒中的 應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明提供了上述特異性引物對(duì)和Taqma熒光探針在制備檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒 試劑盒中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明提供了上述特異性引物對(duì)和Taqman熒光探針在防治作物病蟲害中的應(yīng)用。 在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述作物為玉米。
[0017]進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了含有上述特異性引物對(duì)和Taqman熒光探針的試劑盒。
[0018] 本發(fā)明提供的試劑盒，還包括熒光定量反應(yīng)液，陰性模板和陽性模板，所述陰性模 板為無菌水，所述陽性模板為水稻黑條矮縮病毒基因組RNA。
[0019] 含有上述特異性引物對(duì)和熒光探針的試劑盒可通過Taqman法熒光定量PCR實(shí)現(xiàn)對(duì) 水稻黑條矮縮病毒的特異、快速檢測(cè)。
[0020] 具體地，該試劑盒基于實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，對(duì)待測(cè)樣本提取基因組RNA后以 其為模板，利用SEQ ID NO. 1、SEQ ID N0.2所示的特異性引物對(duì)和SEQ ID N0.3所示的熒光 探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，檢測(cè)待測(cè)樣本中的水稻黑條矮縮病毒。
[0021] 更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了上述試劑盒在防治作物病蟲害中的應(yīng)用。在本發(fā)明的 實(shí)施例中，所述作物為玉米。
[0022] 本發(fā)明提供一種檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒的方法，對(duì)待測(cè)樣本提取基因組RNA后以 其cDNA為模板，利用SEQIDN0.1、SEQIDN0.2所示的特異性引物對(duì)和SEQIDN0.3所示的 熒光探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，檢測(cè)待測(cè)樣本中的水稻黑條矮縮病毒。
[0023]所述實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的反應(yīng)體系為：
[0024]
[0025]反應(yīng)條件為：
[0026]預(yù)變性 1 個(gè)循環(huán) 95°C15min;95°C30sec，60°C30sec，共 40 個(gè)循環(huán)。
[0027]所述待測(cè)樣本為玉米、水稻或小麥。
[0028] 本發(fā)明提供的上述檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒的方法在防治作物病蟲害中的應(yīng)用也 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0029] 基于本法的上述檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒的方法，根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果，并根據(jù) Ct值計(jì)算樣品中病毒含量。在對(duì)照有效擴(kuò)增的情況下，樣品檢測(cè)結(jié)果可信，否則試驗(yàn)需要重 復(fù);在檢測(cè)中兩種對(duì)照為有效擴(kuò)增時(shí)，樣本結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0030] Ct值小于36的標(biāo)本為陽性結(jié)果;Ct值大于36或無 Ct值的標(biāo)本為陰性結(jié)果；
[0031] Ct值在35-36之間的標(biāo)本需要重復(fù)，重復(fù)試驗(yàn)如Ct值依然低于35判定為陽性擴(kuò)增， 超過35或無 Ct值判定為陰性擴(kuò)增。
[0032]采用本發(fā)明的特異性引物對(duì)和Taqman熒光探針運(yùn)用Taqman熒光定量RT-PCR方法 檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒，檢測(cè)靈敏度能達(dá)到1個(gè)拷貝/μι。
[0033]本發(fā)明根據(jù)水稻黑條矮縮病毒基因組保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物和探針，可以通過qRT-PCR進(jìn)行水稻黑條矮縮病毒基因組的定量檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度、特異性均優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)，并能 夠?qū)崿F(xiàn)早期檢測(cè)作物感染水稻黑條矮縮病毒的情況。本發(fā)明通過水稻黑條矮縮病毒基因組 S5區(qū)段標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以進(jìn)行水稻黑條矮縮病毒基因拷貝數(shù)的定量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié) 果精確。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在人工接種RBSDV 3天后，采用本發(fā)明的qRT-PCR就能有效檢測(cè)到玉米 感染了RBSDV，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法需要在人工接種25天后才能檢測(cè)到RBSDV的時(shí) 間，因此本發(fā)明方法極大的縮減了檢測(cè)成本提高了檢測(cè)效率，便于早期病株的篩選，可用于 作物此類病蟲害的防治，具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0034]圖1為本發(fā)明方法檢測(cè)RBSDV的擴(kuò)增曲線圖。圖中曲線1-3為B73接種RBSDV 20d的 熒光定量檢測(cè)曲線三次重復(fù);4-6為B73接種RBSDV 6d的熒光定量檢測(cè)曲線三次重復(fù);7-9為 B73接種RBSDV 3d的熒光定量檢測(cè)曲線三次重復(fù)；10-12為B73接種RBSDV 1.5d的熒光定量 檢測(cè)曲線三次重復(fù)。
[0035]圖2為本發(fā)明方法檢測(cè)RBSDV的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0036] 圖3為本發(fā)明方法退火溫度優(yōu)化圖，圖中1-6分別為:56.7°C; 60.1°C; 58.1°C; 55.7 °C;62.3°C;64.3°C。
[0037] 圖4為本發(fā)明方法檢測(cè)玉米粗縮病和玉米矮花葉病擴(kuò)增曲線，圖中1-3檢測(cè)玉米粗 縮病;4-6檢測(cè)玉米矮花葉病。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。
[0039]若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0040] 實(shí)施例1水稻黑條矮縮病毒保守序列的選擇與特異性引物的設(shè)計(jì)
[0041] 通過多年多點(diǎn)的水稻黑條矮縮病毒基因核苷酸序列測(cè)序和比對(duì)，確定保守區(qū)S5區(qū) 段序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，該靶序列是檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒的遺傳標(biāo)記 物。
[0042] 本發(fā)明于2012-2013年在北京（I)、河北唐山（II)和保定（III)、山東濟(jì)南（IV)和濟(jì) 寧(V)、河南鄭州(VI)和信陽（IX)、江蘇鹽城(VII)和南京(VIII)采集表現(xiàn)典型癥狀的玉米 粗縮病和水稻黑條矮縮病樣品共計(jì)21份（12頂-l、13M-l、13nM-l、13inM-l、13IIIR-l、 13IVM-1、13VM-1、13VM-2、13VM-3、13VR-1、13VR-2、13VR-3、13VM-1、13VM-2、13VIR-1、 13VHM-1、13VHM-2、13VHM-3、13VIHM-1、13VIIIR-1、13IXM-1)，采用26對(duì)RBSDV基因組 S1-S10特異性引物擴(kuò)增。結(jié)果顯示，RBSDV