-S5的保守區(qū)域最多。比對(duì)所有樣品的S5區(qū)段，確 定與其它樣品S5區(qū)段相似性較高的13ΙΠΜ-1樣品S5序列為保守區(qū)S5序列（SEQ ID N0.4)。
[0043] 根據(jù)S5保守序列，通過反復(fù)對(duì)比、篩選，設(shè)計(jì)了用于檢測(cè)該遺傳標(biāo)志物的特異性引 物對(duì)和探針。
[0044] 本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)遵循以下原則:避免引物自身或之間形成4個(gè)以上連續(xù)配對(duì)，無 環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)；18_24bp長;Tm值55-65°C，GC含量在40 %-60 %之間，兩個(gè)引物Tm值相差不超 過2°C;3'端不出現(xiàn)A，且不出現(xiàn)三個(gè)或三個(gè)以上連續(xù)相同堿基；引物后5個(gè)核苷酸不能有超 過2個(gè)G和C;擴(kuò)增片段長度在50-150bp最佳。
[0045]本發(fā)明探針設(shè)計(jì)遵循以下原則：盡量靠近上游引物；長度20_30bp;檢測(cè)折疊和二 級(jí)結(jié)構(gòu);Tm值65-70°C，GC含量40 % -70 %，5 '端無 G，C含量高于G;
[0046] 本發(fā)明通過篩選獲得的用于擴(kuò)增水稻黑條矮縮病毒各血清型特異性的保守靶序 列的特異性引物對(duì)的序列為：
[0047] S5-F:ATCAGACGAAAATATTGGACGTA(S5 中位置：1989-2019)
[0048] S5-R: AATCACGTATTGAGTAACTGAACC( S5 中位置：2077-2100)
[0049] Taqman熒光探針序列為：
[0050] S5-P: AAACCAAGCAGCAAAACACGTCA( S5 中位置：2020-2042)
[0051 ] 5 '端用FAM標(biāo)記，3 '端用TAMARA標(biāo)記。
[0052]針對(duì)目標(biāo)基因，本實(shí)施例還設(shè)計(jì)了另外2對(duì)引物和對(duì)應(yīng)的探針(見下方），但擴(kuò)增效 果均不如S5-F、S5-R、S5-P的檢測(cè)效果，因此本實(shí)施例選用上述引物和探針為檢測(cè)水稻黑條 矮縮病毒的最佳引物對(duì)和探針。
[0053] 針對(duì)目的基因保守序列另外設(shè)計(jì)的引物和探針：
[0054] S5_F_1 :CATCAGAAGAAATGTGTATGCCTT (第 2510-第2533)
[0055] S5-R-1:CCGAGATTTCTGAGTCGCAAC(第2637-第2657)
[0056] S5-P-1:GGCAGATTGGGAATTGACGATGA(第2551-第2573)
[0057] S5-F-2 :GCAGCAAAACACGTCAGT (第 2027-第 2044)
[0058] S5-R-2: AGCTGCTCCTTCATGCTT (第2140-第2157)
[0059] S5-P-2:TCAATACGTGATTCCAGAATGGCT(第2088-第2111)
[0060] 實(shí)施例2水稻黑條矮縮病毒的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立
[0061 ]以水稻黑條矮縮病毒總RNA反轉(zhuǎn)錄的c D NA為模板，以S 5 - 1 1 (序列： ACGCAAACCTTATTTCCGATTC;S5 中位置：1842-1864)和S5-12(序列： 6〇八1'(^六六66六6六0六0六6六六(：(：(：;55中位置 :3117-3139)引物進(jìn)行1?1'-?0財(cái)廣增，目的條帶切膠回 收，將其連接至pEASY-Blunt Cloning Kit克隆載體，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì) 胞DH5a，篩選、PCR鑒定陽性克隆，提取重組質(zhì)粒，測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果和目的片段完全一致 的即為重組質(zhì)粒。
[0062] 以S5-11和S5-12(表1)為引物擴(kuò)增重組質(zhì)粒，常規(guī)K0D-Plus_NE0(T0Y0B0)PCR體系 (50μ1)，擴(kuò)增條件：94°C5min，94°C30s，56°C30s，68°C30s，35循環(huán)，68°C12min，12°C保存，獲 得的目的片段純化后作為標(biāo)準(zhǔn)品。
[0063] 計(jì)算拷貝數(shù)，分別 101、102、103、104、105、10 6、107、108倍稀釋，采用35-?和35-1?引物 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線?？截悢?shù)(copies/μL)=濃度(g/μL) X 6 · 02 X 1023/轉(zhuǎn)錄物長度(bp)/340 〇
[0064] 表1 RNA標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增引物
[0065]
[0066] 以S5-11和S5-12為引物擴(kuò)增重組質(zhì)粒，獲得的目的片段純化后作為標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算 拷貝數(shù)，分別1〇1、1〇 2、1〇3、1〇4、1〇5、1〇6、1〇 7、1〇8倍稀釋，采用實(shí)施例1確定的最優(yōu)特異性引物 對(duì)S5-F和S5-R引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。
[0067] -般一條標(biāo)準(zhǔn)曲線取5-6個(gè)點(diǎn)，濃度范圍要能覆蓋樣品的濃度區(qū)間，以保證定量的 準(zhǔn)確性。一般一個(gè)點(diǎn)重復(fù)3-5次，對(duì)于常期穩(wěn)定使用的標(biāo)準(zhǔn)品可以適當(dāng)減少重復(fù)的次數(shù)。倍 比梯度稀釋方法：
[0068] ΙμL原液(標(biāo)準(zhǔn)品i )+9μ1稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii
[0069] ΙμL標(biāo)準(zhǔn)品i ?+9μ1稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品i i i
[0070] ΙμL標(biāo)準(zhǔn)品i i ?+9μ1稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv [0071 ] ΙμL標(biāo)準(zhǔn)品?ν+9μ1稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v
[0072] ΙμL標(biāo)準(zhǔn)品ν+9μ1稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品vi
[0073] 1μ 1標(biāo)準(zhǔn)品v ?+9μ 1稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v i i
[0074] ΙμL標(biāo)準(zhǔn)品ν?+9μ1稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品viii
[0075] 標(biāo)準(zhǔn)曲線拷貝數(shù)及Ct值詳見表2，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y = -4.06X+42.81。根據(jù)RBSDV-S5片段建立病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2 )，用于計(jì)算植株病毒拷貝數(shù)。
[0076] 表2拷貝數(shù)及Ct值對(duì)應(yīng)表
[0077]
[0078] TransZol? Up(Transgen Biotech)法提取單株玉米葉片總RNA，米用Fast Quant RT Kit(With gDNase) (Tiangen)試劑盒反轉(zhuǎn)錄。稀釋并調(diào)整各樣品cDNA濃度，濃度均為 lOOng/μΙ〇
[0079] 根據(jù)如下反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR:
[0080]
[0081 ]反應(yīng)條件為:預(yù)變性 95°C 15min; 95°C30sec，60°C30sec，共 40 個(gè)循環(huán)。
[0082] 采用Bio-Rad公司IQ5熒光定量PCR儀及Bio-Rad IQ5分析軟件進(jìn)行試驗(yàn)和數(shù)據(jù)分 析。
[0083] 對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，在55_65°C范圍內(nèi)對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。
[0084] 退火溫度優(yōu)化結(jié)果顯示（圖3)，退火溫度在60°C最合適。
[0085]實(shí)施例3水稻黑條矮縮病毒的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的特異性評(píng)價(jià) [0086]田間取玉米矮花葉病和玉米粗縮病病癥明顯的植株，提取葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄后米用 實(shí)施例2中的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示玉米矮花葉病病株均呈陰性，而玉米粗縮病病株均呈 陽性，如圖4所示。說明本發(fā)明實(shí)施例2建立的水稻黑條矮縮病毒的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢 測(cè)方法特異性良好，能夠特異性檢測(cè)玉米粗縮病病株的病原RBSDV。
[0087]實(shí)施例4本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)玉米中水稻黑條矮縮病毒
[0088]采用實(shí)施例2建立的水稻黑條矮縮病毒的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)經(jīng)人工接種了 RBSDV的玉米中的RBSDV感染量。
[0089]采用集團(tuán)網(wǎng)箱接種法在玉米三葉期進(jìn)行水稻黑條矮縮病毒的人工接種，分別在接 種后1.5(1、3(1、6(1、20(1單株取玉米葉片，同處理下未接種玉米葉片作為對(duì)照。樣品保存于-80 °C冰箱。
[0090] TransZol? Up(Transgen Biotech)法提取單株玉米葉片總RNA，米用Fast Quant RT Kit(With gDNase)(Tiangen)試劑盒反轉(zhuǎn)錄。
[0091] 針對(duì)人工接種后1.5(1、3(1、6(1、20(1的1?嫩樣品進(jìn)行擴(kuò)增，可以單株鑒定植株苗期的 帶毒情況，并確定RBSDV的RNA拷貝數(shù)。
[0092]利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分別對(duì)未接種、無毒灰飛虱接種和帶毒灰飛虱接種B73 的0(1、1.5(1、3(1、6(1、20(1樣品按編號(hào)檢測(cè)攜帶1^30￥情況。結(jié)果顯示，接種0(1、未接種和無毒灰 飛虱接種的所有時(shí)間樣品均檢測(cè)不到病毒（圖1);帶毒灰飛虱接種1.5d的B73病毒含量很低 或檢測(cè)不到，接種的B73在3d、6d、20d的B73均檢測(cè)到病毒，且三次重復(fù)結(jié)果一致(圖1)。 [00 93]標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示所有RNA標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值基本在一條直線上，沒有任何一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品出 現(xiàn)大的偏差，根據(jù)計(jì)算公式Y(jié) = -4.06X+42.81，可以計(jì)算獲得未知玉米樣品中RBSDV RNA的 準(zhǔn)確拷貝數(shù)。
[0094]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒的遺傳標(biāo)記物，其具有SEQIDNO.4所示的序列或 其特異性區(qū)段。2. 權(quán)利要求1所述的遺傳標(biāo)記物在檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒中的應(yīng)用。3. 用于檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒的特異性引物對(duì)，其上下游引物的核苷酸序列分別如 SEQIDN0.1、SEQIDN0.2**。4. 與權(quán)利要求3所述特異性引物對(duì)配合使用的熒光探針，其核苷酸序列如SEQIDNO.3 所示。5. 權(quán)利要求3所述的特異性引物對(duì)和/或權(quán)利要求4所述的熒光探針在檢測(cè)水稻黑條矮 縮病毒中的應(yīng)用。6. 含有權(quán)利要求3所述的特異性引物對(duì)和權(quán)利要求4所述的熒光探針的試劑盒。7. -種檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒的方法，其特征在于，對(duì)待測(cè)樣本提取基因組RNA后以其 為模板，利用SEQIDNO. 1、SEQIDNO.2所示的特異性引物對(duì)和SEQIDNO.3所示的熒光探 針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，檢測(cè)待測(cè)樣本中的水稻黑條矮縮病毒。8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的反應(yīng)條件為預(yù)變 性 95°C15min; 95°C30sec，60°C30sec，共 40 個(gè)循環(huán)。9. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣本為玉米、水稻或小麥。10. 權(quán)利要求3所述的特異性引物對(duì)和權(quán)利要求4所述的熒光探針以及權(quán)利要求6所述 的試劑盒、權(quán)利要求7-9任一所述的方法在防治作物病蟲害中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒的qRT-PCR及其應(yīng)用，屬于PCR檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首先通過對(duì)水稻黑條矮縮病毒基因組序列的比對(duì)，確定了保守區(qū)段，并以該保守區(qū)為靶序列設(shè)計(jì)了用于檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒的引物對(duì)和探針，其核苷酸序列分別如SEQ？ID？NO.1，SEQ？ID？NO.2，SEQ？ID？NO.3所示，本發(fā)明還提供了對(duì)水稻黑條矮縮病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)的方法和檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的檢測(cè)方法具有檢測(cè)準(zhǔn)確，靈敏度高、特異性強(qiáng)，簡便快速的優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)作物早期感染水稻黑條矮縮病毒的定量檢測(cè)，且成本低廉，具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11, C12Q1/70
【公開號(hào)】CN105441437
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510767186
【發(fā)明人】李新海, 周羽, 翁建峰, 郝轉(zhuǎn)芳, 李明順, 張德貴, 雍洪軍, 張世煌
【申請(qǐng)人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年3月30日
【申請(qǐng)日】2015年11月11日