為 0 · 4pmol/iiL〇
[0120] 反應體系VI:ChPV-F和ChPV-R的濃度均為0.48?111〇1/^41^4和八1^-1?的濃度均為 0.32pmol/yL〇
[0121] 反應體系VII:ChPV-F和ChPV-R的濃度均為0.56口111〇1/^1^41^-?和厶1^-1?的濃度均 為0.24pmolAiL。
[0122] 反應體系VIII:ChPV-F和ChPV-R的濃度均為0.64口111〇1/^41^4和41^-1?的濃度均 為0·16pmol/yL。
[0123] 反應體系IX: ChPV-F和ChPV-R的濃度均為0.72pmolAiL，ARV-F和ARV-R的濃度均為 0.08pmol/yL〇
[0124] 二重 PCR 的反應程序：95°C 預變性 51^11;95°(：1111丨11、56.1°(：1111丨11、72°(：1111丨11，進行35 個循環(huán);72°C延伸lOmin。
[0125] 將二重PCR的擴增產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳并拍照。
[0126] 設置用等體積水代替混合樣本的陰性對照；陰性對照相應的反應體系中，ChPV-F 和 ChPV-R 的濃度均為 0.4pmolAiL，ARV-F 和 ARV-R 的濃度均為 0.4pmolAiL。
[0127] 結果見圖1。圖1中，泳道1-9依次對應采用反應體系I-IX時得到的二重PCR的擴增 產物，Μ對應100bp DNA Marker，N對應陰性對照的二重PCR的擴增產物。綜合考慮引物對I和 引物對Π 的擴增效果，最佳引物濃度組合為:ChPV-F和ChPV-R的濃度均為0.4pmolAiL，ARV-F和ARV-R的濃度均為0.4pmolAiL。
[0128] 三、退火溫度的優(yōu)化
[0129] 取步驟一得到的混合樣本，作為模板，采用實施例1制備的引物組合進行二重PCR。 [0130] 二重PCR的反應體系（25.0yL):包含2XPCR Mix 12.5yL，步驟一得到的混合樣本 2.0yL(2. OyL混合樣本中，雞細小病毒的基因組DNA的含量為0.58ng，禽呼腸孤病毒的cDNA 的含量為〇.53ng)，引物對I和引物對II，最后用ddH20補足至25.0yL。二重PCR的反應體系 中，ChPV-F 和 ChPV-R 的濃度均為 0 · 4pmolAiL，ARV-F 和 ARV-R 的濃度均為 0 · 4pmol/yL。
[0131] 二重 PCR 的反應程序:95 °C 預變性 5min; 95 °C lmin、退火 lmin、72 °C lmin，進行 35 個 循環(huán);72°C延伸lOmin。
[0132] 分別設置如下退火溫度：
[0133] 退火溫度 I:50.0°C;
[0134] 退火溫度II :50.7°C;
[0135] 退火溫度III :51.9°C;
[0136] 退火溫度 IV:53.8°C;
[0137] 退火溫度 V:56.1°C;
[0138] 退火溫度VI :58.0°C;
[0139] 退火溫度VII :59.2°C;
[0140] 退火溫度 VII 1:60. (TC。
[0141] 將二重PCR的擴增產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳并拍照。
[0142] 設置用等體積水代替混合樣本的陰性對照，其相應的退火溫度為56.1°C。
[0143] 結果見圖2,圖2中，泳道1-8依次對應退火溫度I-VIII時得到的二重PCR的擴增產 物，Μ對應100bp DNA Marker，N對應陰性對照的二重PCR的擴增產物。綜合考慮引物對I和引 物對II的擴增效果，最佳退火溫度為56.1°C。
[0144] 綜合步驟二和步驟三，得到如下結論:二重PCR反應體系中，ChPV-F和ChPV-R的優(yōu) 選濃度均為〇. 4pmolAiL，ARV-F和ARV-R的優(yōu)選濃度均為0.4pmolAiL;二重PCR的優(yōu)選反應程 序為:95°C 預變性 5min;95°C lmin、56 · 1 °C lmin、72°C lmin，進行 35 個循環(huán)；72°C 延伸 10min。
[0145] 實施例3、特異性
[0146] 1、提取待測樣本的基因組DNA。待測樣本分別為:雞細小病毒(ChPV)、馬立克病毒 (MDV)、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV)。
[0147] 2、提取待測樣本的總RNA，并反轉錄成cDNA。待測樣本分別為：禽呼腸孤病毒 (ARV)、雞新城疫病毒(NDV)、H9亞型禽流感病毒(AIV H9)、傳染性支氣管炎病毒（IBV)。
[0148] 3、分別將步驟1得到的各個基因組DNA樣本、步驟2得到的各個cDNA樣本以及實施 例2的步驟一得到的混合樣本作為模板，采用實施例1制備的引物組合進行二重PCR。
[0149] 二重PCR的反應體系（25.0yL):包含2XPCR Mix 12.5yL，模板2.0yL，引物對I和引 物對II，最后用ddH20補足至25. OyL。二重PCR的反應體系中，ChPV-F和ChPV-R的濃度均為 0.4pmolAiL，ARV-F和ARV-R的濃度均為0.4pmolAiL。設置用等體積水代替混合樣本的陰性 對照。
[0150] 模板為步驟1得到的各個基因組DNA樣本時，2. OyL模板中的DNA含量0.58ng;
[0151] 模板為步驟2得到的各個cDNA樣本時，2. OyL模板中的DNA含量0.53ng;
[0152] 模板為實施例2的步驟一得到的混合樣本時，2 . OyL模板中雞細小病毒的基因組 DNA的含量為0.58ng、禽呼腸孤病毒的cDNA的含量為0.53ng。
[0153] 二重 PCR 的反應程序：95°C 預變性 51^11;95°(：1111丨11、56.1°(：1111丨11、72°(：1111丨11，進行35 個循環(huán);72°C延伸lOmin。
[0154] 將二重PCR的擴增產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳并拍照。
[0155] 結果見圖3。圖3中，1為混合樣本的二重PCR的擴增產物，2為ARV的cDNA的二重PCR 的擴增產物，3為ChPV的基因組DNA的二重PCR的擴增產物，4為NDV的cDNA的二重PCR的擴增 產物，5為MDV的基因組DNA的二重PCR的擴增產物，6為AIV H9的cDNA的二重PCR的擴增產物， 7為IBV的cDNA的二重PCR的擴增產物，8為ILTV的基因組DNA的二重PCR的擴增產物，Μ對應 100bp DNA Marker，N對應陰性對照的二重PCR的擴增產物。結果表明，ChPV擴增出204bp的 特異性條帶(經測序，如序列表的序列5所示），ARV擴增出405bp的特異性條帶(經測序，如序 列表的序列6所示），而NDV、MDV、AIV H9、IBV、ILTV均無特異性條帶出現(xiàn)。
[0156] 實施例4、敏感性
[0157] -、制備模板
[0158] 1、提取雞細小病毒的基因組DNA，得到DNA濃度為58.2ng/yL的DNA溶液。
[0159] 2、提取禽呼腸孤病毒的總RNA，并反轉錄成cDNA，得到DNA濃度為53.0ngAiL的DNA 溶液。
[0160] 3、將步驟1得到的DNA溶液和步驟2得到的DNA溶液混合。
[0161 ] 4、用ddH20 10倍梯度稀釋步驟3得到的混合液，得到各個稀釋液。
[0162] 二、敏感性的檢測
[0163] 將步驟一得到的稀釋液作為模板，采用實施例1制備的引物組合進行二重PCR。
[0164] 二重PCR的反應體系（25.0yL):包含2XPCR Mix 12.5yL，步驟一得到的稀釋液1μ L，引物對I和引物對II，最后用ddH20補足至25.OyL。二重PCR的反應體系中，ChPV-F和ChPV-R的濃度均為〇.4pmolAiL，ARV-F和ARV-R的濃度均為0.4pmolAiL。設置用等體積水代替混合 樣本的陰性對照。
[0165] 由于采用的稀釋液的稀釋度不同，形成如下不同的反應體系：
[0166] 反應體系1中，雞細小病毒DNA的初始含量為58.2ng、禽呼腸孤病毒DNA的初始含量 為53.0ng;
[0167] 反應體系2中，雞細小病毒DNA的初始含量為5.8ng、禽呼腸孤病毒DNA的初始含量 為5.3ng;
[0168] 反應體系3中，雞細小病毒DNA的初始含量為582pg、禽呼腸孤病毒DNA的初始含量 為530pg;
[0169] 反應體系4中，雞細小病毒DNA的初始含量為58pg、禽呼腸孤病毒DNA的初始含量為 53pg；
[0170] 反應體系5中，雞細小病毒DNA的初始含量為5.8pg、禽呼腸孤病毒DNA的初始含量 為5.3pg;
[0171] 反應體系6中，雞細小病毒DNA的初始含量為582fg、禽呼腸孤病毒DNA的初始含量 為530fg;
[0172] 反應體系7中，雞細小病毒DNA的初始含量為58fg、禽呼腸孤病毒DNA的初始含量為 53fg；
[0173] 反應體系8中，雞細小病毒DNA的初始含量為5.8fg、禽呼腸孤病毒DNA的初始含量 為5.3fg;
[0174] 反應體系9中，雞細小病毒DNA的初始含量為0.58fg、禽呼腸孤病毒DNA的初始含量 為0.53fg。
[0175] 二重 PCR 的反應程序：95°C 預變性 51^11;95°(：1111丨11、56.1°(：1111丨11、72°(：1111丨11，進行35 個循環(huán);72°C延伸lOmin。
[0176] 將二重PC