一種l-異亮氨酸羥化酶基因及其基因工程菌與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種能特異性地催化L-異亮氨酸生成（2S，3R，4S）-4-羥基異亮氨酸的L-異亮氨酸羥化酶基因，以及含有該基因的基因工程菌。利用該菌株生產(chǎn)（2S，3R，4S）-4-羥基異亮氨酸，能夠克服提取法存在的提取率低、分離純化困難、原材料需求量大、成本高等不足；化學(xué)合成法反應(yīng)條件苛刻、步驟多、分離困難收率低的問題；以及酶法轉(zhuǎn)化率低且含有大量α-氨基丁酸等副產(chǎn)物的問題，使得發(fā)酵液中僅存在（2S，3R，4S）-4-羥基異亮氨酸一種構(gòu)型的4-羥基異亮氨酸，并通過L-異亮氨酸羥化酶編碼基因過表達(dá)的方法進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化效率，從而達(dá)到簡(jiǎn)化工藝、降低生產(chǎn)成本的目的。
【專利說明】—種L-異亮氨酸羥化酶基因及其基因工程菌與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種能特異性地催化L-異亮氨酸(L-1le)生成(2S，3R，4S) _4_羥基異亮氨酸的L-異亮氨酸羥化酶基因及含有該基因的基因工程菌，利用該菌株生產(chǎn)(2S，3R，4S) -4-羥基異亮氨酸產(chǎn)物單一，具有較高的轉(zhuǎn)化率，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】:
[0002]4-羥基異亮氨酸(4-Hydroxyisoleucine, 4-HIL)是一種主要存在于胡蘆巴屬植物種子中的L-異亮氨酸羥化物。研究表明4-羥基異亮氨酸具有葡萄糖濃度依賴的促進(jìn)胰島素分泌的活性以及促進(jìn)肌細(xì)胞對(duì)血糖吸收、加速脂肪代謝、降血脂和保護(hù)肝功能的作用。因此，作為有效預(yù)防和治療糖尿病及肥胖癥的理想藥物，4-羥基異亮氨酸具有廣泛的應(yīng)用前景和市場(chǎng)需求。
[0003]目前已報(bào)道的4-羥基異亮氨酸的生產(chǎn)方法包括提取法、化學(xué)合成法以及酶法，但僅提取法用于工業(yè)化生產(chǎn)。研究表明此方法獲得的4-羥基異亮氨酸構(gòu)型較多，但僅(2S，3R，4S)-4-羥基異亮氨酸具有上述生物學(xué)活性，從而使得該方法存在提取率低(僅為
0.091-0.6%)、分離純化困難、原材料需求量大、成本高等不足?；瘜W(xué)法合成4-羥基異亮氨酸的報(bào)道較多，但主要是以葡萄糖、薄荷酮或2-甲基乙酰乙酸乙酯為原料經(jīng)多步化學(xué)反應(yīng)生成，該方法反應(yīng)條件苛刻、步驟多、分離困難收率低，而且容易造成環(huán)境污染。酶法合成是以己醛、α -酮戊二酸化 及L-谷氨酸為底物經(jīng)4-羥基-3-甲基-2-酮基-戊酸醛縮酶和分支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶兩步催化合成，該方法轉(zhuǎn)化率低且產(chǎn)品中含有大量α -氨基丁酸等副廣物。
[0004]因此，采用特異性L-異亮氨酸羥化酶催化合成(2S，3R，4S)-4-羥基異亮氨酸是較為理想的方法。盡管Haefel6等在胡蘆巴種子破碎液中發(fā)現(xiàn)能夠?qū)-異亮氨酸(L-1soleucine，L-1le)轉(zhuǎn)化為(2S，3R，4S)-4-羥基異亮氨酸的活性組分，但至今未見后續(xù)研究報(bào)道。Kodera等(2009)首次報(bào)道了在蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)中發(fā)現(xiàn)能特異性地催化L-1le生成(2S，3R，4S) ~4~羥基異亮氨酸的L-異亮氨酸羥化酶。然而目前公布的關(guān)于能特異性地催化L-1le生成(2S，3R，4S) -4-羥基異亮氨酸的L-異亮氨酸羥化酶的基因序列有限，且未見采用微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)(2S，3R，4S) -4-羥基異亮氨酸的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種能特異性地催化L-1le生成(2S，3R，4S) _4_羥基異亮氨酸的L-異亮氨酸羥化酶基因(以ido表示)，該基因的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:1所示。其所編碼的L-異亮氨酸羥化酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種包含所述L-異亮氨酸羥化酶基因的基因工程菌，利用基因克隆技術(shù)將所述L-異亮氨酸羥化酶基因連接到合適的載體上，并轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，獲得能夠生產(chǎn)特異性催化L-1le生成(2S，3R，4S)_4_羥基異亮氨酸的L-異亮氨酸羥化酶的基因工程菌。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的是針對(duì)目前(2S，3R，4S) _4_羥基異亮氨酸的生產(chǎn)因提取(或反應(yīng))液中不同構(gòu)型4-羥基異亮氨酸共存，但有生物活性的(2S，3R，4S)-4-羥基異亮氨酸濃度低，致使存在原材料需求量大、成本高、污染嚴(yán)重等問題，提供一種以L-異亮氨酸和α -酮戊二酸為底物，采用微生物轉(zhuǎn)化法合成(2S，3R，4S) ~4~羥基異亮氨酸的生產(chǎn)方法，使得發(fā)酵液中僅存在(2S，3R，4S) -4-羥基異亮氨酸一種構(gòu)型的4-羥基異亮氨酸，并通過L-異亮氨酸羥化酶編碼基因過表達(dá)的方法進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化效率，從而達(dá)到簡(jiǎn)化工藝、降低生產(chǎn)成本。
[0008]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案之一是:提供一種構(gòu)建上述基因工程菌的方法，包括如下步驟:
[0009]( I)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0010]以本發(fā)明所述的L-異亮氨酸羥化酶編碼基因?yàn)槟０濉⒁訧D0-3 (SEQ ID Ν0:3)和IDO-4 (SEQ ID NO:4)為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0011]ID0-3:5， -CCGGTCGACAAGGAAGCTAGATATGAAAATGAGTGGCTTTAGCATAG-3， (Sal I )
[0012]ID0-4:5’ -CCGGAATTCTTATTTTGTCTCCTTATAAGAAAATGTTACTA-3’ (EcoR I)
[0013]將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收后分別經(jīng)Sal I和EcoR I進(jìn)行雙酶切，經(jīng)電泳、切膠回收后連接至表達(dá)載體PXMJ19，獲得重組質(zhì)粒。
[0014](2)重組菌株的構(gòu)建
`[0015]將(I)所獲得的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒桿菌ATCC13032細(xì)胞中，獲得重組菌株。
[0016]本發(fā)明解決上述問題所采用的技術(shù)方案之二是:提供一種微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)(2S，3R，4S)-4-羥基異亮氨酸的方法，包括以下步驟:
[0017](I)種子培養(yǎng):用接種環(huán)將1-2支經(jīng)新鮮斜面活化的上述基因工程菌，接種至裝有IOOmL種子培養(yǎng)基的IL擋板搖瓶，于32-37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)6_8h。
[0018](2)菌體的發(fā)酵培養(yǎng):以5%_10%接種量將步驟(1)的種子培養(yǎng)物接種至裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)罐培養(yǎng)，發(fā)酵溫度32-37°C，溶氧維持在20-40%，流加濃度為60-80%(W/V)的葡萄糖溶液，流加25%(W/V)的氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至6.8-7.2，發(fā)酵培養(yǎng)8-12h。按照10%接種量將一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接入5L自動(dòng)發(fā)酵罐，裝液量為3L，溶氧控制在20%-30%，培養(yǎng)溫度33°C，pH控制在?.0左右。
[0019](3)向發(fā)酵罐中添加等物質(zhì)的量濃度的L-異亮氨酸和α -酮戊二酸無菌溶液，使其終濃度為0.1-0.3mol/L，按步驟(2)繼續(xù)培養(yǎng)18_24h。經(jīng)24_36h培養(yǎng)，能夠?qū)?1.7%的L-1le轉(zhuǎn)化為(2S，3R，4S) -4-羥基異亮氨酸。
[0020](4)采用2，4-二硝基氟苯對(duì)(25，31?，45)-4-異亮氨酸衍生化后，以高效液相色譜法測(cè)定其的含量。
[0021]所述斜面培養(yǎng)基成分為:葡萄糖1.0-5.0g/L，蛋白胨10_15g/L，牛肉膏10_15g/L，NaC12.0-3.0g/L,瓊脂 25g/L, ρΗ7.0-7.2,0.075MPa 高壓蒸汽滅菌 30min。
[0022]所述種子培養(yǎng)基成分為:葡萄糖25_30g/L，玉米漿15_30mL/L，豆柏水解液15-30mL/L, KH2PO40.5-1.0g/L, MgSO4.7Η200.1-0.5g/L, MnS0415_30mg/L，F(xiàn)eS0410_30mg/L，尿素 2-5/L, pH7.0-7.2,0.075MPa 高壓蒸汽滅菌 30min。[0023]所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:葡萄糖60-80g/L，K2HP043.0-5.0g/L, MgSO4L 0-2.0g/L,MnS0420-50mg/L, FeS0420_50mg/L，玉米漿 20_50mL/L，豆柏水解液 15_30mL/L，0.075MPa 高壓蒸汽滅菌30min。
[0024]有益效果:
[0025]1、本發(fā)明所述ido基因編碼的L-異亮氨酸羥化酶具有如下特點(diǎn):
[0026]該酶的Km和Vmax分別為0.15mmol/L和3.13 μ mol/min/mg ;酶活隨溫度的升高而升高，當(dāng)溫度達(dá)到35°C時(shí)其活性最高，隨著溫度的繼續(xù)升高其活性迅速降低，當(dāng)溫度高于65°C時(shí)活性完全喪失(見圖7) ;pH7.0時(shí)活性最高，當(dāng)pH高于或低于7.0時(shí)，隨著pH的偏離，其活性急劇下降(見圖8);于35°C條件下處理5h后仍具有87.5%的活性。
[0027]2、本發(fā)明所述的生產(chǎn)方法克服了提取法存在的提取率低(僅為0.091-0.6%)、分離純化困難、原材料需求量大、成本高等不足；化學(xué)合成法反應(yīng)條件苛刻、步驟多、分離困難收率低，而且容易造成環(huán)境污染的問題；以及酶法轉(zhuǎn)化率低且產(chǎn)品中含有大量α-氨基丁酸等副產(chǎn)物的問題，使得發(fā)酵液中僅存在(2S，3R，4S)-4-羥基異亮氨酸一種構(gòu)型的4-羥基異亮氨酸，并通過L-異亮氨酸羥化酶編碼基因過表達(dá)的方法進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化效率，從而達(dá)到簡(jiǎn)化工藝、降低生產(chǎn)成本。
[0028]3、以本發(fā)明所述的基因工程菌為催化劑，L-異亮氨酸和α-酮戊二酸為底物，利用微生物轉(zhuǎn)化法合成(2S，3R，4S) -4-羥基異亮氨酸，專一性強(qiáng)，轉(zhuǎn)化效率高于75%，工藝簡(jiǎn)單易可行，成本低廉，適用于(2S，3R，4S) -4-羥基異亮氨酸的綠色制造。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0029]圖1重組質(zhì)粒pXMJ-1do構(gòu)建圖；
[0030]圖2ido基因PCR產(chǎn)物電泳圖譜
[0031]其中M為Marker泳道I以ID0-1和ID0-2為引物、宏基因組為模板泳道2以ID0-3和ID0-4為引物、pET-1do為模板；
[0032]圖3重組質(zhì)粒pET-1do和pXMJ-1do的酶切電泳圖譜
[0033]其中M為Marker泳道I為pET-1do經(jīng)Nde I和Xho I雙酶切泳道2為pXMJ-1do經(jīng)Sal I和EcoR I雙酶切；
[0034]圖4重組L-異亮氨酸羥化酶的SDS-PAGE電泳圖譜
[0035]其中M為Marker泳道I為含空質(zhì)粒pET_42a的E.coli BL21 (DE3)破碎液
[0036]泳道2為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL-1DO破碎液泳道3為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL-1DO破碎液泳道4為經(jīng)純化的重組L-異亮氨酸羥化酶；
[0037]圖5(2S，3R, 4S) _4_異亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品及本發(fā)明重組L-異亮氨酸羥化酶反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC和MS圖譜
[0038]其中A為(2S，3R, 4S) _4_異亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜
[0039]B為重組L-異亮氨酸羥化酶的反應(yīng)產(chǎn)物HPLC圖譜
[0040]C為對(duì)照經(jīng)2，4- 二硝基氟苯衍生化后HLPC圖譜
[0041]D為(2S，3R, 4S) ~4~異亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品MS圖譜
[0042]E為重組L-異亮氨酸羥化酶的反應(yīng)產(chǎn)物MS圖譜
[0043]保留時(shí)間為21.6min的色譜峰為重組L-異亮氨酸羥化酶的反應(yīng)產(chǎn)物[0044]保留時(shí)間為13.5min的色譜峰為衍生劑2，4_ 二硝基氟苯
[0045]保留時(shí)間為23.8min的色譜峰為L(zhǎng)-異亮氨酸；
[0046]圖6雙倒數(shù)曲線；
[0047]圖7溫度對(duì)本發(fā)明L-異亮氨酸羥化酶活性的影響；
[0048]圖8pH對(duì)本發(fā)明L-異亮氨酸羥化酶活性的影響；
[0049]圖9本發(fā)明重組L-異亮氨酸羥化酶的熱穩(wěn)定性；【具體實(shí)施方式】
[0050]實(shí)施例1:L_異亮氨酸羥化酶編碼基因ido的獲取
[0051]采用如下方法提取土壤宏基因組:
[0052]取天津科技大學(xué)花園表層土以下IOcm處IOg土樣置于搖瓶中，加入20mL DNA提取液(100mol/L Tris-HCl,100mmol/L EDTA2Na ；IOOmmoI/L Na3P04,1.5mol/L NaCl，2%CTAB，pH8.0)混勻。加入500 μ L溶菌酶(50mg/mL，pH8.0)，混勻后37°C水浴30min。置于超聲清洗儀中處理IOmin后加入1.5g無菌玻璃珠(直徑Imm),振蕩5min。加入40 μ L蛋白酶K(20mg/mL)，混勻后再加入2mL20%SDS，65°C水浴lh，每隔15_20min輕輕搖晃。于室溫1000Og離心lOmin，收集上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中。用等體積的苯酚和氯仿/異戊醇(24:1)各抽提一次，1000Og離心15min。吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入0.6倍體積異丙醇混勻，沉淀2h以上，1000Og離心20min。收集核酸沉淀，用冷的75%乙醇洗滌2次，干燥后溶于適量去離子水中。
[0053]以上述土壤宏基因組DNA為模板、利用引物ID0-1 (SEQ ID N0:5)和ID0-2 (SEQID N0:6)、通過PCR擴(kuò)增ido基因(ido基因PCR產(chǎn)物電泳圖譜見圖2)；
[0054]ID0-1:5，- CCGCATATGAAAATGAGTGGCTTTAGCATAG-3，(Nde I )
[0055]ID0-2:5’ -CCGCTCGAGTTATTTTGTCTCCTTATAAGAAAATGTTACTA-3’ (Xho I )
[0056]PCR 條件為:94 °C 5minl 個(gè)循環(huán)，94 °C 30s,56 °C 30s,72 °C lmin30 個(gè)循環(huán)，72°C IOminl個(gè)循環(huán)，反應(yīng)體系為100 μ L。取10 μ L PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0057]將從宏基因組DNA中PCR擴(kuò)增的目的片段回收后連接至pMD?18_T Vector并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，然后涂布于含氨芐青霉素(100 μ g/mL)的LB固體培養(yǎng)上，于37°C倒置培養(yǎng)24h。挑取3個(gè)單克隆，提取重組質(zhì)粒(將3個(gè)重組質(zhì)粒上的ido片段分別命名為ido-1、ido_2、ido-3)并測(cè)定ido序列。
[0058]測(cè)序結(jié)果表明，上述3個(gè)ido基因均含723個(gè)核苷酸，編碼240個(gè)氨基酸。其核苷酸序列與已報(bào)道的B.thuringiensis2-e_2的ido基因序列相似度分別為100%、97.47%和96.13%，其氨基酸序列相似性分別為100%、97.91%和93.33%。
[0059]實(shí)施例2:重組質(zhì)粒pET-1do的構(gòu)建及L-異亮氨酸羥化酶編碼基因ido功能分析
[0060]提取含ido-3的重組質(zhì)粒并用限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I酶切后進(jìn)行瓊脂糖電泳，切膠回收后連接至經(jīng)相同酶切的表達(dá)載體pET-42a，獲得重組質(zhì)粒pET-1do，將其轉(zhuǎn)化至E.coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中獲得重組菌株BL-1D0。
[0061]將BL-1DO種子培養(yǎng)物接種至LB液體培養(yǎng)基中，采用0.lmmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h。取ImL培養(yǎng)物于4°C 1000Og離心Imin收集菌體，并用ImL緩沖液A (Na2HPO4.12H202.9g/L, NaC18.5g/L, NaH2PO4.2Η200.30g/L, ρΗ7.4)洗滌菌體沉淀 3 次后再用 ImL 緩沖液 A 重懸。用超聲破碎儀超聲破碎上述菌懸液，工作條件為:功率350W，工作時(shí)間5sec，間隔時(shí)間10seC，5個(gè)循環(huán)，于冰上操作。取部分上述破碎液進(jìn)行SDS-PAGE。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后結(jié)果如圖4所示，BL-1DO破碎液出現(xiàn)一條分子量約29.0kDa的條帶，與L-異亮氨酸羥化酶理論分子量28.92kDa (含6XHis標(biāo)簽)一致。
[0062]將剩余菌體破碎液離心后取上清液并采用N1-NTA親和層析法分離純化重組L-異亮氨酸羥化酶，經(jīng)透析、濃縮、SDS-PAGE、考馬斯亮藍(lán)染色后出現(xiàn)分子量約為29kDa的單一條帶(圖4)，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定其濃度為3.5mg/mL。
[0063]取適量重組酶液測(cè)定其酶活性。反應(yīng)條件為:L_異亮氨酸lOmmol/L，α -酮戊二酸10mmol/L, FeSO40.5mmol/L,抗壞血酸10mmol/L,重組L-異亮氨酸輕化酶酶液50 μ L (以加入等體積的緩沖液A為對(duì)照)，用緩沖液A補(bǔ)充體積至lmL，于35°C反應(yīng)30min后加入10 μ L
乙酸終止反應(yīng)。
[0064]采用2，4- 二硝基氟苯對(duì)(2S，3R，4S) ~4~異亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品及取上述反應(yīng)液衍生化后，采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)其進(jìn)行鑒定。具體條件如下:色譜柱為Agilent ZORBAXEclips AAA (4.6 X 150mm, 5-Micron)，柱溫33°C，檢測(cè)波長(zhǎng)360nm。流動(dòng)相A和B分別為濃度為50%的乙腈和乙酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH6.4)，流速為1.0mL/min。質(zhì)譜條件為:電噴霧離子源，正離子模式檢測(cè)，毛細(xì)管電壓為2000V，取樣錐孔電壓為15V，萃取錐孔電壓為3V，離子源溫度為120°C，去溶劑氣溫度為400°C，去溶劑氣流速為400L/h，采用全掃描方式，掃描范圍m/z=0~400。檢測(cè)結(jié)果表明，經(jīng)衍生化的標(biāo)準(zhǔn)品及重組L-異亮氨酸羥化酶酶液催化反應(yīng)產(chǎn)物均出現(xiàn)保留時(shí)間為21.6min的色譜峰，而對(duì)照則無。分別將該色譜峰進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果表明其質(zhì)核比為311.9 (圖5)，經(jīng)鑒定為(2S，3R，4S)-4-異亮氨酸與2，4-二硝基氟苯反應(yīng)后生成的2，4- 二硝基苯基-4-羥基異亮氨酸(其分子量為313.3)，故證明ido基因所編碼蛋白具有催化L-異亮氨酸生成(2S，3R，4S)-4-異亮氨酸的活性。
[0065]實(shí)施例3:重組質(zhì)粒pXMJ-1do及重組菌株CG-1do的構(gòu)建(構(gòu)建過程見圖1)
[0066]以重組質(zhì)粒pET-1do為模板、利用引物ID0-3和ID0-4、擴(kuò)增其ido基因(ido基因PCR產(chǎn)物電泳圖譜見圖2)；
[0067]ID0-3:5， -CCGGTCGACAAGGAAGCTAGATATGAAAATGAGTGGCTTTAGCATAG-3， (Sal I )
[0068]ID0-4:5’ -CCGGAATTCTTATTTTGTCTCCTTATAAGAAAATGTTACTA-3> (EcoR I )
[0069]PCR 條件為:94 V 5minl 個(gè)循環(huán)，94 V 30s,56 V 30s,72 V lmin30 個(gè)循環(huán)，720C IOminl個(gè)循環(huán)，反應(yīng)體系為100 μ L。取10 μ L PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0070]將剩余的90 μ LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收后分別經(jīng)Sal I和EcoR I進(jìn)行雙酶切，經(jīng)電泳、切膠回收后連接至表達(dá)載體PXMJ19，獲得重組質(zhì)粒pXMJ-1do (酶切電泳圖譜見圖
3)。然后將重組質(zhì)粒pXMJ-1do其電轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒桿菌ATCC13032細(xì)胞中，獲得重組菌株CG-1do。
[0071]實(shí)施例4: (2S，3R，4S) ~4~羥基異亮氨酸的微生物轉(zhuǎn)化
[0072](I)種子培養(yǎng):用接種環(huán)將1-2支經(jīng)新鮮斜面活化的實(shí)施例3所得的重組菌株CG-1do接種至裝有IOOmL種子培養(yǎng)基的IL擋板搖瓶，于32_37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)6_8h。
[0073](2)菌體的發(fā)酵培養(yǎng):以5%_10%接種量將步驟(1)的種子培養(yǎng)物接種至裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)罐培養(yǎng)，發(fā)酵溫度32-37°C，溶氧維持在20-40%，流加濃度為60-80%(W/V)的葡萄糖溶液，流加25%(W/V)的氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至6.8-7.2，發(fā)酵培養(yǎng)6-12h。按照10%接種量將一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接入5L自動(dòng)發(fā)酵罐，裝液量為3L，溶氧控制在20%-30%，培養(yǎng)溫度33°C，pH控制在?.0左右。
[0074](3)向發(fā)酵罐中添加等物質(zhì)的量濃度的L-異亮氨酸和α -酮戊二酸無菌溶液，使其終濃度為0.1-0.3mol/L，按步驟(2)繼續(xù)培養(yǎng)18_24h。
[0075](4)采用2，4_ 二硝基氟苯對(duì)(2S，3R，4S)-4_異亮氨酸衍生化后，以高效液相色譜法測(cè)定其的含量，具體條件如下:色譜柱為Agilent ZORBAX Eclips AAA(4.6X 150mm,5-Micron)，柱溫33°C，檢測(cè)波長(zhǎng)360nm。流動(dòng)相A和B分別為濃度為50%的乙腈和乙酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH6.4)，流速為1.0mL/min。檢測(cè)結(jié)果表明，(2S，3R，4S)_4_異亮氨酸的出峰時(shí)間約為 21.6-25.2min，產(chǎn)量為 0.099-0.112mol/L，轉(zhuǎn)化率為 79.2-91.7%。
[0076]斜面培養(yǎng)成分為:葡萄糖1.0-5.0g/L,蛋白胨10_15g/L，牛肉膏10_15g/L，NaC12.0-3.0g/L,瓊脂 25g/L, ρΗ7.0-7.2,0.075MPa 高壓蒸汽滅菌 30min。
[0077]種子培養(yǎng)基成分為:葡萄糖25-30g/L，玉米漿15_30mL/L，豆柏水解液15_30mL/L，KH2PO40.5-1.0g/L, MgSO4.7Η200.1-0.5g/L, MnS0415_30mg/L，F(xiàn)eS0410_30mg/L，尿素 2_5g/L0 pH7.0-7.2,0.075MPa 高壓蒸汽滅菌 30min。
[0078]發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:葡萄糖60-80g/L，K2HP043.0-5.0g/L, MgSO4L 0-2.0g/L,MnS0420-50mg/L, FeS0420_50mg/L，玉米漿 20_50mL/L，豆柏水解液 15_30mL/L，0.075MPa 高壓蒸汽滅菌30min。 [0079]實(shí)施例5: (2S，3R，4S) _4_羥基異亮氨酸的微生物轉(zhuǎn)化
[0080](1)種子培養(yǎng):用接種環(huán)將2支經(jīng)新鮮斜面活化的轉(zhuǎn)化有L-異亮氨酸羥化酶的細(xì)菌接種至裝有IOOmL種子培養(yǎng)基的IL擋板搖瓶，于35°C，200rpm振蕩培養(yǎng)8h。
[0081](2)菌體的發(fā)酵培養(yǎng):以8%接種量將步驟(1)的種子培養(yǎng)物接種至裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)罐培養(yǎng)，發(fā)酵溫度35°C，溶氧維持在30%，流加濃度為80%(W/V)的葡萄糖溶液，流加25%(W/V)的氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至7.0,發(fā)酵培養(yǎng)6h。按照10%接種量將一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接入5L自動(dòng)發(fā)酵罐，裝液量為3L，溶氧控制在30%，培養(yǎng)溫度35°C，pH控制在
7.0。
[0082](3)向發(fā)酵罐中添加等物質(zhì)的量濃度的L-異亮氨酸和α -酮戊二酸無菌溶液，使其終濃度為0.125mol/L,按步驟(2)繼續(xù)培養(yǎng)20h。經(jīng)26h培養(yǎng)，CG-1do能夠?qū)?9.2%的L-1le化為4-羥基異亮氨酸。
[0083](4)采用2，4_ 二硝基氟苯對(duì)(2S，3R，4S)-4_異亮氨酸衍生化后，以高效液相色譜法測(cè)定其的含量，具體條件如下:色譜柱為Agilent ZORBAX Eclips AAA(4.6X 150mm,5-Micron)，柱溫33°C，檢測(cè)波長(zhǎng)360nm。流動(dòng)相A和B分別為濃度為50%的乙腈和乙酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH6.4)，流速為1.0mL/min。檢測(cè)結(jié)果表明，(2S，3R，4S)_4_異亮氨酸的出峰時(shí)間約為21.6min，產(chǎn)量為0.112mol/L，轉(zhuǎn)化率為91.7%。
[0084]斜面培養(yǎng)成分為:葡萄糖4.0g/L，蛋白胨12.0g/L，牛肉膏12.0g/L, NaC12.5g/L，瓊脂 25g/L，pH7.0-7.2,0.075MPa 高壓蒸汽滅菌 30min。
[0085]種子培養(yǎng)基成分為:葡萄糖25g/L，玉米漿15mL/L，豆柏水解液15mL/L，KH2PO40.6，MgSO4.7Η200.2g/L, MnS0415mg/L, FeS0415mg/L,尿素 2.5g/L。pH7.0,0.075MPa 高壓蒸汽滅菌 30min。
[0086]發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:葡萄糖80g/L，K2HP043.5g/L，MgSO4L 5g/L，MnS0425mg/L,FeS0425mg/L,玉米衆(zhòng) 25mL/L,ii柏水解液 15mL/L,0.075MPa 高壓蒸汽滅菌 30min。
[0087]實(shí)施例6:酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定
[0088](I)酶活性分析
[0089]測(cè)定不同L-1le濃度下實(shí)施例2所產(chǎn)酶的酶促反應(yīng)速度,采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法繪制曲線(圖6)并獲得方程1/V=48.25/[S]+0.32，經(jīng)計(jì)算該酶的Km和Vmax分別為 0.15mmol/L 和 3.13 μ mol/min/mg,與已報(bào)道的 B.thuringiensis2-e_2 的 L-異亮氨酸羥化酶存在一定差異(其Km和Vmax分別0.27mmol/L和1.13 μ mol/min/mg)，表明本研究獲得的L-異亮氨酸羥化酶與底物的親和度和催化效率均高于后者。
[0090](2)最適反應(yīng)溫度
[0091]分別測(cè)定不同溫度下實(shí)施例2所產(chǎn)酶相對(duì)活性，其活性隨溫度的升高而升高，當(dāng)溫度達(dá)到35°C時(shí)其活性最高(已報(bào)道的B.thuringiensis2-e-2的L-異亮氨酸輕化酶最適溫度為25°C)，隨著溫度的繼續(xù)升高其活性迅速降低，當(dāng)溫度高于65°C時(shí)活性完全喪失(圖7)。
[0092](3)最適 pH
[0093]在最適溫度(35°C)條件下測(cè)定不同pH對(duì)實(shí)施例2所產(chǎn)酶活性的影響，pH7.0時(shí)活性最高(已報(bào)道的B.thuringiensis2-e-2的L-異亮氨酸輕化酶最適pH為6.0),當(dāng)pH高于或低于7.0時(shí)，隨著pH的偏離，其活性急劇下降(圖8)。
[0094](4)熱穩(wěn)定性
[0095]分別將實(shí)施例2所產(chǎn)酶于25°C、35°C和45°C放置不同時(shí)間以測(cè)定其熱穩(wěn)定性。結(jié)果表明，在前8h內(nèi)，其在最適溫度35°C下保持較高活性；隨著時(shí)間的增加，3個(gè)溫度下重組L-異亮氨酸羥化酶殘留活性均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但25°C和35°C條件下酶活性下降緩慢，于35°C條件下處理5h后仍具有87.5%的活性。而45°C條件下活性下降最顯著，在該溫度下放置5h后其活性幾乎完全喪失(圖9)。
【權(quán)利要求】
1.一種編碼L-異亮氨酸羥化酶的基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
2.權(quán)利要求1所述的基因編碼的L-異亮氨酸羥化酶，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO:2所示。
3.一種包含有權(quán)利要求1所述的基因的基因工程菌。
4.一種構(gòu)建權(quán)利要求3所述基因工程菌的方法，步驟如下: 以權(quán)利要求1所述的L-異亮氨酸羥化酶編碼基因?yàn)槟０濉⒁訧D0-3和ID0-4為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
ID0-3:5， -CCGGTCGACAAGGAAGCTAGATATGAAAATGAGTGGCTTTAGCATAG-3， (Sal I )
ID0-4:5’ -CCGGAATTCTTATTTTGTCTCCTTATAAGAAAATGTTACTA-3> (EcoR I ) PCR 條件為:94°C 5minl 個(gè)循環(huán)，94°C 30s,56°C 30s,72°C lmin30 個(gè)循環(huán)，72°C IOminl個(gè)循環(huán)，反應(yīng)體系為100 μ L，取10 μ L PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)； 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收后分別經(jīng)Sal I和EcoR I進(jìn)行雙酶切，經(jīng)電泳、切膠回收后連接至表達(dá)載體PXMJ19，獲得重組質(zhì)粒，然后將其電轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒桿菌ATCC13032細(xì)胞中，獲得重組菌株。
5.一種利用權(quán)利要求3所述菌株通過微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)(2S，3R，4S) _4_羥基異亮氨酸的方法，包括以下步驟: (1)種子培養(yǎng):用接種環(huán)將1-2支經(jīng)新鮮斜面活化的上述基因工程菌，接種至裝有IOOmL種子培養(yǎng)基的IL擋板搖瓶，于32-37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)6_8h ； (2)菌體的發(fā)酵培養(yǎng):以5%-10%接種量將步驟(1)的種子培養(yǎng)物接種至裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)罐培養(yǎng)，發(fā)酵溫度32-37°C，溶氧維持在20-40%，流加濃度為60-80%ff/V的葡萄糖溶液，流加25%W/V的氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至6.8-7.2，發(fā)酵培養(yǎng)6_12h，按照10%接種量將一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接入5L自動(dòng)發(fā)酵罐，裝液量為3L，溶氧控制在20%-30%，培養(yǎng)溫度33 °C，pH控制在7.0左右； (3)向發(fā)酵罐中添加等物質(zhì)的量濃度的L-異亮氨酸和α-酮戊二酸無菌溶液，使其終濃度為0.1-0.3mol/L，按步驟(2)繼續(xù)培養(yǎng)18_24h。
6.如權(quán)利要求5所述的一種通過微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)(2S，3R，4S)-4-羥基異亮氨酸的方法，其特征在于: 所述斜面培養(yǎng)成分為:葡萄糖1.0-5.0g/L,蛋白胨10-15g/L，牛肉膏10_15g/L，NaC12.0-3.0g/L,瓊脂 25g/L, ρΗ7.0-7.2,0.075MPa 高壓蒸汽滅菌 30min ； 所述種子培養(yǎng)基成分為:葡萄糖25-30g/L，玉米漿15-30mL/L，豆柏水解液15_30mL/L，KH2PO40.5-1.0g/L, MgSO4.7Η200.1-0.5g/L, MnS0415_30mg/L，F(xiàn)eS0410_30mg/L，尿素 2_5g/L, pH7.0-7.2,0.075MPa 高壓蒸汽滅菌 30min ； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:葡萄糖 60-80g/L，K2HP043.0-5.0g/L, MgSO4L 0-2.0g/L,MnS0420-50mg/L, FeS0420_50m g/L，玉米漿 20_50mL/L，豆柏水解液 15_30mL/L，0.075MPa 高壓蒸汽滅菌30min。
【文檔編號(hào)】C12N15/53GK103865940SQ201410132444
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月3日
【發(fā)明者】陳寧, 張成林, 謝希賢, 徐慶陽, 劉淑云, 劉遠(yuǎn), 王鑫鑫 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)