借助于探測(cè)和標(biāo)記的寡核苷酸切割以及延長(zhǎng)試驗(yàn)的靶核酸序列檢測(cè)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及借助于探測(cè)和標(biāo)記的寡核苷酸切割以及延長(zhǎng)試驗(yàn)的靶核酸序列檢測(cè)。本發(fā)明通過(guò)切割與靶核酸序列雜交的探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸放出片段，并且，所述片段與捕捉和制模寡核苷酸雜交形成延長(zhǎng)雙鏈體后檢測(cè)所述延長(zhǎng)雙鏈體的存在來(lái)檢測(cè)靶核酸序列。延長(zhǎng)雙鏈體提供由表示延長(zhǎng)雙鏈體存在的標(biāo)記發(fā)出的信號(hào)（信號(hào)的產(chǎn)生、增加、消滅或者減少），并具有可調(diào)節(jié)的Tm值，這能夠很好地被適用于對(duì)靶核酸序列的存在的檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】借助于探測(cè)和標(biāo)記的寡核苷酸切割以及延長(zhǎng)試驗(yàn)的靶核酸序列檢測(cè)
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?01280001703.5、申請(qǐng)日為2012年I月11日、發(fā)明名稱為“借助于探測(cè)和標(biāo)記的寡核苷酸切割以及延長(zhǎng)試驗(yàn)的靶核酸序列檢測(cè)”的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0002]本發(fā)明涉及借助于探測(cè)和標(biāo)記的寡核苷酸(PTO)切割以及延長(zhǎng)(PTOCE，PTOCleavage and Extension)試驗(yàn)的革巴核酸序列檢測(cè)(Detection of Target Nucleic AcidSequence by PTO Cleavage and Extension Assay)。
【【背景技術(shù)】】
[0003]DNA雜交(hybridization)是分子生物學(xué)的基本的過(guò)程，受離子強(qiáng)度、堿基結(jié)構(gòu)、核酸片段的長(zhǎng)度、錯(cuò)配程度以及變性劑的存在的影響?；贒NA雜交的技術(shù)將成為決定特定核酸序列的非常有用的用具，將會(huì)明確有助于臨床診斷、基因研究及法醫(yī)學(xué)上的實(shí)驗(yàn)分析。
[0004]但是，在僅依賴雜交的以往的方法以及過(guò)程中，發(fā)生因探針和非-靶序列之間的非-特異性雜交引起的假陽(yáng)性結(jié)果的可能性高。因此，以往的方法以及過(guò)程存在改善可靠度的問(wèn)題。
[0005]除探針雜交過(guò)程以外還提出了利用酶反應(yīng)的幾種接近法，例如，TaqMan?探針?lè)椒ā?br> [0006]在TaqMan?探針?lè)椒ㄖ校c靶核酸序列雜交的標(biāo)記探針借助上游引物-依賴性DNA聚合酶的5’核酸酶活性被切割，來(lái)產(chǎn)生表示靶序列存在的信號(hào)(美國(guó)專利第5，210，015號(hào)、第5，538，848號(hào)以及第6，326，145號(hào))。TaqManTM探針?lè)椒ㄌ岢鲇糜谛盘?hào)產(chǎn)生的兩種接近法:聚合-依賴性切割(polymerization-dependent cleavage)以及聚合_獨(dú)立性切割(poly merization-1ndependent cleavage)。在聚合_依賴性切割中，上游引物的延長(zhǎng)必須在核酸聚合酶與標(biāo)記談著的5’ -末端接觸之前發(fā)生。隨著延長(zhǎng)反應(yīng)的進(jìn)行，聚合酶逐漸地切割標(biāo)記探針的5’-末端。在聚合-獨(dú)立切割中，上游引物以及標(biāo)記探針?lè)浅｀徑?，由此與靶核酸序列進(jìn)行雜交，上游引物的3’ -末端和核酸聚合酶的結(jié)合使上述核酸聚合酶與標(biāo)記探針的5’ -末端接觸來(lái)放出標(biāo)記。并且，TaqMan?探針?lè)椒ü_(kāi)，通過(guò)在其5’ -末端部位具有不與靶序列雜交的5’ -尾巴區(qū)域的標(biāo)記探針被切割來(lái)形成包含5’ -尾巴區(qū)域的片段。
[0007]也有對(duì)具有對(duì)靶序列非-互補(bǔ)的5’-尾巴區(qū)域的探針被5’核酸酶切割，放出包含5’ -尾巴區(qū)域的片段的幾種方法的報(bào)告。
[0008]例如，美國(guó)專 利第5，691，142號(hào)就公開(kāi)了對(duì)借助DNA聚合酶的5’核酸酶活性來(lái)被切割的切割結(jié)構(gòu)。公開(kāi)中則例示有對(duì)包含對(duì)模板非-互補(bǔ)的5’部位以及對(duì)模板互補(bǔ)的3’部位的寡核苷酸與模板雜交，并且上游寡核苷酸與模板非常鄰近而由此與模板進(jìn)行雜交的切割結(jié)構(gòu)。切割結(jié)構(gòu)通過(guò)被具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶或者具有合成活性的變形DNA聚合酶切割，來(lái)放出與模板非-互補(bǔ)的5’部位。之后，被放出的5’部位與具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸雜交，形成切割結(jié)構(gòu)。由此，誘導(dǎo)漸進(jìn)性的切割反應(yīng)來(lái)檢測(cè)靶序列。
[0009]美國(guó)專利第7，381，532號(hào)則公開(kāi)了具有3’-末端被阻斷的上游寡核苷酸的切割結(jié)構(gòu)通過(guò)被具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶或者FEN核酸酶切割，來(lái)放出非-互補(bǔ)的5’皮瓣(flap)部位，被放出的5’皮瓣部位借助大小分析或者相互作用性雙重標(biāo)記來(lái)被檢測(cè)的過(guò)程。美國(guó)專利第6，893，819號(hào)則公開(kāi)了能夠檢測(cè)的被放出的皮瓣借助核酸合成依賴性的、皮瓣-媒介連續(xù)性擴(kuò)增方法而生成的內(nèi)容。在此方法中，從第一個(gè)切割結(jié)構(gòu)放出的皮瓣，以核酸合成依賴性方式切割第二個(gè)切割結(jié)構(gòu)來(lái)放出皮瓣，并檢測(cè)被放出的皮瓣。
[0010]借助在液相中的熒光-標(biāo)記探針的雜交，即使利用一種熒光標(biāo)記也可根據(jù)解鏈曲線分析來(lái)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列。但是，借助相互作用性-雙重標(biāo)記探針的5’核酸酶-媒介切割來(lái)檢測(cè)靶核酸的以往技術(shù)，在多重靶檢測(cè)中對(duì)相異的靶序列需要種類相異的熒光標(biāo)記。因這種熒光標(biāo)記的種類數(shù)的限度，被檢測(cè)的靶序列的數(shù)量將受限。
[0011]美國(guó)申請(qǐng)
【發(fā)明者】為了開(kāi)發(fā)具有更加得到改善的準(zhǔn)確性以及方便性的，尤其以多重方式檢測(cè)靶序列的新穎的接近法而銳意研究努力。其結(jié)果，本
【發(fā)明者】定立了用于檢測(cè)靶序列的新穎的方案，這種靶檢測(cè)是通過(guò)探針雜交、酶探針切割、延長(zhǎng)以及延長(zhǎng)雙鏈體(extendedduplex)的檢測(cè)來(lái)達(dá)成的。本發(fā)明的方案不僅優(yōu)秀地適用于固相反應(yīng)，而且也能夠優(yōu)秀地適用于液相反應(yīng)，具有更加得到改善的準(zhǔn)確性以及方便性，能夠檢測(cè)多個(gè)靶序列。
[0016]因此，本發(fā)明的目的在于，提供利用探測(cè)和標(biāo)記的寡核苷酸切割以及延長(zhǎng)(PT0CE，PTO Cleavage and Extension)試驗(yàn),從DNA或者核酸混合物中檢測(cè)祀核酸序列的方法。
[0017]本發(fā)明的再一目的在于，提供用于利用探測(cè)和標(biāo)記的寡核苷酸切割以及延長(zhǎng)(PT0CE,PT0 Cleavage and Extension)試驗(yàn),從DNA或者核酸混合物中檢測(cè)祀核酸序列的方法的試劑盒。
[0018]本發(fā)明的另一目的及優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)所附的權(quán)利要求書(shū)及附圖，以及下面的詳細(xì)說(shuō)明將變得更加明確。【【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】】
[0019]圖1表示利用于PTO切割以及延長(zhǎng)試驗(yàn)(PTOCE assay)的探測(cè)和標(biāo)記的寡核苷酸(PTO,Probing and Tagging Oligonucleotide)以及捕捉和制模寡核苷酸(CTO,Capturingand Templating Oligonucleotide)的圖示性結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，PTO以及CTO的3’ -末端因被阻斷，因而防止延長(zhǎng)。
[0020]圖2表示包含解鏈分析的PTOCE試驗(yàn)。CTO在其制模部位具有報(bào)道分子以及猝滅分子。
[0021]圖3表示包含解鏈分析的PTOCE試驗(yàn)。CTO在其制模部位具有報(bào)道分子。上述報(bào)道分子被要求，根據(jù)存在于單-鏈形態(tài)或者雙-鏈形態(tài)來(lái)表示出相異的信號(hào)強(qiáng)度。
[0022]圖4表示包含解鏈分析的PTOCE試驗(yàn)。CTO在其模板部位具有iso_dC殘基以及報(bào)道分子。粹滅-1so-dGTP在延長(zhǎng)反應(yīng)期間插入(incorporated)到延長(zhǎng)雙鏈體內(nèi)。
[0023]圖5表示包含解鏈分析的PTOCE試驗(yàn)。PTO在其5’-標(biāo)記部位具有報(bào)道分子，CTO在其制模部位具有iso-dC殘基。猝滅-1so-dGTP在延長(zhǎng)反應(yīng)期間插入到延長(zhǎng)雙鏈體內(nèi)。[0024]圖6表示包含解鏈分析的PTOCE試驗(yàn)。PTO在其5’-標(biāo)記部位具有報(bào)道分子以及粹滅分子。
[0025]圖7表示包含解鏈分析PTOCE試驗(yàn)。PTO在其5’-標(biāo)記部位具有報(bào)道分子。上述報(bào)道分子被要求，根據(jù)存在于單-鏈形態(tài)或者雙-鏈形態(tài)來(lái)表示出相異的信號(hào)強(qiáng)度。
[0026]圖8表示包含解鏈分析的PTOCE試驗(yàn)。PTO在其5’-標(biāo)記部位具有猝滅分子，CTO在其捕捉部位具有報(bào)道分子。
[0027]圖9表示包含指定溫度下的檢測(cè)的PTOCE試驗(yàn)。CTO在其制模部位具有報(bào)道分子以及猝滅分子。CTO通過(guò)其3’ -末端在固相基質(zhì)上實(shí)現(xiàn)固定化。
[0028]圖10表示包含指定溫度下的檢測(cè)的PTOCE試驗(yàn)。報(bào)道-標(biāo)記dATP在延長(zhǎng)反應(yīng)期間插入到延長(zhǎng)雙鏈體內(nèi)。CTO通過(guò)其3’ -末端在固相基質(zhì)上實(shí)現(xiàn)固定化。
[0029]圖11表示包含指定溫度下的檢測(cè)的PTOCE試驗(yàn)。CTO在其制模部位具有iso_dC殘基，報(bào)道-1so dGTP在延長(zhǎng)反應(yīng)期間插入到延長(zhǎng)雙鏈體內(nèi)。CTO通過(guò)其3’ -末端在固相基質(zhì)上實(shí)現(xiàn)固定化。
[0030]圖12表示包含指定溫度下的檢測(cè)的PTOCE試驗(yàn)。PTO在其5’ -標(biāo)記部位具有報(bào)道分子。CTO通過(guò)其5’-末端在固相基質(zhì)上實(shí)現(xiàn)固定化。
[0031]圖13表示包含利用嵌入標(biāo)記的指定溫度下的檢測(cè)的PTOCE試驗(yàn)。CTO通過(guò)5’-末端在固相基質(zhì)上實(shí)現(xiàn)固定化。
[0032]圖14表示借助于包含解鏈分析的PTOCE試驗(yàn)的淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)基因的檢測(cè)結(jié)果。CTO在其制模部位具有報(bào)道分子以及猝滅分子。
[0033]圖15表示借助于包含解鏈分析的PTOCE試驗(yàn)的淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)基因的檢測(cè)結(jié)果。PTO在其5’ -末端具有猝滅分子，CTO在其3’ -末端具有報(bào)道分子。
[0034]圖16表示延長(zhǎng)雙鏈體的Tm值借助CTO序列來(lái)得到調(diào)節(jié)的結(jié)果。
[0035]圖17表示借助于利用PCR擴(kuò)增的PTOCE試驗(yàn)的淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)基因的檢測(cè)結(jié)果。CTO在其制模部位具有報(bào)道分子以及猝滅分子。圖17a表示包含實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的PTOCE試驗(yàn)的結(jié)果，圖17b表示包含后-PCR解鏈分析的PTOCE試驗(yàn)的結(jié)果。
[0036]圖18表示借助于利用PCR擴(kuò)增的PTOCE試驗(yàn)的淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)基因的檢測(cè)結(jié)果。CTO在其5’ -末端具有iso_dC殘基以及報(bào)道分子。粹滅-1so-dGTP在延長(zhǎng)反應(yīng)期間插入到延長(zhǎng)雙鏈體內(nèi)。圖18a表示包含實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的PTOCE試驗(yàn)的結(jié)果，圖18b表示包含后-PCR解鏈分析的PTOCE試驗(yàn)的結(jié)果。
[0037]圖19表示借助于利用PCR擴(kuò)增的PTOCE試驗(yàn)的淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)基因的檢測(cè)結(jié)果。PTO在其5’ -末端具有猝滅分子，CTO在其3’ -末端具有報(bào)道分子。圖19a表示包含實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的PTOCE試驗(yàn)的結(jié)果，圖19b表示包含后-PCR解鏈分析的PTOCE試驗(yàn)的結(jié)果。
[0038]圖20表示借助于包含后-PCR解鏈分析的PTOCE試驗(yàn)的淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoea, NG)基因以及金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA)基因的同步檢測(cè)結(jié)果。CTO在其制模部位具有報(bào)道分子以及猝滅分子。
[0039]圖21表示借助于包含微陣列中的解鏈分析的PTOCE試驗(yàn)的淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)基因的檢測(cè)結(jié)果。CTO通過(guò)其5’ -末端來(lái)實(shí)現(xiàn)固定化。PTO在其5’ -標(biāo)記部位具有報(bào)道分子。
[0040]圖22表示在微陣列中借助于包含指定溫度下的實(shí)時(shí)檢測(cè)的PTOCE試驗(yàn)的淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)基因的檢測(cè)結(jié)果。CTO通過(guò)其5’-末端來(lái)實(shí)現(xiàn)固定化。PTO在其5’ -標(biāo)記部位具有報(bào)道分子。
[0041]圖23表示在微陣列中借助于包含指定溫度下的實(shí)時(shí)檢測(cè)的PTOCE試驗(yàn)的淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)基因的檢測(cè)結(jié)果。CTO通過(guò)其3’ -末端來(lái)實(shí)現(xiàn)固定化,在其制模部位具有報(bào)道分子以及猝滅分子。
[0042]圖24表示在微陣列中借助于包含在指定溫度下的終點(diǎn)檢測(cè)的PTOCE試驗(yàn)的單一或者多個(gè)靶檢測(cè)結(jié)果。CTO通過(guò)其5’-末端來(lái)實(shí)現(xiàn)固定化。PTO在其5’-標(biāo)記部位具有報(bào)道分子。淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae, NG)基因以及金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, SA)基因被用作祀核酸序列。
[0043]【發(fā)明詳述】
[0044]本發(fā)明提供借助探測(cè)和標(biāo)記的寡核苷酸切割以及延長(zhǎng)(PTOCE, PTO Cleavage andExtension)試驗(yàn)檢測(cè)祀核酸序列的新穎的方法以及用于借助探測(cè)和標(biāo)記的寡核苷酸切割以及延長(zhǎng)(PTOCE, PTOCleavage and Extension)試驗(yàn)檢測(cè)祀核酸序列的試劑盒。
[0045]本發(fā)明不僅包含雜交反應(yīng)，還包含隨著靶核酸序列的存在而發(fā)生的酶反應(yīng)。
[0046]【1.借助于包含解鏈分析的探測(cè)和標(biāo)記的寡核苷酸切割以及延長(zhǎng)(PTOCE)的靶檢測(cè)過(guò)程】
[0047]根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種借助PTOCE (ΡΤ0切割以及延長(zhǎng))試驗(yàn)來(lái)從DNA或者核酸混合物中檢測(cè)靶核酸序列的方法，其包括如下步驟:
[0048] 步驟(a)，將上述靶核酸序列與上游寡核苷酸以及探測(cè)和標(biāo)記的寡核苷酸(ΡΤ0，Probing and Tagging Oligonucleotide)進(jìn)行雜交；上述上游寡核苷酸包含與上述祀核酸序列互補(bǔ)的雜交核苷酸序列；上述PTO包含:(i) 3’ -靶向部位，其包含與上述靶核酸序列互補(bǔ)的雜交核苷酸序列；以及(ii) 5’ -標(biāo)記部位，其包含與上述靶核酸序列非-互補(bǔ)的核苷酸序列；上述3’ -靶向部位與上述靶核酸序列雜交，上述5’ -標(biāo)記部位不與上述靶核酸序列雜交；上述上游寡核苷酸位于上述PTO的上游；
[0049]步驟(b)，在用于切割上述PTO的條件下，將上述步驟(a)的結(jié)果物與具有5’核酸酶活性的酶相接觸；上述上游寡核苷酸或者其延長(zhǎng)鏈誘導(dǎo)借助于具有上述5’核酸酶活性的酶的上述PTO的切割，這種上述切割放出包含上述PTO的5’ -標(biāo)記部位或者5’ -標(biāo)記部位的一部分的片段；
[0050]步驟(c),將從上述PTO放出的上述片段與捕捉和制模寡核苷酸(CTO, Capturingand Templating Oligonucleotide)進(jìn)行雜交；上述CTO沿著3’一 5’方向包含:(i)捕捉部位，其包含與上述PTO的5’ -標(biāo)記部位或者5’ -標(biāo)記部位的一部分互補(bǔ)的核苷酸序列，以及(ii)制模部位，其包含與上述PTO的5’ -標(biāo)記部位以及3’ -靶向部位非-互補(bǔ)的核苷酸序列；從上述PTO放出的上述片段與上述CTO的上述捕捉部位雜交；
[0051]步驟(d)，利用步驟(C)的結(jié)果物以及模板-依賴性核酸聚合酶來(lái)實(shí)施延長(zhǎng)反應(yīng)；雜交于上述CTO的捕捉部位的上述片段，通過(guò)被延長(zhǎng)來(lái)形成延長(zhǎng)雙鏈體，上述延長(zhǎng)雙鏈體具有根據(jù)(I)上述片段的序列和/或長(zhǎng)度、(i i )上述CTO的序列和/或長(zhǎng)度、或者(i i i )上述片段的序列和/或長(zhǎng)度和上述CTO的序列和/或長(zhǎng)度可進(jìn)行調(diào)節(jié)的Tm值；
[0052]步驟(e),在規(guī)定范圍的溫度下,通過(guò)對(duì)上述延長(zhǎng)雙鏈體進(jìn)行解鏈(melting)來(lái)提供表示上述延長(zhǎng)雙鏈體的存在的靶信號(hào)；上述靶信號(hào)由(i)與上述片段和/或上述CTO連接的至少一個(gè)標(biāo)記、(ii)在上述延長(zhǎng)反應(yīng)期間插入到上述延長(zhǎng)雙鏈體內(nèi)的標(biāo)記、(iii)在上述延長(zhǎng)反應(yīng)期間與插入到上述延長(zhǎng)雙鏈體內(nèi)的標(biāo)記和上述片段和/或上述CTO連接的標(biāo)記、或者(iv)嵌入標(biāo)記來(lái)提供；以及
[0053]步驟(f)，通過(guò)測(cè)定上述靶信號(hào)來(lái)檢測(cè)上述延長(zhǎng)雙鏈體；上述延長(zhǎng)雙鏈體的存在表示上述靶核酸序列的存 在。
[0054]本
【發(fā)明者】為了開(kāi)發(fā)具有更加得到改善的準(zhǔn)確性以及方便性的，尤其以多重方式檢測(cè)靶序列的新穎的接近法而銳意研究努力。其結(jié)果，本
【發(fā)明者】定立了用于檢測(cè)靶序列的新穎的方案，這種靶檢測(cè)是通過(guò)探針雜交、酶探針切割、延長(zhǎng)以及延長(zhǎng)雙鏈體(extendedduplex)的檢測(cè)來(lái)達(dá)成的。本發(fā)明的方案不僅優(yōu)秀地適用于固相反應(yīng)，而且也能夠優(yōu)秀地適用于液相反應(yīng)，具有更加得到改善的準(zhǔn)確性以及方便性，能夠檢測(cè)多個(gè)靶序列。
[0055]本發(fā)明利用以下連續(xù)性的結(jié)果:探針雜交、探測(cè)和標(biāo)記的寡核苷酸(PTO, Probingand Tagging Oligonucleotide)的切割以及延長(zhǎng)、祀-依賴性延長(zhǎng)雙鏈體的形成、以及延長(zhǎng)雙鏈體的檢測(cè)。因此，本發(fā)明被命名為探測(cè)和標(biāo)記的寡核苷酸切割以及延長(zhǎng)(PT0CE，PTOCleavage and Extension)試驗(yàn)。
[0056]本發(fā)明中，延長(zhǎng)雙鏈體的特征在于，具有提供借助解鏈分析或者在指定溫度(predetermined temperature)下的檢測(cè)來(lái)表示延長(zhǎng)雙鏈體的存在的信號(hào)的標(biāo)記。并且,延長(zhǎng)雙鏈體的特征在于，具有可調(diào)節(jié)的Tm值，這對(duì)多個(gè)靶檢測(cè)或者與非-靶信號(hào)進(jìn)行區(qū)分起著重要的作用。
[0057]由于延長(zhǎng)雙鏈體只在靶核酸存在的情況下生成，因而延長(zhǎng)雙鏈體的存在表示靶核酸的存在。
[0058]對(duì)包含解鏈分析的探測(cè)和標(biāo)記的寡核苷酸切割以及延長(zhǎng)(PT0CE，PTO Cleavageand Extension)試驗(yàn)進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明，如下:[0059]【步驟(a):靶核酸序列與上游寡核苷酸以及PTO的雜交】
[0060]根據(jù)本發(fā)明，首先將靶核酸序列與上游寡核苷酸以及探測(cè)和標(biāo)記的寡核苷酸(PTO, Probing and Tagging Oligonucleotide)進(jìn)行雜交。
[0061]在本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“靶核酸”、“靶核酸序列”或者“靶序列”意味著所要檢測(cè)的核酸序列，且，在雜交、退火或者擴(kuò)增條件下與探針或者引物進(jìn)行退火或者雜交。
[0062]在本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“探針(probe)”意味著與靶核酸序列實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)的部位或者包含這些部位的單-鏈核酸分子。
[0063]在本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“引物”意味著寡核苷酸，在誘導(dǎo)與核酸鏈(模板)互補(bǔ)的引物延長(zhǎng)產(chǎn)物的合成的條件，即，如核苷酸和DNA聚合酶等聚合劑的存在以及適合的溫度與pH的條件下，可起到合成的起始點(diǎn)的作用。
[0064]優(yōu)選地，探針以及引物為單-鏈脫氧核糖核苷酸分子。在本發(fā)明中利用的探針或者引物可包含天然(naturally occurring)脫氧單磷酸核苷(dNMP)(即，脫氧腺苷酸(dAMP)、dGMP (脫氧鳥(niǎo)苷酸)、dCMP (脫氧胞苷酸)及dTMP (脫氧胸苷酸))、變形的核苷酸或者非-天然核苷酸。并且，探針或者引物還可包含核糖核苷酸。
[0065]就引物而言，應(yīng)充分長(zhǎng)，以便能夠在聚合劑的存在之下引發(fā)延長(zhǎng)產(chǎn)物的合成。引物的適合的長(zhǎng)度取決于包括例如，溫度、應(yīng)用領(lǐng)域及引物的根源(source)的多個(gè)因素。在本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“退火”或“引發(fā)”意味著在模板核酸并置(apposition)寡脫氧核苷酸或者核酸，就上述并置而言，通過(guò)聚合酶對(duì)核苷酸進(jìn)行聚合而在模板核酸或者其一部分形成互補(bǔ)的核酸分子。
[0066]在本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“雜交(hybridization)”意味著互補(bǔ)的單鏈核酸形成雙鏈核酸。在兩個(gè)核酸鏈之間的互補(bǔ)性完全匹配(perfect match)時(shí)發(fā)生雜交，或者即使存在一部分錯(cuò)配(mismatch)堿基也能發(fā)生雜交。雜交時(shí)所需的互補(bǔ)性的程度可隨著雜交條件而不同，尤其是可通過(guò)溫度來(lái)進(jìn)行`調(diào)節(jié)。
[0067]上游寡核苷酸以及PTO與靶核酸序列的雜交可在通常借助最佳化步驟而決定的合適的雜交條件下實(shí)施。溫度、成分的濃度、雜交及清洗次數(shù)、緩沖液成分及它們的pH及離子強(qiáng)度等條件可根據(jù)包含寡核苷酸(上游寡核苷酸以及ΡΤ0)的長(zhǎng)度及糖皮質(zhì)激素(GC)含量以及靶核苷酸序列等的多種因子而變化。例如，在利用相對(duì)短的寡核苷酸的情況下，優(yōu)選地，選擇低的嚴(yán)格條件(stringent condition)。用于雜交的詳細(xì)條件可以在Joseph Sambrook Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, ColdSpring Harbor5, N.Y.(2001)；及 M.L.M.Anderson, NucleicAcidHybridization, Springer-Verlag New York Inc.N.Y.(1999)石角認(rèn)。
[0068]術(shù)語(yǔ)“退火”和“雜交”沒(méi)有區(qū)分，在本說(shuō)明書(shū)中混用。
[0069]上游寡核苷酸以及PTO具有與靶核酸序列互補(bǔ)的雜交核苷酸序列。在本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)的”意味著在預(yù)定的退火條件或者嚴(yán)格條件下引物或者探針以選擇性地與靶核酸序列雜交的程度充分地互補(bǔ)，并包括“實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)的(substantiallycomplementary)”及“完全互補(bǔ)的(perfectly complementary)”,優(yōu)選地意味著完全互補(bǔ)的意思。
[0070]PTO的5’-標(biāo)記部位具有與靶核酸序列非-互補(bǔ)的核苷酸序列。捕捉和制模寡核苷酸(CTO,Capturing and TemplatingOligonucleotide)的制模部位具有與 PTO 的 5’-標(biāo)記部位以及3’-靶向部位非-互補(bǔ)的核苷酸序列。在本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“非-互補(bǔ)的”意味著在預(yù)定的退火條件或者嚴(yán)格條件下引物或者探針不以選擇性地與靶核酸序列雜交的程度充分地非_互補(bǔ)，并包括“實(shí)質(zhì)上非互補(bǔ)的(substantially non-complementary)”及“完全非_互補(bǔ)的(perfectly non-complementary)”,優(yōu)選地意味著完全非-互補(bǔ)的意思。
[0071]在本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“探測(cè)和標(biāo)記的寡核苷酸(PTO, Probing and TaggingOligonucleotide)”意味著寡核苷酸,其包含:(i)3’ -祀向部位,其起到探針的作用；以及(ii) 5’ -標(biāo)記部位，其具有在與靶核酸序列雜交后被切割，進(jìn)而從PTO放出，并與靶核酸序列非-互補(bǔ)的核苷酸序列。PTO的5’ -標(biāo)記部位以及3’ -靶向部位必須以5’ 一 3’順序而置。在圖1中圖示ΡΤ0。
[0072]優(yōu)選地，在3’-靶向部位與靶核酸序列雜交，5’-標(biāo)記部位不與靶核酸序列雜交的嚴(yán)格條件下實(shí)施步驟(a)的雜交。
[0073]PTO不要求任何特定的長(zhǎng)度。例如，PTO的長(zhǎng)度可具有15-150核苷酸、15-100核苷酸、15-80核苷酸、15-60核苷酸、15-40核苷酸、20-150核苷酸、20-100核苷酸、20-80核苷酸、20-60核苷酸、20-50核苷酸、30-150核苷酸、30-100核苷酸、30-80核苷酸、30-60核苷酸、30-50核苷酸、35-100核苷酸、35-80核苷酸、35-60核苷酸或者35-50核苷酸的長(zhǎng)度。只要PTO的3’-靶向部位與靶核酸序列特異性地雜交，就可以具有任何長(zhǎng)度。例如，PTO的3’ -靶向部位可具有10-100核苷酸、10-80核苷酸、10-50核苷酸、10-40核苷酸、10-30核苷酸、15-100核苷酸、15-80核苷酸、15-50核苷酸、15-40核苷酸、15-30核苷酸、20-100核苷酸、20-80核苷酸、20-50核苷酸、20-40核苷酸或者20-30核苷酸的長(zhǎng)度。只要5’-標(biāo)記部位與CTO的制模部位特異性地雜交后被延長(zhǎng)，就可以具有任何長(zhǎng)度。例如，PTO的5’-標(biāo)記部位可具有5-50核苷酸、5-40核苷酸、5-30核苷酸、5_20核苷酸、10-50核苷酸、10-40核苷酸、10-30核苷酸、10-20核苷酸、15-50核苷酸、15-40核苷酸、15-30核苷酸或者15-20核苷酸的長(zhǎng)度。
[0074]PTO的3’ -末端還可具有3’ -OH末端(terminal)。優(yōu)選地，PTO的3’ -末端被“阻斷”，由此防止其延長(zhǎng)。
[0075]阻斷可通過(guò)以往方法來(lái)達(dá)成。例如，阻斷可通過(guò)在最后核苷酸的3’ -羥基上追加如生物素、標(biāo)記、磷酸鹽基、烷基、非-核苷酸連接肽、硫代磷酸酯或者烷烴-二醇?xì)埢鹊幕瘜W(xué)組成部分(moiety)來(lái)實(shí)施。擇一性地，阻斷可通過(guò)去除最后核苷酸的3’-羥基或者利用如雙脫氧核苷酸這種沒(méi)有3’ -羥基的核苷酸來(lái)實(shí)施。
[0076]擇一性地，可設(shè)計(jì)成使PTO具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
[0077]PTO的5’-標(biāo)記部位以及靶核酸序列之間的非-雜交意味著在特定雜交條件下它們之間非-形成穩(wěn)定的雙-鏈。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例，不參與與靶核酸序列的雜交的PTO的5’ -標(biāo)記部位形成單-鏈。
[0078]上游寡核苷酸位于PTO的上游。
[0079]并且，與靶核酸序列雜交的上游寡核苷酸或者其延長(zhǎng)鏈誘導(dǎo)基于具有5’核酸酶活性的酶的PTO的切割。
[0080]基于上游寡核苷酸的對(duì)PTO切割的誘導(dǎo)可通過(guò)兩種方式來(lái)達(dá)成。(i)誘導(dǎo)上游寡核苷酸延長(zhǎng)-獨(dú)立性切割；以及(ii)誘導(dǎo)上游寡核苷酸延長(zhǎng)-依賴性切割。[0081]在上游寡核苷酸與PTO相鄰近，進(jìn)而能夠充分誘導(dǎo)借助于具有5’核酸酶活性的酶的上述PTO的切割反應(yīng)的情況下，與上游寡核苷酸結(jié)合的上述酶能夠無(wú)需延長(zhǎng)反應(yīng)而切割ΡΤ0。另一方面，在上游寡核苷酸與PTO隔開(kāi)的情況下，具有聚合酶活性的酶(例如，模板-依賴性聚合酶)能夠促進(jìn)上游寡核苷酸(例如，上游引物)的延長(zhǎng)，與延長(zhǎng)產(chǎn)物結(jié)合的具有5’核酸酶活性的酶切割Ρ--。
[0082]因此，上游寡核苷酸能夠以兩種方式位于與PTO相對(duì)的位置。上游寡核苷酸可位于與PTO鄰近的位置，由此以延長(zhǎng)-獨(dú)立性方式能夠充分誘導(dǎo)PTO的切割。擇一性地，上游寡核苷酸可位于充分能夠以延長(zhǎng)-依賴性方式誘導(dǎo)PTO切割的與PTO隔開(kāi)的位置。[0083]在本說(shuō)明書(shū)中揭示方位(positions)或者位置(locations)而使用的術(shù)語(yǔ)“鄰近的(adjacent)”意味著上游寡核苷酸緊位于與PTO的3’ -祀向部位相近的位置形成缺口(nick)。并且，上述術(shù)語(yǔ)意味著上游寡核苷酸位于從PTO的3’ -靶向部位隔開(kāi)1-30核苷酸、1-20核苷酸或者1-15核苷酸的位置。
[0084]在本說(shuō)明書(shū)中揭示方位或者位置而使用的術(shù)語(yǔ)“隔開(kāi)(distant) ”包含能夠充分產(chǎn)生延長(zhǎng)反應(yīng)的某種位置或者場(chǎng)所。
[0085]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例，上游寡核苷酸可位于從PTO隔開(kāi)的位置，由此以延長(zhǎng)-依賴性方式能夠充分誘導(dǎo)PTO的切割。
[0086]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例，上游寡核苷酸為上游引物或者上游探針。上游引物適合誘導(dǎo)延長(zhǎng)-獨(dú)立性切割或者延長(zhǎng)-依賴性切割，上游探針適合誘導(dǎo)延長(zhǎng)-獨(dú)立性切割。
[0087]選擇性地，上游寡核苷酸可具有與PTO的3’ -靶向部位的5’ - 一部分部分重疊的序列(partial-overlapped sequence)。優(yōu)選地,重疊的序列為1-10核苷酸長(zhǎng)度、更優(yōu)選為1-5核苷酸長(zhǎng)度、進(jìn)而優(yōu)選為1-3核苷酸長(zhǎng)度。在上游寡核苷酸具有與PTO的3’ -靶向部位的5’ - 一部分部分重疊的序列(partial-overlapped sequence)的情況下,在步驟(b)的切割反應(yīng)中，3’-靶向部位將與5’-標(biāo)記部位一起被部分切割。并且，重疊的序列能夠使3’ -靶向部位中所需的特定部位被切割。
[0088]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例，上游引物通過(guò)其延長(zhǎng)鏈來(lái)誘導(dǎo)借助于具有5’核酸酶活性的酶的PTO的切割。
[0089]只要上游寡核苷酸能夠誘導(dǎo)與靶核酸序列雜交的PTO的切割，使得包含PTO的5’ -標(biāo)記部位或者PTO的5’ -標(biāo)記部位的一部分的片段被放出，與借助于上游寡核苷酸的切割反應(yīng)相關(guān)的以往技術(shù)就能夠適用于本發(fā)明。例如，美國(guó)專利第5，210，015號(hào)、第5，487，972號(hào)、第5,691, 142號(hào)、第5，994，069號(hào)、第7，381，532號(hào)以及美國(guó)申請(qǐng)
【發(fā)明者】開(kāi)發(fā)的雙重引發(fā)寡核苷酸(DPO)結(jié)構(gòu)。具有DPO結(jié)構(gòu)的寡核苷酸與以往引物以及探針相比表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)玫礁纳频陌刑禺惗?參照W02006/095981;Chun 等，Dual priming oligonucleotide system for the multiplexdetection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19gene，Nucleic AcidResearch, 35:6e40 (2007))。
[0093]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例，PTO的3’ -靶向部位具有由本
【發(fā)明者】開(kāi)發(fā)的變形雙重特異性寡核苷酸(mDSO)結(jié)構(gòu)。變形雙重特異性寡核苷酸(mDSO)結(jié)構(gòu)與以往的探針相比表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)玫礁纳频陌刑禺愋?參照W02011/028041)。
[0094]【步驟(b):從PTO放出片段】
[0095]接著，在用于切割PTO的條件下，將上述步驟(a)的結(jié)果物與具有5’核酸酶活性的酶相接觸。與靶核酸序列雜交的PTO被具有5’核酸酶活性的酶切割，因而放出包含PTO的5’ -標(biāo)記部位或者5’ -標(biāo)記部位的一部分的片段。
[0096]在本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“用于切割PTO的條件”意味著借助具有5’核酸酶活性的酶產(chǎn)生對(duì)與靶核酸序列雜交的PTO的切割的充分的條件，例如，溫度、pH、離子強(qiáng)度及緩沖液、寡核苷酸的長(zhǎng)度及序列和酶。例如，在利用作為具有5’核酸酶活性的酶的Taq DNA聚合酶的情況下，用于切割PTO的條件包含Tris-HCl緩沖液、氯化鉀(KCl )、氯化鎂(MgCl2)以及溫度。
[0097]在PTO與靶核酸序列雜交的情況下，雖然3’ -靶向部位進(jìn)行雜交，但是其5’ -標(biāo)記部位則不與靶核酸序列雜交而形成單-鏈(參照?qǐng)D2 )。像這樣，將單-鏈以及雙-鏈結(jié)構(gòu)都包含在內(nèi)的寡核苷酸可借助在本領(lǐng)域被告知的多種技術(shù)，利用具有5’核酸酶活性的酶來(lái)切割。
[0098]PTO的切割位置根據(jù)上游寡核苷酸(上游探針或者上游引物)的種類、上游寡核苷酸的雜交位置以及切割條件會(huì)不同(美國(guó)專利第5，210，015號(hào)、第5，487,972號(hào)、第5，691，142號(hào)、第5，994，069號(hào)以及第7，381，532號(hào)或者美國(guó)申請(qǐng)
【發(fā)明者】為了上游引物的延長(zhǎng)、PTO的切割以及PTO片段的延長(zhǎng)，利用了具有5’核酸酶活性的Taq DNA聚合酶。
[0421]在實(shí)施試驗(yàn)期間`形成的延長(zhǎng)雙鏈體被設(shè)計(jì)成具有相互作用性雙重標(biāo)記。延長(zhǎng)雙鏈體的相互作用性雙重標(biāo)記是由(i)被標(biāo)記為報(bào)道分子以及猝滅分子的CTO(雙重-標(biāo)記CT0)或者(ii)具有猝滅分子的PTO以及具有報(bào)道分子的CTO (猝滅-標(biāo)記PTO以及報(bào)道-標(biāo)記CT0)來(lái)提供。PTO以及CTO的3’-末端用碳間隔區(qū)(carbon spacer)來(lái)阻斷。將對(duì)淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae, NG)基因的合成寡核苷酸利用為祀模板。
[0422]【1-1.利用雙重-標(biāo)記CTO的PTOCE試驗(yàn)】
[0423]PTO不具有標(biāo)記。CTO在其制模(templating)部位具有猝滅分子(BHQ-1)以及熒光報(bào)道分子(FAM)。在本實(shí)施例中利用的合成模板、上游引物、PTO以及CTO的序列如下:
[0424]NG-T5，-
[0425]AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA
[0426]CCGATCCATTGAAAAA-3’ (SEQ ID NO:1)
[0427]NG-R5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’( SEQ ID NO:2) NG-PTO-1
[0428]5，-ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’ (SEQ ID NO:3)
[0429]NG-CT0-15，-[BHQ-1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T (FAM)]CCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3Spacer]-3，(SEQ ID NO:4)
[0430](標(biāo)有下劃線的文字是指PTO的5’-標(biāo)記(tagging)部位。)
[0431]用含有對(duì)淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)基因的合成模板(SEQ ID NO:1) 2pmole (皮摩爾)、上游引物(SEQ ID NO:2) IOpmole, PTO (SEQ ID NO:3) 5pmole、CTO(SEQ ID NO:4) 2pmole、含有 2.5mM MgCl2 的 2X 主混合液 10 μ I, dNTPs200 μ M 以及 H-TaqDNA聚合酶(索爾杰恩特公司，韓國(guó)(Solgent,Korea))l.6單元(unit)的20 μ I的最終體積實(shí)施了反應(yīng)；將含有上述反應(yīng)混合物的管位于實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀(CFX96，伯樂(lè)公司=Bio-Rad)；將上述反應(yīng)混合物在95°C下進(jìn)行15分鐘變性后，將在95°C下30秒、在60°C下60秒的過(guò)程反復(fù)進(jìn)行了 30次。反應(yīng)后，將反應(yīng)混合物冷卻至35°C，在35°C下維持30秒后，通過(guò)從35°C慢慢加熱至90°C，得到了解鏈曲線。通過(guò)在溫度上升期間連續(xù)測(cè)定熒光來(lái)監(jiān)測(cè)了雙-鏈DNA的解離。解鏈峰值來(lái)源于解鏈曲線數(shù)據(jù)。
[0432]如圖14所示，在有模板的情況下，在相當(dāng)于延長(zhǎng)雙鏈體的預(yù)想Tm值的76.5°C下檢測(cè)出了峰值。在無(wú)模板的情況下，沒(méi)有檢測(cè)出任何峰值。由于在本標(biāo)記方法中，非切割PTO以及CTO之間的雜交物(hybrid)不提供任何信號(hào)，因而沒(méi)有檢測(cè)出相當(dāng)于非切割PTO以及CTO之間的雜交物的峰值。在不存在PTO或者不存在CTO的情況下，沒(méi)有觀察出任何峰值。
[0433]【1-2.利用猝滅-標(biāo)記PTO以及報(bào)道-標(biāo)記CTO的PTOCE試驗(yàn)】
[0434]PTO將其5’ -末端標(biāo)記為猝滅分子(BHQ-1)。CTO將其3’ -末端標(biāo)記為熒光報(bào)道分子(FAM)。
[0435]在本實(shí)施例中利用的合成模板、上游引物、PTO以及CTO的序列如下:
[0436]NG-T
[0437]5’ -AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCT TTTTGTTCTTGCTCG
[0438]GCAGAGCGAGTGATACCGATCCATTGAAAAA-3’ (SEQ ID NO:1)
[0439]NG-R5，-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3，(SEQ ID NO:2) NG-PT0-25，-[BHQ-1]ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTGTT TCG[C3spacer]-3，
[0440](SEQ ID NO:5)
[0441]NG-CT0-2
[0442]5’-CCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAAGCCAAGCCGTC GT[FAM]-3’ (SEQ ID NO:6)
[0443](標(biāo)有下劃線的文字是指PTO的5’-標(biāo)記部位。)
[0444]用含有對(duì)淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)基因的合成模板(SEQ ID NO:1) 2pmole (皮摩爾)、上游引物(SEQ ID NO:2) IOpmole, PTO (SEQ ID NO:5) 5pmole、CTO(SEQ ID NO:6) 2pmole、含有 2.5mM MgCl2 的 2X 主混合液 10 μ I, dNTPs200 μ M 以及 H-TaqDNA聚合酶(索爾杰恩特公司，韓國(guó)(Solgent,Korea))l.6單元(unit)的20 μ I的最終體積實(shí)施了反應(yīng)；將含有上述反應(yīng)混合物的管位于實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀(CFX96，伯樂(lè)公司=Bio-Rad)；將上述反應(yīng)混合物在95°C下進(jìn)行15分鐘變性后，將在95°C下30秒、在60°C下60秒、以及在72°C下30秒的過(guò)程反復(fù)進(jìn)行了 30次。反應(yīng)后，將反應(yīng)混合物冷卻至35°C，在35°C下維持30秒后，通過(guò)從35°C慢慢加熱至90°C，得到了解鏈曲線。通過(guò)在溫度上升期間連續(xù)測(cè)定熒光來(lái)監(jiān)測(cè)了雙-鏈DNA的解離。解鏈峰值來(lái)源于解鏈曲線數(shù)據(jù)。
[0445]如圖15所示，在有模板的情況下，在相當(dāng)于延長(zhǎng)雙鏈體的預(yù)想Tm值的77°C下檢測(cè)出了峰值。由于在本標(biāo)記方法中，非切割PTO以及CTO之間的雜交物提供非-靶信號(hào)，因而在相當(dāng)于非切割PTO以及CTO之間的雜交物的Tm值的64.(TC -64.5°C下，出現(xiàn)了峰值。在不存在PTO或者不存在CTO的情況下，沒(méi)有觀察出任何峰值。
[0446]這種結(jié)果顯示試驗(yàn)?zāi)軌蛐纬砂?依賴性延長(zhǎng)雙鏈體，并且，上述延長(zhǎng)雙鏈體，提供用于表不祀核酸序列的存在的祀信號(hào)。[0447]【實(shí)施例2:延長(zhǎng)雙鏈體Tm值的調(diào)節(jié)】
[0448]本
【發(fā)明者】就在PTOCE試驗(yàn)中借助CTO的序列是否能夠調(diào)節(jié)延長(zhǎng)雙鏈體的Tm值進(jìn)行了追加的實(shí)驗(yàn)。
[0449]為了本實(shí)驗(yàn)，本
【發(fā)明者】在制模(templating)部位利用了具有互不相同的序列的3種CTO。PTO不具有標(biāo)記。3種CTO在其制模部位具有猝滅分子(BHQ-1)以及熒光報(bào)道分子(FAM)0 PTO以及CTO的3’-末端用碳間隔區(qū)(carbon spacer)來(lái)阻斷。[0450]分別利用3種CTO實(shí)施了包含解鏈分析的PTOCE試驗(yàn)。
[0451]在本實(shí)施例中利用的合成模板、上游引物、PTO以及CTO的序列如下:
【權(quán)利要求】
1.一種借助PTOCE (ΡΤ0切割以及延長(zhǎng))試驗(yàn)來(lái)從DNA或者核酸混合物中檢測(cè)靶核酸序列的方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟(a)，將所述靶核酸序列與上游寡核苷酸以及ΡΤ0(探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸)進(jìn)行雜交；所述上游寡核苷酸包含與所述靶核酸序列互補(bǔ)的雜交核苷酸序列；所述PTO包含:(i)3’ -靶向部位，其包含與所述靶核酸序列互補(bǔ)的雜交核苷酸序列，以及(ii)5’ -標(biāo)記部位，其包含與所述靶核酸序列非-互補(bǔ)的核苷酸序列；所述3’ -靶向部位與所述靶核酸序列雜交，所述5’ -標(biāo)記部位則不與所述靶核酸序列雜交；所述上游寡核苷酸位于所述PTO的上游； 步驟(b)，在用于所述PTO的切割的條件下，將步驟(a)的結(jié)果物與具有5’核酸酶活性的酶相接觸；所述上游寡核苷酸或者其延長(zhǎng)鏈誘導(dǎo)借助于具有所述5’核酸酶活性的酶對(duì)所述PTO的切割，從而所述切割釋放出包含所述PTO的所述5’ -標(biāo)記部位或者所述5’ -標(biāo)記部位的一部分的片段； 步驟(C)，將從所述PTO釋放出的所述片段與CTO (捕捉和制模寡核苷酸)進(jìn)行雜交；所述CTO沿著3’ 一 5’方向包含:(i)捕捉部位，其包含與所述PTO的所述5’ -標(biāo)記部位或者所述5’ -標(biāo)記部位的一部分互補(bǔ)的核苷酸序列，以及(ii)制模部位，其包含與所述PTO的所述5’ -標(biāo)記部位以及所述3’ -靶向部位非-互補(bǔ)的核苷酸序列；從所述PTO釋放出的所述片段與所述CTO的所述捕捉部位雜交； 步驟(d)，利用步驟(c)的結(jié)果物以及模板-依賴性核酸聚合酶來(lái)實(shí)施延長(zhǎng)反應(yīng)；雜交于所述CTO的所述捕捉部位的所述片段被延長(zhǎng)，形成延長(zhǎng)雙鏈體；所述延長(zhǎng)雙鏈體具有根據(jù)(i)所述片段的序列和/或長(zhǎng)度、(ii)所述CTO的序列和/或長(zhǎng)度、或者(iii)所述片段的序列和/或長(zhǎng)度和所述CTO的序列和/或長(zhǎng)度可進(jìn)行調(diào)節(jié)的Tm值；所述延長(zhǎng)雙鏈體借助(i)與所述片段和/或CTO連接的至少一個(gè)標(biāo)記、(ii)在所述延長(zhǎng)反應(yīng)期間插入到所述延長(zhǎng)雙鏈體內(nèi)的標(biāo)記、(iii)與所述片段和/或所述CTO連接的至少一個(gè)標(biāo)記和在所述延長(zhǎng)反應(yīng)期間插入到所述延長(zhǎng)雙鏈體內(nèi)的標(biāo)記、或者(iv)嵌入標(biāo)記來(lái)提供靶信號(hào)；以及 步驟(e)，在所述延長(zhǎng)雙鏈體維持其雙鏈形態(tài)的指定溫度下，通過(guò)測(cè)定所述靶信號(hào)來(lái)檢測(cè)所述延長(zhǎng)雙鏈體，由此，所述延長(zhǎng)雙鏈體的存在表示所述靶核酸序列的存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，由所述延長(zhǎng)雙鏈體提供的所述靶信號(hào)是在步驟(d)的延長(zhǎng)期間被提供； 未切割的PTO以及所述CTO之間的雜交物不提供非靶信號(hào)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于， 由所述延長(zhǎng)雙鏈體提供的所述靶信號(hào)是在步驟(c)中通過(guò)所述片段以及所述CTO的所述雜交來(lái)提供； 在步驟(d)中，所述延長(zhǎng)雙鏈體的形成維持了靶信號(hào)； 其中未切割的PTO以及所述CTO之間的所述雜交物確實(shí)提供了非靶信號(hào)； 所述指定溫度足以解離所述雜交物而去除非-靶信號(hào)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶信號(hào)由與所述片段和/或所述CTO連接的至少一個(gè)標(biāo)記提供。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于， 所述片段具有包含報(bào)道分子以及猝滅分子的相互作用性雙重標(biāo)記；步驟(C)中所述片段以及所述CTO的雜交誘導(dǎo)了來(lái)自所述相互作用性雙重標(biāo)記的信號(hào)的變化，由此提供靶信號(hào)； 并且所述延長(zhǎng)雙鏈體維持所述靶信號(hào)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于， 所述CTO具有包含報(bào)道分子以及猝滅分子的相互作用性雙重標(biāo)記； 步驟(C)中的所述片段以及所述CTO的所述雜交誘導(dǎo)來(lái)自所述相互作用性雙重標(biāo)記的信號(hào)的變化來(lái)提供所述靶信號(hào)； 所述延長(zhǎng)雙鏈體維持了所述靶信號(hào)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于， 所述CTO具有包含報(bào)道分子以及猝滅分子的相互作用性雙重標(biāo)記； 在步驟(d)中，通過(guò)延長(zhǎng)所述片段，誘導(dǎo)來(lái)自所述相互作用性雙重標(biāo)記的信號(hào)的變化來(lái)提供所述靶信號(hào)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于， 所述片段具有包含報(bào)道分子以及猝滅分子的相互作用性雙重標(biāo)記中的一個(gè)； 所述CTO具有所述相互作用性雙重標(biāo)記中的剩余一個(gè)； 步驟(c)中的所述片段以及所述CTO的所述雜交，誘導(dǎo)來(lái)自所述相互作用性雙重標(biāo)記的信號(hào)的變化來(lái)提供所述靶信號(hào)； 由所述延長(zhǎng)雙鏈體來(lái)維持所述靶信號(hào)。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于， 所述片段或者所述CTO具有單一標(biāo)記； 步驟(C)中的所述片段以及所述CTO的所述雜交，誘導(dǎo)來(lái)自所述相互作用性雙重標(biāo)記的信號(hào)的變化來(lái)提供所述靶信號(hào)； 由所述延長(zhǎng)雙鏈體來(lái)維持所述靶信號(hào)。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于， 所述CTO具有單一標(biāo)記； 在步驟(d)中，通過(guò)延長(zhǎng)所述片段，誘導(dǎo)來(lái)自所述單一標(biāo)記的信號(hào)的變化來(lái)提供所述靶信號(hào)。
11.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記被置于在形成非切割PTO以及所述CTO之間的雜交物的情況下所述雜交物在步驟(d)中不提供非-靶信號(hào)的范圍內(nèi)。
12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于， 所述標(biāo)記被置于在形成非切割PTO以及所述CTO之間的雜交物的情況下所述雜交物在步驟(d)中提供非-靶信號(hào)的范圍內(nèi)； 所述延長(zhǎng)雙鏈體的Tm值高于所述非切割PTO及所述CTO之間的所述雜交物的Tm值。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于， 所述靶信號(hào)在所述延長(zhǎng)反應(yīng)期間由插入在所述延長(zhǎng)雙鏈體內(nèi)的單一標(biāo)記來(lái)提供； 所述插入的單一標(biāo)記與在所述延長(zhǎng)反應(yīng)期間插入的核苷酸連接； 在步驟(d)中，通過(guò)延長(zhǎng)所述片段，誘導(dǎo)來(lái)自所述單一標(biāo)記的信號(hào)的變化來(lái)提供步驟(d)中的所述靶信號(hào)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，在所述延長(zhǎng)反應(yīng)期間插入的所述核苷酸具有第一非-天然堿基； 所述CTO具有核苷酸，該核苷酸具有對(duì)所述第一非-天然堿基有著特異結(jié)合親和性的第二非_天然堿基。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于， 所述靶信號(hào)由在所述延長(zhǎng)反應(yīng)期間插入在所述延長(zhǎng)雙鏈體內(nèi)的標(biāo)記和所述片段和/或與所述CTO連接的標(biāo)記來(lái)提供； 所述插入的標(biāo)記與在所述延長(zhǎng)反應(yīng)期間插入的核苷酸連接； 所述兩個(gè)標(biāo)記為報(bào)道分子以及猝滅分子的相互作用性雙重標(biāo)記； 在步驟(d)中，通過(guò)延長(zhǎng)所述片段，誘導(dǎo)來(lái)自所述相互作用性雙重標(biāo)記的信號(hào)的變化來(lái)提供所述靶信號(hào)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于， 在所述延長(zhǎng)反應(yīng)期間插入的所述核苷酸具有第一非-天然堿基； 所述CTO具有核苷酸，該核苷酸具有對(duì)所述第一非-天然堿基有著特異結(jié)合親和性的第二非_天然堿基。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述上游寡核苷酸為上游引物或者上游探針。
18.根據(jù)權(quán)利要求1`所述的方法，其特征在于，所述方法還包括重復(fù)進(jìn)行步驟(a)-步驟(b)、步驟(a)_步驟(d)或者步驟(a)_步驟(e)的步驟，并且在重復(fù)循環(huán)之間包括變性。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)-(f)在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)或幾個(gè)分開(kāi)的反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于， 所述方法是為了檢測(cè)至少兩種靶核酸序列而實(shí)施； 所述上游寡核苷酸包含至少兩種寡核苷酸； 所述PTO包含至少兩種PTO ； 所述CTO包含至少一種CT0。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述CTO通過(guò)其5’-末端或者3’-末端在固相基質(zhì)上實(shí)現(xiàn)固定化。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述靶信號(hào)由與所述片段連接的單一標(biāo)記或者在所述延長(zhǎng)反應(yīng)期間插入到所述延長(zhǎng)雙鏈體內(nèi)的單一標(biāo)記提供。
23.根據(jù)權(quán)利要求1至22中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法在存在下游引物的情況下實(shí)施。
24.—種用于借助PTOCE (ΡΤ0切割和延長(zhǎng))試驗(yàn)來(lái)從DNA或者核酸混合物中檢測(cè)靶核酸序列的試劑盒，其特征在于，包含: Ca)上游寡核苷酸；所述上游寡核苷酸包含與所述靶核酸序列互補(bǔ)的雜交核苷酸序列； (b)PTO (探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸);所述PTO包含:(i) 3’ -靶向部位，其包含與所述靶核酸序列互補(bǔ)的雜交核苷酸序列；以及(ii )5’_標(biāo)記部位，其包含與所述靶核酸序列非-互補(bǔ)的核苷酸序列；所述3’ -靶向部位與所述靶核酸序列雜交，所述5’ -標(biāo)記部位不與所述靶核酸序列雜交；所述上游寡核苷酸位于所述PTO的上游；所述上游寡核苷酸或者其延長(zhǎng)鏈誘導(dǎo)借助于具有5’核酸酶活性的酶對(duì)所述PTO的切割，從而所述切割釋放出包含所述PTO的所述5’ -標(biāo)記部位或者所述5’ -標(biāo)記部位的一部分的片段；以及 (c)CTO (捕捉和制模寡核苷酸);所述CTO沿著3’ 一 5’方向包含:(i)捕捉部位，其包含與所述PTO的所述5’-標(biāo)記部位或者所述5’-標(biāo)記部位的一部分互補(bǔ)的核苷酸序列；以及(ii)制模部位，其包含與所述PTO的所述5’ -標(biāo)記部位以及所述3’ -靶向部位非-互補(bǔ)的核苷酸序列；從所述PTO釋放出的所述片段與所述CTO的所述捕捉部位雜交；并且，與所述CTO的所述捕捉部位雜交的所述片段借助模板-依賴性核酸聚合酶而被延長(zhǎng)來(lái)形成延長(zhǎng)雙 鏈體。
【文檔編號(hào)】C12Q1/48GK103866037SQ201410132450
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月11日
【發(fā)明者】李榮祚, 其他發(fā)明人請(qǐng)求不公開(kāi)姓名 申請(qǐng)人:Seegene株式會(huì)社