具有耐酸性和高還原活性的副干酪乳桿菌fm-lp-4及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株具有耐酸性和高還原活性的副干酪乳桿菌（Lactobacillusparacasei）FM-LP-4及其用途，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。從新疆駱駝酸奶中分離、篩選到1株具有耐酸和高還原活性的副干酪乳桿菌新菌株，命名為FM-LP-4，經(jīng)鑒定為副干酪乳桿菌FM-LP-4，該菌具有較強抗氧化能力，優(yōu)良的發(fā)酵性能和較好的耐酸性能，并且具有很高的還原活性。本發(fā)明的副干酪乳桿菌FM-LP-4，對提高其作為發(fā)酵菌種的發(fā)酵制品的抗氧化性能有很大的作用，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】具有耐酸性和高還原活性的副干酪乳桿菌FM-LP-4及其用途
一、【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及具有較好的耐酸性能和較高的還原力活性的副干酪乳桿菌(Lactobacil lusparacasei)FM-LP-4及其用途,屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
二、【背景技術(shù)】
[0002]乳酸菌(Lacticacidbacteria, LAB)是一類能利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸的非病原性、革蘭氏陽性細菌的通稱，包括乳球菌(Lactococcus)、乳桿菌(Latobacillus)雙歧桿菌(Bifidobacterium)等20多個屬，是一類具有長久安全食用歷史的公認安全(GRAS)的食品級微生物，廣泛存在自然發(fā)酵乳制品、發(fā)酵植物食品及人的腸道中。由于具有特定的生理功能和適宜生物加工的屬性，是食品工業(yè)上常用的菌種，與人類關(guān)系密切。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的食品，其風(fēng)味、營養(yǎng)價值和保存期都會有所改善，并且對人體具有多方面的保健功能，如提高免疫力、緩解乳糖不耐癥、調(diào)節(jié)腸道菌群、增強抗過敏、降低膽固醇等。因此，乳酸菌已經(jīng)成為食品與藥物等相關(guān)產(chǎn)品的主要配料，用于生產(chǎn)功能性發(fā)酵食品、保健品或是抗衰老藥品。[0003]在生物體體內(nèi)存在促氧化和抗氧化的動態(tài)平衡，當(dāng)促氧化因素超出了細胞抗氧化機制的調(diào)節(jié)能力，促氧化和抗氧化的動態(tài)平衡被打破而偏向于促氧化方向時，一些自由基和活性氧的水平就會超出正常水平，由此機體和細胞就會處在一個氧化應(yīng)激(Oxidativestress)的狀態(tài)。氧化應(yīng)激與損傷與一些常見的疾病如糖尿病、高血壓、哮喘、過敏、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、慢性炎癥、癌癥等有著十分密切的關(guān)系。目前，活性氧和自由基與疾病的關(guān)系越來越受到重視，已成為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)的前沿和熱點，與之相應(yīng)的抗氧化劑開發(fā)也成為食品學(xué)科的重要課題。
[0004]從食品安全性上考慮，天然抗氧化物質(zhì)具有合成抗氧化劑無法比擬的優(yōu)勢，現(xiàn)已成為當(dāng)今食品開發(fā)的重要方向。乳酸菌是長久安全食用的公認安全(GRAS)的食品級微生物，其代謝過程中分泌出一些具有抗氧化活性的酶類同樣具有高度安全性。另外，乳酸菌還可以利用環(huán)境中的天然物質(zhì)如阿魏酸、谷胱甘肽、半胱氨酸等產(chǎn)生抗氧化能力。開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗氧化功能的乳酸菌種將會是今后科技攻關(guān)與產(chǎn)品創(chuàng)新的重點和難點，也是一個熱點，已經(jīng)成為一個很有實際意義的研究課題。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]技術(shù)問題具有抗氧化能力的乳酸菌有發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)、植物乳桿菌(lactobaciIlus, paraplantarum,)等，但真正成功利用于發(fā)酵功能食品只有為數(shù)不多的幾株菌，其中包括發(fā)酵乳桿菌ME-3，299v菌株。針對這一現(xiàn)狀，本發(fā)明提供一株具有耐酸性能且具有高還原活性的副干酪乳桿菌菌株FM-LP-4及其用法，用于抗氧化功能發(fā)酵食品的開發(fā)。
[0006]技術(shù)方案本發(fā)明涉及一株具有耐酸性能強和高還原力的副干酪乳桿菌新菌株及其用法，其內(nèi)容和實施方案如下:[0007]—株具有耐酸性和高還原活性的副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)FM-LP-4，該菌株于2013年12月18在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，保藏號是CGMCCNO:8600o
[0008]所述的副干釀乳桿菌(Lactobacillus paracasei)FM-LP-4可以作為發(fā)酵菌種的應(yīng)用。
[0009]用所述的副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)FM-LP-4制備的發(fā)酵劑。
[0010]用所述的副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)FM-LP-4發(fā)酵獲得的發(fā)酵酸奶產(chǎn)品。
[0011]用 所述的副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)FM_LP_4發(fā)酵制作的泡菜產(chǎn)
品O
[0012]有益效果
[0013]本發(fā)明以MRS培養(yǎng)基為篩選培養(yǎng)基，從新疆駱駝酸奶、酸馬奶、江西開菲兒發(fā)酵奶、西藏靈菇奶四種傳統(tǒng)發(fā)酵奶制品的樣品中分離篩選到150株單菌落，根據(jù)革蘭氏染色和過氧化氫接觸酶實驗結(jié)果，初步鑒定出85株乳酸菌，以DPPH清除率為初篩實驗，篩選出12株DPPH清除率大于50%的菌株。然后以Fe2+螯合能力、Cu2+螯合能力、還原活性測定實驗、總超氧化化物歧化酶活力測定試驗、谷胱甘肽過氧化物酶活性測定試驗、膽鹽耐受性試驗、耐酸性試驗進行復(fù)篩，綜合復(fù)篩試驗結(jié)果，篩選出一株具有耐酸性能好和高還原力的乳酸菌，命名為FM-LP-4，通過測定16srDNA序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析和生理生化試驗鑒定該菌株，鑒定結(jié)果是該菌株為副干酪乳桿菌。
[0014]本發(fā)明提供一株新的副干酪乳桿菌菌株FM-LP-4，該菌株不僅具有較好的耐酸性能和高還原力；并且該菌株具有較好的發(fā)酵性能，可以作為發(fā)酵菌種進行奶制品發(fā)酵，經(jīng)該菌株發(fā)酵的酸奶，其抗氧化性能顯著提高；還可以利用該菌株進行泡菜發(fā)酵，經(jīng)該菌株發(fā)酵制作的泡菜的抗氧化能力也顯著提高，為抗氧化保健食品的開發(fā)提供可靠的菌株資源。
[0015]本發(fā)明的主要優(yōu)點和積極效果如下:
[0016]1.副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)FM-LP-4,分離自新疆牧民家中的傳統(tǒng)的駱駝酸奶中，來源比較安全。
[0017]2.副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)FM_LP_4,具有較高的抗氧化活性，特別是還原力較高，并且具有較好的耐酸能力和發(fā)酵性能，可作為發(fā)酵菌種進行奶制品及蔬菜的發(fā)酵，提高發(fā)酵制品的抗氧化能力。
[0018]3.經(jīng)測定，菌株FM-LP-4的還原活性特別高，相當(dāng)于356.88uM的半胱氨酸的還原活性，在菌體密度為1.01X109w 1.54X 109cfu/ml條件下，在目前已發(fā)表的文獻中還未見到具有如此高還原活性的菌株。另外，菌株FM-LP-4的總超氧化物歧化酶的活力和谷胱甘肽過氧化物酶的活力也很高，分別為8.85U/ml和799.56U/ml，綜合測定的體外抗氧化性能實驗結(jié)果，F(xiàn)M-LP-4是一株具有高抗氧化活性的菌株，特別是其還原活性特別高。
[0019]4.試驗證明，菌株FM-LP-4比較耐酸，在PH(2.5)的PBS緩沖液中保持4h，菌體密度仍能保持在1.61X108cfu/ml ;其耐膽鹽能力也較強，在牛膽汁鹽含量為0.5% (w/v)、PH(8.0)的PBS緩沖液中保持4h，菌體密度能保持在1.12X 107cfu/ml。
[0020]FM-LP-4接種酸奶的凝乳時間比商業(yè)酸奶的凝乳時間長約0.6h，其發(fā)酵奶的粘度高于接種商業(yè)酸奶的粘度。經(jīng)FM-LP-4發(fā)酵的酸奶的抗氧化性能顯著提高，其DPPH的清除率是商業(yè)發(fā)酵劑發(fā)酵酸奶的2.18倍，混合接種的酸奶的DPPH的清除率也有1.92倍的提高；經(jīng)FM-LP-4發(fā)酵的酸奶的還原活性是商業(yè)酸奶發(fā)酵劑的5.0l倍，混合接種的酸奶還原活性也有3倍的提高?？梢奆M-LP-4能顯著提高酸奶的抗氧化性能。
[0021]FM-LP-4接種發(fā)酵泡菜的產(chǎn)酸能力強，相同的發(fā)酵時間內(nèi)，泡菜汁的pH值比自然發(fā)酵的泡菜的PH值低約0.9，經(jīng)FM-LP-4發(fā)酵的泡菜的抗氧化能力顯著提高，其DPPH的清除率是自然發(fā)酵的泡菜的2.04倍，是未發(fā)酵包菜的5.07倍，經(jīng)FM-LP-4發(fā)酵的泡菜的還原活性是自然發(fā)酵包菜的3.19倍，是未發(fā)酵包菜的12.04倍。發(fā)酵泡菜的感觀評定高于自然發(fā)酵的泡菜。
四、【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1FM-LP-4平板菌落形態(tài)
[0023]圖2FM-LP-4 菌體形態(tài)(10 X 100)
[0024]圖3FM-LP-4不同培養(yǎng)時期的菌液狀態(tài)
[0025]生物保藏
[0026]FM-LP-4,副干釀乳桿菌(Lactobacillus paracasei),于 2013 年 12 月 18 在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所，保藏號是CGMCC NO:8600o
五、【具體實施方式】
[0027]1、菌株的篩選
[0028]從新疆駱駝酸奶、酸馬奶、江西開菲兒發(fā)酵奶、西藏靈菇奶四種傳統(tǒng)發(fā)酵奶制品中取樣，將樣品用無菌水進行梯度稀釋(10_\10_2、10_3、10_4、10_5、10_6)，取后四個梯度稀釋樣品IOOul均勻涂布至MRS瓊脂培養(yǎng)基上，每個梯度做3個平行，35°C恒溫培養(yǎng)48h，挑選具有典型乳酸菌菌落形態(tài)的單菌落在MRS平板上進行劃線純化，傳代3-4次，經(jīng)鏡檢為純種后，結(jié)合菌落形態(tài)，革蘭氏染色和接觸酶試驗，初篩獲得85株乳酸菌。挑單菌落接種MRS液體培養(yǎng)基，35°C靜止培養(yǎng)18h，4°C條件下5000rpm/min離心5min，收集菌體，以無菌生理鹽水洗滌菌體兩次，再以無菌生理鹽水調(diào)整菌體密度為LOIxIO9M 1.54X IO9Cfu/ml，以清除DPPH試驗為初篩實驗，篩選出12株DPPH清除率在50 %的乳酸菌，將其依次編號為 FM-LP-1、FM-LP-2、FM-LP-3、FM-LP-4、FM-LP-5、FM-LP-6、FM-LP-7、FM-LP-8、FM-LP-9、FM-LP-10, FM-LP-1U FM-LP-12?將上述獲得的菌株分別以2 %的接種量(菌體含量在1.02X IO7 ^ 3.01X107cfu/ml)接種至20mlMRS液體培養(yǎng)基中，35 °C靜止培養(yǎng)18h,4°C條件下5000rpm/min離心5min,收集菌體，以無菌生理鹽水洗漆菌體兩次，再以無菌生理鹽水調(diào)整菌體密度為1.0lXlO9 ^ 1.54X 109cfu/ml,參照JeongminLee等(J Med Food, 2005)的方法測定菌體細胞的Fe2+螯合能力、Cu2+螯合能力，參照JeongminLee等(J Med Food, 2005)和陳曉華(博士論文，2011)中的方法測定菌體細胞和還原力活性；利用南京建成生物科技有限公司的總超氧化化物歧化酶活力測定試劑盒和谷胱甘肽過氧化物酶活性測定試劑盒對篩選出的乳酸菌進行總超氧化化物歧化酶活力和谷胱甘肽過氧化物酶活性測定，具體測定方法參照說明書，結(jié)果見表1。從表1中可以看出，菌株FM-LP-4的還原活性特別高，相當(dāng)于356.88uM的半胱氨酸的還原活性，在菌體密度為1.0l X IO9 ^ 1.54X 109cfu/ml條件下，在目前已發(fā)表的文獻中還未見到具有如此高還原活性的菌株。另外，菌株FM-LP-4的總超氧化物歧化酶的活力和谷胱甘肽過氧化物酶的活力也很高，分別為8.85U/ml和799.56U/ml，綜合測定的體外抗氧化性能實驗結(jié)果，F(xiàn)M-LP-4是一株具有高抗氧化活性的菌株，特別是其還原活性特別高。
[0029]表1不同菌株的體外抗氧化指標(biāo)的測定
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一株具有耐酸性和高還原活性的副干酪乳桿菌iLactobaciIlus paracasei)FM-LP-4，該菌株于2013年12月18在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，保藏號是CGMCCNO:8600o
2.權(quán)利要求1所述的副干釀乳桿菌paracasei)FM-LP-4作為發(fā)酵菌種的應(yīng)用。
3.用權(quán)利要求1所述的副干酪乳桿菌paracasei)FM-LP-4制備的發(fā)酵劑。
4.用權(quán)利要求1所述的副干酪乳桿菌paracasei)FM-LP-4發(fā)酵獲得的發(fā)酵酸奶產(chǎn)品。
5.用權(quán)利要求1所述的副干酪乳桿菌paracasei)FM-LP-4發(fā)酵制作的泡菜產(chǎn)品。
【文檔編號】C12R1/225GK103937709SQ201410132172
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】王英, 周劍忠, 趙延存, 李清, 劉小莉, 李瑩, 張麗霞, 黃自蘇 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院