一種核酸提取磁珠的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種核酸提取磁珠的制備方法，是將磁性納米Fe3O4顆粒的表面包被一層硅羥基再分散到萬(wàn)分之二的NaN3水溶液中；制得的硅基磁珠為核殼結(jié)構(gòu)，包括Fe3O4納米顆粒內(nèi)核，SiO2外殼層，SiO2外殼層包覆在多個(gè)Fe3O4納米顆粒外表面；硅基磁珠經(jīng)超聲分散處理1h后，用納米激光粒度儀測(cè)得其二次粒徑為400nm~1μm，飽和磁化強(qiáng)度為43.0～74.5emu/g；制得的硅基磁珠應(yīng)用于新鮮動(dòng)物組織、動(dòng)物組織石蠟切片、植物葉片、種子、全血、血清游離、毛發(fā)、指甲、煙蒂、唾液、細(xì)菌或病毒等生物檢材中的核酸提取及純化。本發(fā)明的工藝流程簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，原料成本低，適宜于工業(yè)化大批量生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】—種核酸提取磁珠的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本方面屬于磁性材料制備【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種核酸提取磁珠的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]磁珠是一種包被有生物活性基團(tuán)的功能化載體，可分散于基液中形成磁性液體材料，生物活性基團(tuán)可以與多種生物活性物質(zhì)發(fā)生偶聯(lián)，兼具有液體的流動(dòng)性和固體磁性顆粒材料的雙重特點(diǎn)。磁珠在外磁場(chǎng)的作用下可以定向移動(dòng)和集中，撤去外磁場(chǎng)后，又可以恢復(fù)原來(lái)的結(jié)構(gòu)與狀態(tài)，從而使復(fù)雜的液固分離技術(shù)變得快捷簡(jiǎn)便。通過(guò)簡(jiǎn)單的洗脫即可得到純度很高的靶向物質(zhì)。目前，磁珠已被廣泛應(yīng)用于免疫分析、核酸分離提取、細(xì)胞分選、酶的固定等多個(gè)領(lǐng)域。對(duì)于核酸提取技術(shù)而言，磁珠法具有常規(guī)提取方法無(wú)法比擬的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，諸如提取和純化一步完成，定量提取，實(shí)現(xiàn)提取自動(dòng)化，對(duì)于初學(xué)者而言操作簡(jiǎn)便。
[0003]納米Fe3O4由于其制備簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性高、較強(qiáng)的超順磁性、生物相容性和表面易于修飾等特點(diǎn)，成為目前應(yīng)用最廣泛的磁珠材料之一。但是，由于納米Fe3O4的小尺寸效應(yīng)、磁偶極子引力等作用，磁性納米粒子易于團(tuán)聚，且化學(xué)穩(wěn)定性不高易受氧化，表面羥基不足，導(dǎo)致其難以直接應(yīng)用到生物領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種核酸提取磁珠的制備方法，其工藝流程簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，原料成本低，適宜于工業(yè)化大批量生產(chǎn)；制得的核酸提取磁珠，其為核殼結(jié)構(gòu)磁珠，具有良好的生物相容性，并能與核酸特異性結(jié)合；而且還提供上述核酸提取磁珠在核酸提取中的應(yīng)用。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種核酸提取磁珠的制備方法，其包括以下步驟:
SUFe3O4納米顆粒的制備
分別配制濃度為0.1~lmol/L的Fe3+和Fe2+鹽溶液，按Fe3+與Fe2+物質(zhì)的量的比為
1.5~2.0混合；上述混合液攪拌均勻后，加入0.15mol/L的聚乙二醇-8000水溶液，聚乙二醇-8000體積為Fe鹽溶液總體積的1/10-?/5，通入氬氣除氧30 min，調(diào)整反應(yīng)體系溫度60~70°C，再向混合液中滴加質(zhì)量濃度為25%氨水至體系PH值為10~11，在溫度為70~80°C條件下反應(yīng)3~6h，冷卻至室溫后，磁分離出黑色沉淀，依次用質(zhì)量濃度為I %氨水、5%NaCl及去離子水反復(fù)洗滌沉淀物數(shù)次至洗滌液為中性，-10~-20°C冷凍干燥24~48h，得到超順磁性Fe3O4納米顆粒；
其中磁性納米Fe3O4粒子顆粒分散到超純水中經(jīng)超聲分散處理Ih后，用納米激光粒度儀測(cè)得其二次粒徑為100~300nm，飽和磁化強(qiáng)度較高為57.4~79.4 emu/g ；
S2、納米硅基磁珠的制備
將步驟SI中所得的超順磁性Fe3O4納米顆粒稱取2~500g分散到0.1~3L無(wú)水乙醇中超聲波處理30?60min后，加入20?IOOOml濃度為10?50g/L的分散劑,攪拌均勻后，向混合液中加入質(zhì)量濃度為25%氨水至體系PH值為10，再滴加0.25?500ml體積比為1:1的正硅酸四乙酯與乙醇混合溶液，控制滴加速度為0.1?0.5ml/min，體系溫度為30?50°C，滴加完畢后反應(yīng)3?5h，磁分離出表面硅基修飾的Fe3O4納米顆粒，用去離子水反復(fù)洗滌數(shù)次至洗滌液PH值為6?7，超聲分散15?30min，分散在萬(wàn)分之二 NaN3水中，即得到硅基包被磁珠。
[0006]進(jìn)一步地，上述步驟S2中采用的分散劑為乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸三鈉、十六烷基溴化銨、聚乙烯吡咯烷酮中的一種或幾種混合。
[0007]上述方法制得的硅基磁珠，其為核殼結(jié)構(gòu)，包括Fe3O4納米顆粒內(nèi)核，SiO2外殼層，SiO2外殼層包覆在多個(gè)Fe3O4納米顆粒外表面；硅基磁珠經(jīng)超聲分散處理Ih后，用納米激光粒度儀測(cè)得其二次粒徑為400nm μ m，飽和磁化強(qiáng)度為43.0?74.5emu/g。
[0008]上述方法制得的核酸提取磁珠，無(wú)外加磁場(chǎng)時(shí)，呈黑色懸浮液狀態(tài)，放置有永磁鐵時(shí)，核酸提取磁珠能夠與水快速分離。
[0009]上述方法制得的核酸提取磁珠，其應(yīng)用于新鮮動(dòng)物組織、動(dòng)物組織石蠟切片、植物葉片、種子、全血、血清游離、毛發(fā)、指甲、煙蒂、唾液、細(xì)菌或病毒等生物檢材中的核酸提取及純化。
[0010]上述方法制得的核酸提取磁珠，其應(yīng)用于生物檢材中核酸提取，包括以下步驟:
(1)、裂解
取適量生物檢材樣本于EP管中，加入樣本體積f 3倍的細(xì)胞裂解液、5?20 μ I蛋白酶K，混合均勻，再把EP管置于恒溫水箱中65?80°C溫育10?30min ；
(2)、結(jié)合
將EP管從溫浴設(shè)備中取出，加入振蕩混勻的樣本體積1/15?1/10的核酸提取磁珠、樣本體積2倍的異丙醇，上下顛倒混勻，結(jié)合5?10 min，將EP管置于磁力架上進(jìn)行磁分離，吸棄廢液；
(3 )、洗漆
a、加入樣本體積3飛倍的洗滌液I，點(diǎn)振5?10次，然后磁分離，吸凈管蓋及管底的殘
液；
b、加入樣本體積2?3倍的洗滌液II，點(diǎn)振5?10次，然后磁分離，吸凈管蓋及管底的殘
液；
C、重復(fù)上述步驟b，室溫下開(kāi)蓋干燥5min ；
(4)、洗脫
加入50?300 μ I的洗脫液，緩慢抽吸混勻，65°C溫浴lOmin，每隔2?3min輕搖EP管混勻，然后磁分離，小心吸取上清液至新的EP管中，進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)；
(5)、電泳檢測(cè)
制備濃度1%瓊脂糖凝膠，取上述提取的全血基因組進(jìn)行電泳，25min后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察電泳結(jié)果。
[0011]進(jìn)一步地，上述的步驟(I)裂解中，對(duì)于動(dòng)植物組織之類的固體樣本，先研磨，離心取上清。
[0012]由于采用如上所述的技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下優(yōu)越性: 本發(fā)明核酸提取磁珠的制備方法，其采用化學(xué)共沉淀法制備Fe3O4納米顆粒，利用超聲輔助溶膠-凝膠法制備核酸提取磁珠，工藝流程簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，適于批量化生產(chǎn)；制得的核酸提取磁珠，飽和磁化強(qiáng)度較高為43.0?74.5emu/g，剩磁和矯頑力接近于零，能夠在較小的磁場(chǎng)作用下達(dá)到快速?gòu)氐椎墓桃悍蛛x效果，當(dāng)撤去外加磁場(chǎng)后又能很快到分散到溶液中；制得的核酸提取磁珠，通過(guò)在Fe3O4納米顆粒外表面包覆SiO2殼層，能很大程度地降低粒子的零電點(diǎn)和屏蔽磁偶極子的互相作用，使粒子具有良好的水溶性、化學(xué)穩(wěn)定性及生物相容性，且SiO2表面存在豐富的羥基，可使復(fù)合粒子容易進(jìn)一步生物功能化，能夠有效吸附核酸，可用于提取含有常規(guī)量核酸(動(dòng)植物、血液、細(xì)菌、質(zhì)粒等)的生物檢材，同時(shí)也能對(duì)含有痕量核酸(血清游離、毛發(fā)、指甲、煙蒂、唾液、細(xì)菌、病毒等)的樣本進(jìn)行提取與純化。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中制備的納米Fe3O4粒子的磁滯回線；
圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中制備的硅基磁珠在無(wú)磁場(chǎng)時(shí)在水中的懸浮狀態(tài)圖；
圖3是本發(fā)明實(shí)施例1中制備的硅基磁珠在外加磁場(chǎng)中放置后的分離效果圖；
圖4是本發(fā)明實(shí)施例1中制備的硅基磁珠的磁滯回線；
圖5是本發(fā)明實(shí)施例1中制備的娃基磁珠的放大200倍光學(xué)顯微鏡照片；
圖6是本發(fā)明實(shí)施例1中制備的硅基磁珠的TEM照片；
圖7是本發(fā)明實(shí)施例4中硅基磁珠應(yīng)用于全血中核酸提取后基因組的瓊脂糖凝膠電泳圖像；
圖8是本發(fā)明實(shí)施例5中硅基磁珠應(yīng)用于三葉草葉片中核酸提取后基因組的瓊脂糖凝膠電泳圖像；
圖9是本發(fā)明實(shí)施例6中硅基磁珠應(yīng)用于人血清游離DNA提取后熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014]參照以下實(shí)施例可以對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明；但是，以下實(shí)施例僅僅是例證，本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。
[0015]實(shí)施例一
一種核酸提取磁珠的制備方法，包括以下具體步驟:
SUFe3O4納米顆粒的制備
稱取無(wú)水三氯化鐵300g溶解于IL超純水中，稱取六水硫酸亞鐵銨392g溶解于IL超純水中，把兩種溶液轉(zhuǎn)入5L反應(yīng)釜中200r/min攪拌30min后，稱取45g聚乙二醇-8000溶解于400ml超純水中轉(zhuǎn)入反應(yīng)釜；通氬氣除氧30min，調(diào)整反應(yīng)溫度為60°C，調(diào)整轉(zhuǎn)速為500r/min，向溶液中滴加25%氨水至體系pH值為11，升溫至80°C，調(diào)整轉(zhuǎn)速為IOOr/min條件下反應(yīng)3h;反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，停止攪拌關(guān)閉氬氣，取出反應(yīng)物，磁分離出黑色沉淀，依次用質(zhì)量濃度為I %氨水、5%NaCl及去離子水反復(fù)洗滌沉淀物3次至洗滌液為中性，-10°C冷凍干燥48h，得到超順磁性Fe3O4納米顆粒；
S2、納米硅基磁珠的制備
稱取上述步驟SI中所得的超順磁性Fe3O4納米顆粒IOOg分散到3L無(wú)水乙醇中，超聲處理30min后，加入IL濃度為50 g/L乙二胺四乙酸鈉的水溶液；200r/min攪拌30min后，向體系中加入質(zhì)量濃度為25%氨水至體系pH值為10 ;再滴加體積比為1:1的正硅酸四乙酯與乙醇混合溶液30ml，控制滴加速度為0.5ml/min，體系溫度為50°C，滴加完畢后反應(yīng)3h ；取出反應(yīng)物，磁分離出表面硅基修飾的Fe3O4納米顆粒，用無(wú)水乙醇清洗3遍后，超純水反復(fù)洗滌數(shù)次至洗滌液pH值為7，超聲分散30min，分散在萬(wàn)分之二 NaN3水中即得到硅基包被磁珠，將其固含量調(diào)整為100mg/ml。
[0016]由圖1中納米Fe3O4粒子的磁滯回線可以看出，F(xiàn)e3O4粒子飽和磁化強(qiáng)度M高為79.4emu/g,剩磁和矯頑力接近于O,為超順磁性。
[0017]圖2是步驟S2制備的納米硅基磁珠在無(wú)外加磁場(chǎng)時(shí)在水中的黑色懸浮狀態(tài)；圖3是步驟S2制備的納米硅基磁珠在外加磁場(chǎng)時(shí)，納米硅基磁珠與水快速分離，放置后的分離狀態(tài)。
[0018]由圖4中納米硅基磁珠的磁滯回線可以看出，納米硅基磁珠飽和磁化強(qiáng)度M高為73.2emu/g，剩磁和矯頑力接近于0，為超順磁性。
[0019]由圖5可以看出，納米硅基磁珠在放大200倍的光學(xué)顯微鏡下，呈現(xiàn)較好的分散性。
[0020]由圖6可以看出，納米硅基磁珠在透射電鏡下觀察呈多分散狀態(tài)。
[0021]實(shí)施例二
一種核酸提取磁珠的制備方法，包括以下具體步驟:
SUFe3O4納米顆粒的制備 與實(shí)施例一中步驟SI相同；
S2、納米硅基磁珠的制備
稱取上述步驟SI中所得的超順磁性Fe3O4納米顆粒100 g分散到3L無(wú)水乙醇中，超聲處理30min后，加入IL濃度為50 g/L檸檬酸三鈉的水溶液；200r/min攪拌30min后，向體系中加入質(zhì)量濃度為25%氨水至體系pH值為10 ;再滴加體積比為50%正硅酸四乙酯的乙醇溶液100ml，控制滴加速度為0.5ml/min，體系溫度為30°C，滴加完畢后反應(yīng)4h ;取出反應(yīng)物，磁分離出表面硅基修飾的Fe3O4納米顆粒，用無(wú)水乙醇清洗3遍后，超純水反復(fù)洗滌數(shù)次至洗滌液PH值為7，超聲分散30min，分散在萬(wàn)分之二 NaN3水中即得到硅基包被磁珠，將其固含量調(diào)整為100mg/ml。
[0022]實(shí)施例三
一種核酸提取磁珠的制備方法，包括以下具體步驟:
SUFe3O4納米顆粒的制備 與實(shí)施例一中步驟SI相同；
S2、納米硅基磁珠的制備
稱取上述步驟SI中所得的超順磁性Fe3O4納米顆粒500 g分散到4L無(wú)水乙醇中，超聲處理30min后，加入IL濃度為50 g/L乙二胺四乙酸鈉的水溶液；200r/min攪拌30min后，向體系中加入質(zhì)量濃度為25%氨水至體系pH值為10 ;再滴加體積比為50%正硅酸四乙酯的乙醇溶液130ml，控制滴加速度為0.5ml/min，體系溫度為50°C，滴加完畢后反應(yīng)5h ;取出反應(yīng)物，磁分離出表面硅基修飾的Fe3O4納米顆粒，用無(wú)水乙醇清洗3遍后，超純水反復(fù)洗滌數(shù)次至洗滌液pH值為7，超聲分散30min，分散在萬(wàn)分之二 NaN3水中即得到硅基包被磁珠，將其固含量調(diào)整為100mg/ml。
[0023]實(shí)施例四
將上述實(shí)施例一中制得的納米硅基磁珠應(yīng)用于人全血基因組DNA的提取，具體步驟
為:
(1)、裂解
取150μ1抗凝全血于EP管中，加入30μ1的細(xì)胞裂解液、10 μ I蛋白酶K，混合均勻(可用漩渦振蕩器，1800rpm),再把EP管置于恒溫水箱中70°C溫育30min ；
(2)、結(jié)合
將EP管從溫浴設(shè)備中取出，加入振蕩混勻的納米硅基磁珠10 μ 1、異丙醇300 μ I，上下顛倒混勻5 min，將EP管置于磁力架上進(jìn)行磁分離，吸棄廢液(吸凈管蓋及管底殘液)；
(3 )、 洗漆
a、加入800μ I洗滌液I，點(diǎn)振10次(若有團(tuán)狀或絲狀物可增加點(diǎn)振次數(shù)及力度)，然后磁分離，吸凈管蓋及管底的殘液；
b、加入500μ I洗滌液II，點(diǎn)振10次(若有團(tuán)狀或絲狀物可增加點(diǎn)振次數(shù)及力度)，然后磁分離，吸凈管蓋及管底的殘液；
C、重復(fù)上述步驟b，室溫下開(kāi)蓋干燥5min ；
(4)、洗脫
加入100 μ I的洗脫液，緩慢抽吸混勻，70°C溫浴5min，每隔3min輕搖EP管混勻，然后磁分離，小心吸取上清液至新的EP管中，進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)；
(5)、電泳檢測(cè)
制備濃度1%瓊脂糖凝膠，取上述提取的全血基因組進(jìn)行電泳，25min后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察電泳結(jié)果，由圖7可以看出，電泳圖中條帶均為平行樣，提取結(jié)果批間差異小，產(chǎn)量及純度高。
[0024]實(shí)施例五
將上述實(shí)施例一中制得的納米硅基磁珠應(yīng)用于植物基因組DNA的提取，具體步驟為:
(1)、裂解
取新鮮三葉草葉片IOOmg,于研缽中稍加研磨至無(wú)塊狀,加入400μ1細(xì)胞裂解液、5 μL蛋白酶κ、10 μι DTT,研磨均勻，然后轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中，混合均勻(可用鏇潤(rùn)振蕩器，1200rpm),再把EP管置于恒溫水箱中65°C溫育30min ；
(2)、結(jié)合
將EP管從溫浴設(shè)備中取出，12000r離心10min ;取200 μL上清，加入振蕩混勻的納米硅基磁珠10 μ 1、結(jié)合液200 μ I (也可加入200μ1異丙醇，產(chǎn)量高于結(jié)合液，但是提取雙子葉植物種子的核酸時(shí),異丙醇的量為上清體積的0.6倍為宜)，上下顛倒混勻5 min,將EP管置于磁力架上進(jìn)行磁分離，吸棄廢液(吸凈管蓋及管底殘液)；
(3 )、洗漆
a、加入500μ I洗滌液I，點(diǎn)振10次(若有團(tuán)狀或絲狀物可增加點(diǎn)振次數(shù)及力度)，然后磁分離，吸凈管蓋及管底的殘液；
b、加入500μ I洗滌液II，點(diǎn)振10次(若有團(tuán)狀或絲狀物可增加點(diǎn)振次數(shù)及力度)，然后磁分離，吸凈管蓋及管底的殘液；C、重復(fù)上述步驟b，室溫下開(kāi)蓋干燥5min ；
(4)、洗脫
加入100 μ I的洗脫液，緩慢抽吸混勻，65°C溫浴lOmin，每隔3min輕搖EP管混勻，然后磁分離，小心吸取上清液至新的EP管中，進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)；
(5)、電泳檢測(cè)
制備濃度1%瓊脂糖凝膠，取上述提取的全血基因組進(jìn)行電泳，25min后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察電泳結(jié)果，由圖7可以看出，電泳圖中條帶均為平行樣，提取結(jié)果批間差異小，產(chǎn)量及純度高。
[0025]實(shí)施例六
將上述實(shí)施例一中制得的納米硅基磁珠應(yīng)用于人血清游離DNA的提取，具體步驟為:
(1)、裂解
a、對(duì)于易裂解樣本，取200μ1血清到1.5mlEP管中，加入200μ1細(xì)胞裂解液、ΙΟμΙ蛋白酶K，混合均勻(可用漩渦振蕩器，1800rpm)，然后把EP管置于恒溫水箱中80°C溫育lOmin，每隔3min，混勻一次；b、對(duì)于難裂解樣本，取300μ1血清到1.5mlEP管中，加入200μ1細(xì)胞裂解液、ΙΟμΙ蛋白酶K，混合均勻(可用漩渦振蕩器，ISOOrpm)，然后把EP管置于恒溫水箱中80°C溫育IOmin,每隔3min,混勻一次；
(2)、結(jié)合
a、對(duì)于易裂解樣本，將EP管從溫浴設(shè)備中取出，加入振蕩混勻的納米硅基磁珠20μ1、異丙醇100 μL ;b、對(duì)于難裂解樣本，將EP管從溫浴設(shè)備中取出，加入振蕩混勻的納米硅基磁珠20μ1、異丙醇150 μL ;室溫下顛倒混勻，結(jié)合5min，將EP管置于磁力架上進(jìn)行磁分離，吸棄廢液(吸凈管蓋及管底殘液);
(3 )、洗漆
a、加入800μ I洗滌液I，點(diǎn)振10次(若有團(tuán)狀或絲狀物可增加點(diǎn)振次數(shù)及力度)，然后磁分離，吸凈管蓋及管底的殘液；
b、加入800μ I洗滌液II，點(diǎn)振10次(若磁珠有結(jié)塊現(xiàn)象，加大震蕩力度和洗滌時(shí)間，盡量使磁珠分散)，然后磁分尚，吸凈管蓋及管底的殘液；
C、將EP管置于磁力架上，晾干若干分鐘，至沒(méi)有乙醇味道，一般為lOmin，根據(jù)室內(nèi)溫度和濕度可適當(dāng)延長(zhǎng)或縮短晾干時(shí)間；
(4)、洗脫
加入100 μ I的洗脫液，緩慢抽吸混勻，65°C溫浴lOmin，每隔3min輕搖EP管混勻，然后磁分離，小心吸取上清液至新的EP管中，進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)；
(5)、電泳檢測(cè)
制備濃度1%瓊脂糖凝膠，取上述提取的全血基因組進(jìn)行電泳，25min后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察電泳結(jié)果。
[0026] 納米硅基磁珠應(yīng)用于人血清游離DNA提取后熒光定量PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)，如以下表1所示，與之對(duì)應(yīng)的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖如圖9所示，可以看出PCR擴(kuò)增的效率高、CT值
差異小。
【權(quán)利要求】
1.一種核酸提取磁珠的制備方法，其特征是:其包括以下步驟: SUFe3O4納米顆粒的制備 分別配制濃度為0.1~lmol/L的Fe3+和Fe2+鹽溶液，按Fe3+與Fe2+物質(zhì)的量的比為1.5~2.0混合；上述混合液攪拌均勻后，加入0.15mol/L的聚乙二醇-8000水溶液，聚乙二醇-8000體積為Fe鹽溶液總體積的1/10-?/5，通入氬氣除氧30 min，調(diào)整反應(yīng)體系溫度60~70°C，再向混合液中滴加質(zhì)量濃度為25%氨水至體系PH值為10~11，在溫度為70~80°C條件下反應(yīng)3~6h，冷卻至室溫后，磁分離出黑色沉淀，依次用質(zhì)量濃度為1%氨水、5%NaCl及去離子水反復(fù)洗滌沉淀物數(shù)次至洗滌液為中性，-10~-20°C冷凍干燥24~48h，得到超順磁性Fe3O4納米顆粒； 其中磁性納米Fe3O4粒子顆粒分散到超純水中經(jīng)超聲分散處理Ih后，用納米激光粒度儀測(cè)得其二次粒徑為100~300nm，飽和磁化強(qiáng)度較高為57.4~79.4 emu/g ； S2、納米硅基磁珠的制備 將步驟SI中所得的超順磁性Fe3O4納米顆粒稱取2~500g分散到0.1~3L無(wú)水乙醇中超聲波處理30~60min后，加入20~1000ml濃度為10~50g/L的分散劑,攪拌均勻后，向混合液中加入質(zhì)量濃度為25%氨水至體系PH值為10，再滴加0.25~500ml體積比為1:1的正硅酸四乙酯與乙醇混合溶液，控制滴加速度為0.1~0.5ml/min，體系溫度為30~50°C，滴加完畢后反應(yīng)3~5h，磁分離出表面硅基修飾的Fe3O4納米顆粒，用去離子水反復(fù)洗滌數(shù)次至洗滌液PH值為6~7，超聲分散15~30min，分散在萬(wàn)分之二 NaN3水中，即得到硅基包被磁珠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸提取磁珠的制備方法，其特征是:步驟S2中采用的分散劑為乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸三鈉、十六烷基溴化銨、聚乙烯吡咯烷酮中的一種或幾種組入口 ο
3.—種權(quán)利要求1所述的制備方法制得的核酸提取磁珠，其特征是:其為核殼結(jié)構(gòu)，包括Fe3O4納米顆粒內(nèi)核，SiO2外殼層，SiO2外殼層包覆在多個(gè)Fe3O4納米顆粒外表面；娃基磁珠經(jīng)超聲分散處理Ih后，用納米激光粒度儀測(cè)得其二次粒徑為400nm μ m,飽和磁化強(qiáng)度為 43.0 ~74.5emu/g ο
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸提取磁珠，其特征是:無(wú)外加磁場(chǎng)時(shí)，呈黑色懸浮液狀態(tài)，放置有永磁鐵時(shí)，核酸提取磁珠能夠與水快速分離。
5.一種權(quán)利要求3所述的核酸提取磁珠的應(yīng)用，其特征是:其應(yīng)用于新鮮動(dòng)物組織、動(dòng)物組織石蠟切片、植物葉片、種子、全血、血清游離、毛發(fā)、指甲、煙蒂、唾液、細(xì)菌或病毒等生物檢材中的核酸提取及純化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸提取磁珠的應(yīng)用，其特征是:其應(yīng)用于生物檢材中核酸提取，包括以下步驟: (1)、裂解 取適量生物檢材樣本于EP管中，加入樣本體積f 3倍的細(xì)胞裂解液、5~20 μ I蛋白酶K，混合均勻，再把EP管置于恒溫水箱中65~80°C溫育10~30min ； (2)、結(jié)合 將EP管從溫浴設(shè)備中取出，加入振蕩混勻的樣本體積1/15~1/10的核酸提取磁珠、樣本體積2倍的異丙醇，上下顛倒混勻，結(jié)合5~10 min，將EP管置于磁力架上進(jìn)行磁分離，吸棄廢液；
(3 )、洗漆 a、加入樣本體積3飛倍的洗滌液I，點(diǎn)振5~10次，然后磁分離，吸凈管蓋及管底的殘液； b、加入樣本體積2~3倍的洗滌液II，點(diǎn)振5~10次，然后磁分離，吸凈管蓋及管底的殘液； C、重復(fù)上述步驟b，室溫下開(kāi)蓋干燥5min ； (4)、洗脫 加入50~300 μ I的洗脫液，緩慢抽吸混勻，65°C溫浴lOmin，每隔2~3min輕搖EP管混勻，然后磁分離，小心吸取上清液至新的EP管中，進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)； (5)、電泳檢測(cè) 制備濃度1%瓊脂糖凝膠，取上述提取的全血基因組進(jìn)行電泳，25min后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察電泳結(jié)果。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸提取磁珠的應(yīng)用，其特征是:步驟(1)裂解中，對(duì)于動(dòng)植物組織之類的固體樣本,先研磨,離心取上清。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103908945SQ201410125272
【公開(kāi)日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】杜德光, 馮凌云, 齊存森, 艾振江, 肖理慧, 馮愛(ài)青 申請(qǐng)人:洛陽(yáng)惠爾納米科技有限公司