一株殼聚糖酶產(chǎn)生菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一株殼聚糖酶產(chǎn)生菌——Mitsuaria?sp.GD02-M41及其應(yīng)用，該菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)，郵政編碼：430072，保藏日期：2014年3月19日，保藏編號(hào)：CCTCC?No：M2014095。本發(fā)明經(jīng)篩選誘變獲得的一株殼聚糖酶產(chǎn)生菌——Mitsuaria?sp.GD02-M41產(chǎn)生的殼聚糖酶為內(nèi)切酶，酶解殼聚糖后不產(chǎn)生氨基葡萄糖，相比于化學(xué)水解方式，能在更短時(shí)間內(nèi)獲得殼寡糖，且無(wú)污染、條件溫和，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一株殼聚糖酶產(chǎn)生菌及其應(yīng)用
[0001](一)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一株殼聚糖酶產(chǎn)生菌——Mitsuaria sp.⑶02-M41，及其在微生物酶解殼聚糖制備殼寡糖中的應(yīng)用。
[0003](二)【背景技術(shù)】
[0004]殼聚糖(Chitosan)為幾丁質(zhì)脫乙酰化后的產(chǎn)物，溶解性能較幾丁質(zhì)有很大提高，具有良好生物相容性。殼寡糖(Chito-oligosaccharide) —般是指2~10個(gè)聚合度的低糖，可通過(guò)殼聚糖水解制得，具有較低的分子量，呈水溶性，非常容易被人體吸收，作為一種功能性低聚糖，具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)人體免疫及抗癌等功效，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0005]目前制備殼寡糖的方法主要有化學(xué)降解法和酶解法，采用化學(xué)法降解寡糖得率低，產(chǎn)物分離困難，而且對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重。酶解法則具有反應(yīng)條件溫和，寡糖得率高，不造成環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)。殼聚糖水解酶主要有殼聚糖酶、N-乙酰葡萄糖胺酶以及非專一性水解酶等。殼聚糖酶是殼聚糖的專一性水解酶，能特異性將殼聚糖水解成聚合度為2~8的殼寡糖，是制備殼寡糖的主要研究方向。
[0006]殼聚糖具有廣譜抗菌性，而且對(duì)人體無(wú)毒無(wú)副作用，不同分子量的殼聚糖的抗菌性能有所差異。如 管云林等采用Staphylococcus aureus作為試驗(yàn)菌株,發(fā)現(xiàn)隨殼聚糖的分子量降低抗菌性能增強(qiáng)，并由此提出了殼聚糖抗菌的兩個(gè)模型。夏文水等采用Escherichiacoli作為試驗(yàn)菌株，發(fā)現(xiàn)隨分子量上升抑制菌效果逐漸下降，而且通過(guò)試驗(yàn)測(cè)定分子量為1500的殼寡糖抑菌效果最強(qiáng)。Keisuke U等報(bào)道平均分子量小于5000的殼聚糖對(duì)Staphylococcus aureus和Escherichia coli不僅沒(méi)有抗菌作用，反而能促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)，而分子量約9300的殼聚糖幾乎可以完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。Yousook等報(bào)道分子量為4萬(wàn)的殼聚糖在濃度為 0.5% 時(shí),對(duì) Staphylococcus aureus 和 Escherichia coli 的殺滅率為 90%，分子量為18萬(wàn)的殼聚糖在濃度為500ppm時(shí)，對(duì)Staphylococcus aureus和Escherichiacoli的殺菌率幾乎為100%。楊玉紅曾報(bào)道相對(duì)分子質(zhì)量分別為500、2100、3700、5200、9000的殼寡糖對(duì)Escherichia coli的抑制作用，發(fā)現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量2100的殼寡糖對(duì)大腸桿菌抗菌作用最強(qiáng)，其抑菌作用隨殼寡糖質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。
[0007](三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]發(fā)明目的是提供經(jīng)篩選誘變獲得的一株殼聚糖酶產(chǎn)生菌一Mitsuariasp.GD02-M41，及其在微生物酶解殼聚糖制備殼寡糖中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0010]一株殼聚糖酶產(chǎn)生菌——Mitsuaria sp.⑶02-M41，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，郵政編碼:430072，保藏日期:2014年3月19日，保藏編號(hào):CCTCC No:M2014095o
[0011]本發(fā)明篩選到一株產(chǎn)殼聚糖酶菌株，對(duì)該菌株進(jìn)行紫外誘變育種，經(jīng)補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)，殼聚糖酶產(chǎn)量最大達(dá)4.86U/ml，并研究了采用該菌株產(chǎn)生的殼聚糖酶制備殼寡糖的可能性，測(cè)定了殼聚糖不同酶解時(shí)間產(chǎn)物的平均聚合度和分子量，考察了殼寡糖對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的抗菌性能,為專一'I"生酶促生產(chǎn)殼寡糖打下基礎(chǔ)。
[0012]本發(fā)明還涉及所述的Mitsuaria sp.⑶02-M41在微生物酶解殼聚糖制備殼寡糖中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明經(jīng)篩選誘變獲得的一株殼聚糖酶產(chǎn)生菌——Mitsuaria sp.⑶02-M41產(chǎn)生的殼聚糖酶為內(nèi)切酶，酶解殼聚糖后不產(chǎn)生氨基葡萄糖，相比于化學(xué)水解方式，能在更短時(shí)間內(nèi)獲得殼寡糖，且無(wú)污染、條件溫和，具有良好的應(yīng)用前景。
[0014](四)【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為Mitsuaria sp.⑶02的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；
[0016]圖2為水解時(shí)間對(duì)殼寡糖完全水解的影響；
[0017]圖3為發(fā)酵時(shí)間對(duì)殼寡糖完全水解的影響；
[0018]圖4為 HCl濃度對(duì)殼寡糖完全水解的影響；
[0019]圖5為TLC薄層層析;1，7:氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品；2:酶解5min ；3:酶解IOmin ；4:酶解 20min ；5:酶解 30min ；6:酶解 60min ；
[0020]圖6為殼聚糖/殼寡糖對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響；
[0021]圖7為殼聚糖/殼寡糖對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響；
[0022]圖8為殼聚糖/殼寡糖對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響。
[0023](五)【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0025]實(shí)施例1:
[0026]1.材料與方法
[0027]1.1 試劑
[0028]殼聚糖(脫乙酰度90.14%，浙江玉環(huán)海洋生化有限公司)；鹽酸氨基葡萄糖(分析純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海試劑公司)；3，5-二硝基水楊酸(化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；GF254硅膠板(青島海洋化工廠)；其他試劑均為分析純。
[0029]1.2培養(yǎng)基
[0030]殼聚糖液體培養(yǎng)基:殼聚糖10g/L，K2HPO4L Og/L, (NH4) 2S042.0g/L, NaH2P042.0g/L, CaCl20.lg/L, MgSO40.5g/L，溶劑為水，ρΗ6.0，110°C滅菌 20min。
[0031]牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:3g/L牛肉膏，lOg/L蛋白胨，5g/L NaCl，溶劑為水，pH7.0~
7.2，120°C滅菌 20min。
[0032]膠體殼聚糖:lg殼聚糖中加入3mL的lmol/L HCl,加蒸懼水至IOOmL,調(diào)pH至6.5,配成1%的膠體殼聚糖。
[0033]1.3 方法
[0034]1.3.1殼聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選
[0035]取采自浙江玉環(huán)海洋生化有限公司的廢棄蝦殼堆積地的土樣Ig加入盛有IOmL無(wú)菌水的試管中，搖勻后取0.2mL上清液加入到初篩平板中，涂布均勻，在37°C下培養(yǎng)四天。取出觀察菌落的生長(zhǎng)情況和透明圈大小，取生長(zhǎng)良好以及生長(zhǎng)圈較大的單菌落，接至膠體殼聚糖平板，培養(yǎng)3天后取出平板，測(cè)量各菌落直徑(d)和其透明圈的直徑(D)，以D/d的比值作為菌株產(chǎn)殼聚糖酶能力的指標(biāo)。將平板初篩所得的各菌株分別接至裝IOOmL膠體殼聚糖液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30°C、150rpm培養(yǎng)48h后，取樣測(cè)定發(fā)酵液的酶活力。結(jié)合平板篩選的結(jié)果，挑取酶活力最高的菌株，觀察菌體形態(tài)并做進(jìn)一步鑒定。
[0036]1.3.2殼聚糖酶活力的測(cè)定
[0037]將1%的殼聚糖溶液與適量酶液混合，在37 °C下反應(yīng)lOmin，沸水浴5min滅活，加入ImL0.25mol/L NaOH使未降解的殼聚糖沉淀，5000 X g離心10min，去除沉淀，取上清液ImL于新試管中，加入1.5mL DNS和2mL蒸餾水搖勻，沸水浴反應(yīng)5min取出冷卻，測(cè)定OD540nm,以氨基葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖含量。一個(gè)酶單位定義為在37°C，反應(yīng)Imin水解產(chǎn)生Iumol還原糖所需的酶量。
[0038]1.3.3殼聚糖酶產(chǎn)生菌的誘變育種
[0039]將培養(yǎng)了 48小時(shí)的菌液5000Xg，4°C離心10min，用0.85%無(wú)菌生理鹽水稀釋濃度至108個(gè)/mL，采用紫外誘變(功率30W，照射距離為35cm)不同時(shí)間，將處理后的菌懸液適當(dāng)稀釋后，取上述懸液0.1mL涂布于固體培養(yǎng)基上，30°C避光培養(yǎng)3d，通過(guò)計(jì)算透明圈直徑和菌落直徑的比值，初篩出優(yōu)良菌株。將初篩的優(yōu)良菌株接種至殼聚糖液體培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩(30 V，200rpm,培養(yǎng)72h)，檢測(cè)發(fā)酵液中的殼聚糖酶的活性，選育出酶活性較高的菌株，作為第二輪篩選的出發(fā)菌株，第二輪誘變方法與第一輪相同。
[0040]1.3.4殼聚糖酶產(chǎn)生菌的補(bǔ)料液體發(fā)酵
[0041]將2L殼聚糖培養(yǎng)基到瑞士比歐KLF20002.5L發(fā)酵罐中110°C滅菌20min。將突變株M41進(jìn)行搖瓶發(fā)酵48h后，將種子液加入發(fā)酵罐中，接種量10%，設(shè)定溶氧100%，轉(zhuǎn)速105，并且轉(zhuǎn)速和溶氧連動(dòng)，空氣流量100，溫度30°C，發(fā)酵時(shí)間127h。在發(fā)酵72h時(shí)開(kāi)始以Iml/min補(bǔ)料2%的殼聚糖。記錄發(fā)酵數(shù)據(jù)，在不同時(shí)間取樣測(cè)定酶活力、總糖及殘?zhí)?。總糖包括發(fā)酵液中所有的糖，殘?zhí)侵饕獮榭杀痪w直接利用的單糖，總糖含量采用鹽酸酸解法測(cè)定，殘?zhí)呛坎捎肈NS法測(cè)定。
[0042]1.3.5殼聚糖酶液的制備
[0043]將培養(yǎng)了 48小時(shí)的菌液5000 X g，4 °C離心30min，去除沉淀，得到粗酶液，用硫酸銨以90%飽和度鹽析，靜置6小時(shí)后，4 °C，20000 X g離心30min。得到的沉淀用20mL0.02mol/l pH6.0PBS溶解，然后放入透析袋中用相同的PBS透析脫鹽過(guò)夜，得到殼聚糖酶液，并測(cè)定其蛋白濃度和酶活力。
[0044]1.3.6殼聚糖酶解產(chǎn)物的制備
[0045]將10mg/mL的殼聚糖溶液與lU/mL殼聚糖酶液等體積混合，在37°C下反應(yīng)，分別在5min, IOmin, 20min, 30min, 60min取出反應(yīng)液,分光光度法測(cè)定酶解后殼聚糖的分子量與聚
I=I /又 ο
[0046]1.3.7殼低聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定
[0047]取ImL酶 解液用DNS法測(cè)定0D540nm，記為A0。另取反應(yīng)液0.2mL,加入6mol/LHCL溶液3mL，置于沸水中反應(yīng)2h，用適量的6mol/L NaOH溶液中和后，蒸餾水稀釋至10mL。取稀釋后的水解液3mL，與DNS反應(yīng)，測(cè)得吸光度A1,如果Atl與A1處于標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi)，則殼低聚糖的平均聚合度為=Ii=IOA1ZAci
[0048]由此可以計(jì)算出該殼低聚糖的平均相對(duì)分子質(zhì)量為A0-1)18。
[0049]式中，179為氨基葡萄糖單兀的相對(duì)分子質(zhì)量，18為水的相對(duì)分子質(zhì)量。
[0050]1.3.8TLC 薄層層析
[0051]準(zhǔn)確吸取各時(shí)間段的反應(yīng)液IuL以及1%的氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)于高效硅膠板GF254上(25cm*10cm),距底端距離為1.5cm。置于預(yù)飽和好的層析缸中，上行法展開(kāi)。展開(kāi)時(shí)間為2小時(shí)，展距15cm。取出，用吹風(fēng)機(jī)吹干，浸滯法顯色。終點(diǎn)呈綜紅色。顯色劑為:
0.5%的茚三酮丙酮溶液，展層劑為:乙酸乙酯:甲醇:水:氨水=5:9:1:1.5。
[0052]1.3.9抑菌性能檢測(cè):
[0053]將酶解后獲得的殼寡糖液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮4倍，與2X牛肉膏培養(yǎng)基各取適量配制成殼寡糖終濃度分別為0.25%,0.5%、0.75%、1%的培養(yǎng)基，分別加入0.2mL的OD=L 5的大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae), 37°C，200rpm 搖床培養(yǎng) 24 小時(shí)后，在 0D660nm 下測(cè)其吸光度，記錄數(shù)據(jù)，以加入0.2mL無(wú)菌水的培養(yǎng)基為對(duì)照。
[0054]2結(jié)果與分析
[0055]2.1菌種鑒定
[0056]將初篩平板上透明圈明顯的單菌落接入殼聚糖液體培養(yǎng)基進(jìn)一步檢測(cè)，其中菌株GD02的降解效果最優(yōu) 。該菌株在殼聚糖固體培養(yǎng)基平板上形成的菌落為圓形，淡黃色，菌落表面光滑。菌體呈短桿狀，革蘭氏染色陰性，好氧，不產(chǎn)芽孢。菌株生理生化特性測(cè)定結(jié)果為:淀粉水解、接觸酶實(shí)驗(yàn)等呈陽(yáng)性，而檸檬酸鹽利用，甲基紅實(shí)驗(yàn)，V-P實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)等呈陰性。對(duì)該菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物，擴(kuò)增到1024bp的DNA片段，GenBank中登錄號(hào)為KF986731。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示該菌株與Mitsuaria屬的序列同源性最高，采用MEGA4.1軟件將該菌株的16S rDNA序列與Genbank中的若干個(gè)相關(guān)種的16S rDNA序列進(jìn)行分析比對(duì)，以Rubrivivax gelatinosusIL144CNC017075.1)為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖1所示，該菌株與Mitsuaria sp.KNl(HQ231945.1)位于同一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育的分支。結(jié)合該菌株形態(tài)特征、部分生理生化特征、16SrDNA序列分析及可產(chǎn)生殼聚糖酶的特性，與Mitsuaria屬特征相符，故將該菌株命名為Mitsuaria sp.GD02o
[0057]2.2Mitsuaria sp.GD02 的紫外誘變育種
[0058]將菌懸液經(jīng)紫外線分別照射不同后，30°C避光培養(yǎng)，72h，選取D/d值較大的8株菌用于搖瓶復(fù)篩，以出發(fā)菌株(MO)作對(duì)照，DNS法測(cè)定發(fā)酵液酶活，第一輪的篩選結(jié)果見(jiàn)表1。
[0059]表1:Mitsuaria sp.⑶02的紫外誘變育種(第一輪)
【權(quán)利要求】
1.一株殼聚糖酶產(chǎn)生菌——Mitsuaria sp.⑶02-M41，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，郵政編碼:430072，保藏日期:2014年3月19日，保藏編號(hào):CCTCC No:M2014095。
2.如權(quán)利要求1所述的Mitsuariasp.⑶02-M41在微生物酶解殼聚糖制備殼寡糖中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12P19/12GK103966119SQ201410120173
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】邱樂(lè)泉, 吳石金, 鐘衛(wèi)鴻, 鐘莉 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)