一種耐酸性高溫β-淀粉酶的突變體TBA-H2及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種耐酸性高溫β-淀粉酶的突變體TBA-H2及其應(yīng)用，其氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示，該突變體相對于突變前的酶具有酸性的最適pH值和更高的生成麥芽糖的功能。本發(fā)明所述的高溫β-淀粉酶的突變體TBA-H2能夠在降解淀粉質(zhì)材料中應(yīng)用，尤其適合于在酸性條件下降解淀粉生成麥芽糖中的應(yīng)用。
【專利說明】—種耐酸性高溫β -淀粉酶的突變體ΤΒΑ-Η2及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種耐酸性高溫β -淀粉酶的突變體ΤΒΑ-Η2，以及該突變體酶在淀粉降解和含淀粉材料處理中的應(yīng)用，尤其是用于生產(chǎn)高純麥芽糖漿的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]β -淀粉酶又被稱為1，4- a -D-葡聚糖麥芽水解酶(EC3.2.1.2)，是一種外切酶，通過催化降解淀粉、糊精等聚糖的非還原性末端的α-1，4-糖苷鍵來連續(xù)產(chǎn)生麥芽糖。β -淀粉酶不含有α -淀粉酶的活性，被用于從液化淀粉漿來生產(chǎn)高麥芽糖漿，同時也被廣泛應(yīng)用于麥芽糖醇、麥芽糊精、釀造酒精等發(fā)酵工業(yè)中(吳林德，鄭大鵬.介紹一種新型酶制劑-β_淀粉酶[J].微生物學(xué)雜志，1986，(3))。目前已經(jīng)獲得的細(xì)菌β_淀粉酶的最適pH值大約為6.5-7.0,植物β -淀粉酶的最適pH約為5.0-6.0 (Akira Hirata, MotoyasuAdachi, Shigeru Utsumi, Bunzo Mikam1.Engineering of the pH optimum of Bacilluscereus Beta-Amylase: Conversion of the pH Optimum from a Bacterial Type to aHigher-Plant Type.Biochemistry2004, 43，12523-12531.)。商品化的 β -淀粉酶主要是大麥β -淀粉酶，如杜邦-杰能科公司的0PTIMALT BBA,其最適作用溫度為57°C，最適的pH值在5.5左右。在溫度高于60°C或者pH低于4.5時迅速失活。然而，淀粉工業(yè)中普遍存在高溫、低PH操作環(huán)境。例如，淀粉糖工業(yè)、發(fā)酵飲料、發(fā)酵廢液處理及酒精行業(yè)中通常存在酸性條件下加工淀粉質(zhì)原料的步驟，具有明顯的耐酸性將使β_淀粉酶具有更大的應(yīng)用潛力和開發(fā)前景。因此，為了滿足一些在酸性條件下進(jìn)行淀粉原料加工工藝的要求，實(shí)現(xiàn)與其他酸性酶類的聯(lián)用，進(jìn)一步簡化工藝、降低成本、節(jié)約水和能源，迫切需要開發(fā)新型耐酸高溫β -淀粉酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種耐酸性高溫β -淀粉酶的突變體ΤΒΑ-Η2及其應(yīng)用，解決了現(xiàn)有淀粉酶不能同時兼顧耐酸性和耐溫性的問題。該淀粉酶突變體最適PH值為4.0，最適溫度為60°C，在pH2.5-4.5和45_75°C范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。該β -淀粉酶突變體可用于高效降解淀粉質(zhì)原料，尤其適用于酸性高溫條件下的應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明所述的耐酸性高溫β -淀粉酶的突變體ΤΒΑ-Η2，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，具體是將親本酶(GenBank序列號ΑΑΑ23204.1)的第176位酪氨酸(Tyr，Y)和307位酪氨酸(Tyr，Y)突變?yōu)榻M氨酸(His，H)得到的突變體。
[0005]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案達(dá)到上述目的:以熱硫梭菌(Thermoanaerobacteriumthermosulfurigenes) β -淀粉酶基因ctba(GenBank序列號Μ22471.1)為模板，通過引物介導(dǎo)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)引入突變，將第176位酪氨酸(Tyr，Y)和307位酪氨酸(Tyr，Y)突變?yōu)榻M氨酸(His，H)，改造得到新的耐溫耐酸β-淀粉酶突變體。這個新的β-淀粉酶突變體與原始酶相比，最適PH值由中性的6.0降低為酸性的4.0, pH穩(wěn)定性范圍向酸性方向偏移，在pH2.5-4.5和45-75°C范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。
[0006]所獲得的耐酸性高溫β -淀粉酶的突變體ΤΒΑ-Η2在淀粉降解和含淀粉材料處理中的應(yīng)用，主要包括淀粉質(zhì)麥芽糖、麥芽糖醇、麥芽糊精、飴糖以及釀造啤酒、酒精和醋等發(fā)酵工業(yè)中，尤其適用于與淀粉工業(yè)中其他酸性酶類如α-淀粉酶、普魯蘭酶、糖化酶等的聯(lián)用開發(fā)新的同步工藝。將該耐酸性β_淀粉酶突變體應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工都能領(lǐng)域，可以在強(qiáng)耐酸性環(huán)境下高效降解淀粉生成麥芽糖，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0007]本發(fā)明與已有技術(shù)相比，具有以下實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步:
[0008]1.本發(fā)明公開的淀粉酶變體酶，其序列為SEQ ID: 1，由519個氨基酸組成，與親本酶(GenBank序列號ΑΑΑ23204.1)相比，除只保留了成熟肽區(qū)域外，有兩個位點(diǎn)不同，即將第176位酪氨酸(Tyr，Y)和307位酪氨酸(Tyr，Y)突變?yōu)榻M氨酸(His，H)。
[0009]2.本發(fā)明公開的β -淀粉酶變體酶，最適pH值為4.0，在pH2.5-4.5的酸性范圍內(nèi)可以保留75%以上的活性，最適溫度為60°C，在45-75°C溫度范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，最大比活力為1308U/mg，水解木薯淀粉和可溶性淀粉的產(chǎn)物只有麥芽糖生成。與之相比，親本酶的最適pH為6.0，在pH4.0條件下相對活力約為60%。商品化的β -淀粉酶，如杜邦-杰能科公司的大麥β -淀粉酶OPTIMALT BBA的最適pH為5.5，最適溫度為57°C，70°C即被滅活。
[0010]因而本發(fā)明公開的變體β -淀粉酶ΤΒΑ-Η2明顯不同于已有的親本β -淀粉酶及商品化β -淀粉酶、顯著地取得了預(yù)料不到的技術(shù)效果，其提高的催化活性和酸穩(wěn)定性更加適應(yīng)于淀粉工業(yè)中水解淀粉過程對酶耐受高反應(yīng)溫度和酸性低pH值的要求。
[0011]應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明具有重要的經(jīng)濟(jì)效益，突變體酶的高催化效率和高麥芽糖轉(zhuǎn)化率有利于降低生產(chǎn)成本，耐溫性和耐酸特性滿足一些在酸性條件下進(jìn)行淀粉原料加工工藝的要求，有利于實(shí)現(xiàn)與其他酸性酶類的聯(lián)用，進(jìn)一步簡化工藝、降低成本、節(jié)約水和能源。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可以根據(jù)本發(fā)明對熱硫梭菌或者其他來源的β-淀粉酶加以改進(jìn)或者替換。例如對熱硫梭菌TBA的相同位點(diǎn)引入其他的氨基酸突變達(dá)到相同的改善PH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、催化效率和轉(zhuǎn)化率的效果，或者在本發(fā)明公開的TBA位點(diǎn)的附近位點(diǎn)引入突變間接地達(dá)到相類似的效果，或者在其他來源β -淀粉酶對等位點(diǎn)或者附近位點(diǎn)引入同樣或者類似的突變達(dá)到同樣的改造效果。這些β_淀粉酶的來源包括巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)、多粘芽抱桿菌(Bacillus polymyxa)、臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus)、環(huán)狀芽抱桿菌(Bacillus circulans)、熱硫梭菌(Clostridiumthermosulfurogenes)、假單胞菌(Pseudomonas)、土佐鏈霉菌(Streptomycestosaensisnov)、高溫放線菌(Thermeoactinomyces sp.)和諾卡氏菌(Nocarida sp.)等。應(yīng)當(dāng)理解的是，所有這些改造和改進(jìn)都應(yīng)屬于本發(fā)明所要求保護(hù)的權(quán)利要求范圍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是β -淀粉酶突變體ΤΒΑ-Η2純化酶的SDS-PAG電泳圖。M-蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品；
1-純化的淀粉酶突變體ΤΒΑ-Η2。
[0013]圖2是β -淀粉酶野生型和突變體ΤΒΑ-Η2酶活隨pH變化圖。其中代表ΤΒΑ-Η2，代表野生型。
[0014]圖3是β -淀粉酶突變體ΤΒΑ-Η2水解1%可溶性淀粉產(chǎn)物的高效液相色譜(HPLC)圖。其中1-流動相乙腈，2-麥芽三糖，3-麥芽糖，4-葡萄糖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0015]以下通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述，但是這些實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)被理解為對本發(fā)明的限制。
[0016]實(shí)施例1
[0017]本實(shí)施例說明β -淀粉酶突變體ΤΒΑ-Η2的獲取方法。
[0018]1) β -淀粉酶基因ctba的克隆
[0019]以熱硫梭菌(Thermoanaerobacteriumthermosulfuri genes,美國典型培養(yǎng)物保藏中心編號為ATCC33743)染色體DNA作為模板，以SEQ ID NO: 2為上游引物(含有一個NcoI酶切位點(diǎn))和以SEQ ID NO:3 (含有一個Bam HI酶切位點(diǎn)，并引入一個6x組氨酸標(biāo)簽編碼序列)為下游引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增β -淀粉酶的成熟肽編碼區(qū)域，對應(yīng)于ctba基因中660-2219片段，所得目的產(chǎn)物長度為1605bp ;將目的產(chǎn)物和pSE380載體質(zhì)粒分別用Nco I和Bam HI酶雙酶切，膠回收后，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(E.coli) XLl-Blue感受態(tài)細(xì)胞；挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶切驗(yàn)證和DNA測序分析，驗(yàn)證連接正確的轉(zhuǎn)化子即為β -淀粉酶基因重組表達(dá)載體，命名為PSBA。
[0020]2) β-淀粉酶突變體ΤΒΑ-Η2基因的獲取
[0021]以pSBA質(zhì)粒DNA為模板，分別以SEQ ID N0:4和SEQ ID NO: 5為上、下游引物，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系。25yL PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建如下:1 μ L pSA7D質(zhì)粒DNA，0.5 μ L上游引物 Amy7_S (濃度為 IOm mol/L), 0.5 μ L 下游引物 Amy7_A (濃度為 IOm mol/L), 2 μ L dNTPs(每樣 dNTP2.5mmol/L),5y L5x PrimerSTAR8 buffer, 0.25 μ L (2.5U/ μ L) PrimerSTARi DNA聚合酶，加入16.75 μ L ddH20補(bǔ)足至25 μ L。體系混勻后置于PCR以上執(zhí)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR擴(kuò)增條件均為:第一步:95°C 3min ;第二步:98°C 10s, 68°C 6min，如此循環(huán)30次；第三步:720C IOmin0 PCR產(chǎn)物經(jīng)Dpn 1(購自加拿大Fermentas公司)37°C消化2h，消化產(chǎn)物于80°C失活20min后，直接轉(zhuǎn)化E.coli XLl-Blue感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在含有100μ g/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，挑取單菌落接種于含100 μ g/mL氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒委托上海生工測序驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的質(zhì)粒即為將淀粉酶176位Tyr突變?yōu)镠is的重組表達(dá)質(zhì)粒，標(biāo)記為pSBA_Hl。以重組質(zhì)粒pSBA_Hl為模板，以SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7為上、下游引物，采用與上述pSBA_Hl構(gòu)建相同的策略構(gòu)建含有β -淀粉酶突變體ΤΒΑ-Η2基因的重組質(zhì)粒，經(jīng)測序驗(yàn)證正確后，標(biāo)記為pSBA-H2。
[0022]3) β -淀粉酶突變體ΤΒΑ-Η2的純化和表征
[0023]挑取含有重組表達(dá)質(zhì)粒pSBA-H2的大腸桿菌工程菌單菌落，接種于5ml含有100 μ g/ml氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)液(酵母膏10g/L,蛋白胨5g/L,氯化鈉10g/L,天然pH),于37°C、220r/min條件下培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)之菌液，按照1%的接種量轉(zhuǎn)接于500ml含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中。待菌液培養(yǎng)至0D_為0.6左右，加入終濃度為lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑，同樣條件下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)16h ;于9000r/min、4°C離心收集誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌，沉淀用0.05mol/L醋酸酸緩沖液(pH6.0)洗滌一次后，重懸于100mL同樣的緩沖液中，菌懸液通過高壓細(xì)胞破碎機(jī)JN-10HC (廣州聚能生物科技有限責(zé)任公司)破胞，流速10L/H，4°C，壓力為150MPa，破胞液于12000r/min4°C下離心30min，上清液為粗酶液；采用金屬螯合層析的方法純化重組酶TBA-H2，首先，粗酶液上清液加入終濃度為300mmol/L的NaCl和5mmol/L的咪唑，用0.22 μ m濾膜過濾所得透過液直接用TALON":金屬親和樹脂純化重組酶。純化所得酶液，通過分子截留量為IOKDa的Millipore超濾管,反復(fù)換洗緩沖液兩次，以除去鹽分及咪唑成份。純化蛋白的純度和均一性通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行檢測，蛋白的含量通過Bradford法，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果如圖1所示，可見得到了電泳純的條帶；
[0024]取10 μ I適當(dāng)稀釋的ΤΒΑ-Η2純化酶液加入390 μ I溶解于0.05mol/L pH4.0醋酸緩沖溶液中的1%可溶性淀粉(質(zhì)量百分比)，于60°C水浴中反應(yīng)30!1^11，然后加入40(^1DNS 試劑(蒸餾水:372.63ml, DNS:2.79g, Na0H:5.21g,酒石酸鉀鈉:80.53g,苯酚:2.00ml，亞硫酸氫鈉:2.18g),于沸水浴煮沸5min,冷卻至室溫,采用分光光度法測定OD54c!值,通過麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線確定酶活。最適溫度的測定通過將上述400 μ I反應(yīng)體系分別置于45-85°C區(qū)間范圍內(nèi)測定酶活，用相對酶活的最大值對應(yīng)的溫度表示。最適pH值通過測定pH2.5-7.5范圍內(nèi)的相對酶活,用最大相對酶活對應(yīng)的pH值表示。采用雙倒數(shù)法,在最適PH和最適溫度條件下對酶進(jìn)行酶學(xué)參數(shù)測定。表征結(jié)果表明，TBA-H2的最適pH為4.0，最適溫度為60°C。每單位(U)酶活定義為:pH4.0，60°C條件下每分鐘轉(zhuǎn)化生成I μ mo I麥芽糖的酶量。將突變體β -淀粉酶突變體ΤΒΑ-Η2和突變前的親本酶的酶活隨pH變化圖譜進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，TBA-H2將最適pH降低了 2個單位。
[0025]實(shí)施例2
[0026]本實(shí)施例說明突變體酶TBA-H2在水解淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)高純麥芽糖漿中的應(yīng)用
[0027]取Ig馬鈴薯可溶性淀粉加入0.05mol/L pH4.0醋酸緩沖溶液中調(diào)制為1% (質(zhì)量百分比)的淀粉漿，按照1.2mg酶/g干物質(zhì)淀粉的量加入純化的酶液，然后置于60°C水浴中溫浴24h，于100°C水浴熱處理IOmin后，12000r/min離心5min，上清液通過0.22 μ m濾膜過濾，取20 μ L過濾液通 過氨基柱對酶解產(chǎn)物進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)檢測。氨基柱的檢測條件為RI溫度為50°C，流速為lmL/min，流動相為乙腈:水(70:30)。氨基柱檢測結(jié)果如圖3所示。從中可以看出，在酸性條件下，TBA-H2水解可溶性淀粉產(chǎn)物只有麥芽糖的生成，酶解24h的轉(zhuǎn)化率為66%。
【權(quán)利要求】
1.一種耐酸性高溫β-淀粉酶的突變體TBA-H2，其特征在于:其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1 所示。
2.一種宿主細(xì)胞，其特征在于:它是含有權(quán)利要求1所述β -淀粉酶突變體的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1所述的耐酸性高溫β-淀粉酶的突變體ΤΒΑ-Η2在淀粉降解和含淀粉材料的處理中的應(yīng)用， 尤其是用于生產(chǎn)高純麥芽糖漿的應(yīng)用。
【文檔編號】C12P19/22GK103881993SQ201410094145
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】梁蓮華, 王成華, 蒙健宗, 李曉明, 韋航 申請人:南寧邦爾克生物技術(shù)有限責(zé)任公司