基于納米磁珠的核酸提取純化方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明揭示了一種基于納米磁珠的核酸提取純化方法，步驟包括：將生物樣品和裂解緩沖液混合，使裂解緩沖液中的納米磁珠與游離到裂解緩沖液中的核酸DNA/RNA形成磁珠-核酸復(fù)合物，在磁場作用下轉(zhuǎn)移至洗滌緩沖液液，洗滌去除磁珠-核酸復(fù)合物上的雜質(zhì)，在磁場作用下再轉(zhuǎn)移至洗脫緩沖液中洗脫回收核酸。本發(fā)明使用的納米磁珠顆粒大小均勻，表面光滑，表面積比值大，磁響應(yīng)速度快，能長期與裂解緩沖液共同室溫保存，對核酸吸附力強，分離迅速；提取出的核酸DNA/RNA純度高、完整，可直接用于后續(xù)檢測，核酸提取時間較一般磁珠法核酸提取試劑需要時間更短，更適合自動化，實現(xiàn)了高通量核酸DNA/RNA的提取。
【專利說明】基于納米磁珠的核酸提取純化方法及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及磁珠法提取純化核酸領(lǐng)域，尤其是涉及一種基于納米磁珠的核酸提取純化方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]核酸包括脫氧核糖核酸(RNA)和核糖核酸(DNA)兩類，己知核酸是一切生物體的遺傳物質(zhì)，在細(xì)胞主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，在病毒存在于病毒衣殼內(nèi)。目前，在生物醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域都離不開核酸的提取和純化，應(yīng)用生物納米材料，快速、高通量分離純化得到高純度完整的目的核酸DNA/RNA是生物學(xué)科的基礎(chǔ)。
[0003]正因為如此，核酸提取方法多種多樣，如酚/氯仿等有機溶劑抽提法、螯合樹脂法、玻璃粉吸附法，當(dāng)前主流的硅膠膜吸附柱法都因為有機溶劑對人體的傷害、操作繁瑣或提取的核酸DNA/RNA濃度純度低、實現(xiàn)自動化困難、單位時間通量低等諸多原因而成為生物學(xué)高速發(fā)展的瓶頸。
[0004]納米磁珠法在外加磁力的作用下，可快速分離純化核酸DNA/RNA，因安全并易于實現(xiàn)自動化而迅速發(fā)展。納米磁珠核酸提取方法是指以超順磁性氧化硅納米磁性微球(以下簡稱磁珠)為載體，通過磁珠在高鹽、低PH溶液中吸附核酸，而在低鹽溶液中將核酸從磁珠表面脫離的原理進(jìn)行核酸提取的方法，通常使用的納米級磁珠的直徑在IOOnm~800nm之間。由于磁珠的以下特點，使得磁珠法核酸提取方法非常適用于自動化應(yīng)用。
[0005]納米磁珠是由四氧化三鐵或三氧化二鐵等磁性微球與各種含活性功能基團(tuán)的二氧化硅等材料復(fù)合而成的具有一定磁性及特殊表面結(jié)構(gòu)的球形微粒。通過聚合作用給磁性微球表面增添不同功能基團(tuán)如-C00H、-OH等，也可共價結(jié)合酶、細(xì)胞、抗體等生物活性物質(zhì)，磁珠便被賦予了多種活`性功能，即形成多種性質(zhì)磁珠。對比普通顆粒材料，球形磁珠具有很好的表面體積效應(yīng)比，選擇性吸附能力大，吸附平衡時間短。四氧化三鐵或三氧化二鐵晶體的粒徑小于一定值時，磁珠便具有了很好的瞬時磁響應(yīng)性，也就是我們常說的超順磁性，即可避免發(fā)生中粒子那樣的磁性團(tuán)聚；因為具有超順磁性，磁珠可在外加磁場的作用下地被定位、導(dǎo)向和分離。
[0006]現(xiàn)有的磁珠提取法需要依賴于蛋白酶K，且提取步驟較復(fù)雜，所以所需的提取時間就會相對較長，另外提取出的樣品也存在純度不太高的問題，因此提純后的樣品不能完全滿足后續(xù)的實驗要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種基于納米磁珠的核酸提取純化方法及試劑盒，以實現(xiàn)快速、高通量、自動化地提取純化核酸DNA/RNA。
[0008]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出如下技術(shù)方案:基于納米磁珠的核酸提取純化方法，包括以下步驟:
[0009]I)在生物樣品中加入裂解緩沖液，使樣品中細(xì)胞、細(xì)胞核破裂，核酸DNA/RNA與核蛋白分離，核蛋白變形沉淀，裂解分離出所述生物樣品中的核酸DNA/RNA，所述核酸DNA/RNA與所述裂解緩沖液中的納米磁珠結(jié)合，在外部磁場作用下，納米磁珠聚集，形成磁珠-核酸復(fù)合物；
[0010]2)向所述磁珠-核酸復(fù)合物中加入洗滌緩沖液，洗滌去除磁珠-核酸復(fù)合物上的雜質(zhì)，在外部磁場作用下，納米磁珠聚集，收集洗滌后的磁珠-核酸復(fù)合物；
[0011]3)向所述洗滌后的磁珠-核酸復(fù)合物中加入洗脫緩沖液，將結(jié)合在納米磁珠上的核酸DNA/RNA洗脫下來回收，即得到純化的核酸DNA/RNA。
[0012]優(yōu)選地，所述裂解緩沖液包括:碘化鈉1.5~3M，鹽酸胍2~3M，EDTAl~10mM，Tween-203%，納米磁珠8%，SDS2%，異丙醇35%，所述裂解緩沖液的PH值=7.4 ；
[0013]所述洗滌緩沖液包括=EDTAl~10mM，Tris-cll50mM,乙醇75%，所述洗滌緩沖液的 PH 值=6.4 ；
[0014]所述洗脫緩沖液采用ImM氫氧化鈉液。
[0015]所述生物樣品包括有細(xì)胞液體樣品和無細(xì)胞液體樣品，所述有細(xì)胞液體樣品包括細(xì)胞、全血、動物組織勻漿液，所述無細(xì)胞液體樣品包括血清、血漿、組織提取液、拭子洗液、尿液、病毒培養(yǎng)液。
[0016]所述納米磁珠為超順磁性氧化硅納米磁性微珠，直徑為100~800nm，具有核殼結(jié)構(gòu)，即超順磁性核心及氧化硅外殼。
[0017]本發(fā)明還提供了 一種基于納米磁珠的核酸提取純化試劑盒，所述試劑盒中的組分包括裂解緩沖液、洗滌緩沖液和洗脫緩沖液，所述裂解緩沖液包括:碘化鈉1.5~3M，鹽酸胍2~3M，EDTAl~10mM，Tween-203 %，納米磁珠8 %，SDS2 %，異丙醇35 %，所述裂解緩沖液的PH值=7.4，所述異丙醇增強了裂解緩沖液中高濃度鹽(主要是鹽酸胍、碘化鈉)主導(dǎo)的納米磁珠吸附核酸的作用，鹽酸胍、碘化鈉不但有促進(jìn)納米磁珠和核酸結(jié)合的作用，還有解離核酸DNA/RNA和核蛋白的作用。
[0018]所述洗滌緩沖液包括=EDTAl~10mM，Tris-cll50mM,乙醇75% ;所述洗脫緩沖液采用ImM氫氧化鈉液，所述洗滌緩沖液的PH值=6.4，其中，所述乙醇不但增強了洗滌緩沖液在低PH條件下納米磁珠吸附核酸的作用，還具有解離鹽酸胍和殘留有機物質(zhì)的作用。
[0019]所述洗脫緩沖液采用ImM氫氧化鈉液，所述洗脫緩沖液內(nèi)不含醇類物質(zhì)。
[0020]本發(fā)明的有益效果是:(1)該方法的全部核酸提取過程僅需3個步驟，完成特定核酸提取只需要5-10分鐘，如和自動化儀器配合使用，提取32個生物樣品，包含加樣在內(nèi)僅需10分鐘。并且本試劑盒方法克服了現(xiàn)有磁珠法核酸提取方法步驟繁多的缺點；裂解與結(jié)合步驟一步完成，納米磁珠直接放置在裂解緩沖液中，使納米磁珠在核酸提取的開始步驟即存在反應(yīng)溶液中，減少了操作步驟，從而相應(yīng)的操作步驟，提高了單位時間核酸DNA/RNA提取通量。較現(xiàn)有磁珠法核酸提取方法，該方法更適用于全自動化核酸提取應(yīng)用；(2)該方法在裂解過程當(dāng)中不使用蛋白酶K、助沉劑，裂解無需加熱，降低了對自動化儀器的性能要求，與現(xiàn)有磁珠法核酸提取試劑相比極大降低了成本，減少了操作步驟，降低了出錯幾率，并且避免了現(xiàn)有磁珠法核酸提取試劑整體或部分成分必須_20°C保存的缺點；(3)該方法簡單，試劑盒成本低，提取的核酸完成純度高，可以直接進(jìn)行PCR及RT-PCR等分子生物學(xué)實驗研究及臨床檢測；(4本發(fā)明試劑盒可配合自動化儀器使用，快速高通量提取出生物樣品中的核酸DNA/RNA?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0021]圖1是采用本發(fā)明的核酸提取法與QIAamp DNA Mini Kit的全血基因組提取法效率比較示意圖；
[0022]圖2是采用本發(fā)明的核酸提取法與Qiagen硅膠膜吸附柱法(QiagenViralRNAMini Kit)的全血基因組提取法效率比較示意圖；
[0023]圖3是采用本發(fā)明的核酸提取法與現(xiàn)有磁珠法核酸提取試劑的全血基因組提取法效率比較示意圖。
【具體實施方式】
[0024]下面將結(jié)合本發(fā)明的附圖，對本發(fā)明實施例的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述。
[0025]實施例1
[0026]I)取EDTA抗凝血200ul置于離心管內(nèi)，向離心管內(nèi)加入裂解緩沖液600ul，室溫混勻3分鐘，再將離心管置于磁力架上，磁力分離20s，吸棄上清；
[0027]其中，所述裂解緩沖液內(nèi)加入的成分分別是:碘化鈉2M，鹽酸胍2.5M，EDTAlOmM,Tween-203%,納米磁珠8%，SDS2%,異丙醇35%，其余成分為水，裂解緩沖液的PH值調(diào)至7.4。
[0028]2)繼續(xù)向所述離心管中加入400ul的洗滌緩沖液，混勻I分鐘后將離心管置于磁力架上，磁力分尚20s,吸棄上清,開蓋涼置I分鐘；
[0029]其中，所述洗滌緩沖液中加入的成分分別是:EDTA5mM，Tris-cll50mM,乙醇75%，其余成分為水，洗滌緩沖液的PH值調(diào)至6.4。
[0030]3)重復(fù)上述2)操作步驟；`
[0031]4)最后向離心管中加入50ul的洗脫緩沖液，混勻I分鐘后將離心管置于磁力架上，磁力分離20s，將上清液轉(zhuǎn)移至另一潔凈無酶的離心管中，在-20°C溫度下保存即可得到最終提取純化的全血基因組DNA溶液。
[0032]所述洗脫緩沖液采用ImM氫氧化鈉液，洗脫緩沖液的用量根據(jù)用戶需要在50~
100μ I之間任選。
[0033]對照試劑選用QIAamp DNA Mini Kit提取的樣本量為200ul，洗脫體積為IOOul。
[0034]提取完成后，分別取全血基因組DNA溶液5ul做1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示。
[0035]實施例2
[0036]I)取含丙型肝炎病毒(HCV病毒)的血清IOOul置于離心管內(nèi)，向離心管內(nèi)加入裂解緩沖液300ul，室溫混勻3分鐘，再將離心管置于磁力架上，磁力分離20s，吸棄上清；
[0037]其中，所述裂解緩沖液中加入的成分分別是:碘化鈉2M，鹽酸胍2.5M，EDTAlOmM,Tween-203%，納米磁珠8%，SDS2%，異丙醇35%，其余成分為水，裂解緩沖液的PH值調(diào)至
7.4。
[0038]2)繼續(xù)向所述離心管中加入400ul的洗滌緩沖液，混勻I分鐘后將離心管置于磁力架上，磁力分尚20s,吸棄上清,開蓋涼置I分鐘；
[0039]其中，所述洗滌緩沖液中加入的成分分別是:EDTA5mM，Tris-cll50mM,乙醇75%，其余成分為水，洗滌緩沖液的PH值調(diào)至6.4。
[0040]3)最后向離心管中加入IOOul的洗脫緩沖液，混勻I分鐘后將離心管置于磁力架上，磁力分離20s，將上清液轉(zhuǎn)移至另一潔凈無酶的離心管中，在-20°C溫度下保存即可得到最終提取純化的HCV病毒核酸RNA溶液。
[0041]所述洗脫緩沖液采用ImM氫氧化鈉液，洗脫緩沖液的用量根據(jù)用戶需要在50~
100μ I之間任選。
[0042]本發(fā)明中配制的核酸提取純化試劑盒中的組分包括所述裂解緩沖液、洗滌緩沖液和洗脫緩沖液，其中各組分中的成分及各成分的體積比與上述步驟中相同，即所述裂解緩沖液中加入的成分分別是:碘化鈉2Μ，鹽酸胍2.5Μ，EDTAlOmM, Tween-203 %，納米磁珠8%, SDS2%，異丙醇35%，PH值調(diào)至7.4 ;所述洗滌緩沖液中加入的成分分別是:EDTA5mM，Tris-cll50mM,乙醇75%，洗滌緩沖液的PH值調(diào)至6.4 ;所述洗脫緩沖液采用ImM氫氧化鈉液。
[0043]本發(fā)明也可以用試劑盒配合自動化儀器，快速高通量地提取出生物樣品中的核酸DNA/RNA，如使用NP968核酸提取儀，則使用下面的程序:
[0044]
【權(quán)利要求】
1.一種基于納米磁珠的核酸提取純化方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)在生物樣品中加入裂解緩沖液，裂解分離出所述生物樣品中的核酸DNA/RNA，所述核酸DNA/RNA與所述裂解緩沖液中的納米磁珠結(jié)合，在外部磁場作用下，形成磁珠-核酸復(fù)合物； 2)向所述磁珠-核酸復(fù)合物中加入洗滌緩沖液，洗滌去除磁珠-核酸復(fù)合物上的雜質(zhì)，在外部磁場作用下，收集洗滌后的磁珠-核酸復(fù)合物； 3)向所述洗滌后的磁珠-核酸復(fù)合物中加入洗脫緩沖液，將結(jié)合在納米磁珠上的核酸DNA/RNA洗脫下來回收，即得到純化的核酸DNA/RNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于納米磁珠的核酸提取純化方法，其特征在于，所述裂解緩沖液包括:碘化鈉1.5~3M，鹽酸胍2~3M，EDTAl~10mM，Tween-203%，納米磁珠8%，SDS2%，異丙醇35%，所述裂解緩沖液的PH值=7.4 ； 所述洗滌緩沖液包括=EDTAl~10mM，Tris-cll50mM,乙醇75%，所述洗滌緩沖液的PH值=6.4 ； 所述洗脫緩沖液采用ImM氫氧化鈉液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于納米磁珠的核酸提取純化方法，其特征在于，所述生物樣品包括有細(xì)胞液體樣品和無細(xì)胞液體樣品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于納米磁珠的核酸提取純化方法，其特征在于，所述有細(xì)胞液體樣品包括細(xì)胞、全血、動物組織勻衆(zhòng)液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于納米磁珠的核酸提取純化方法，其特征在于，所述無細(xì)胞液體樣品包括血清、血漿、組織提取液、`拭子洗液、尿液、病毒培養(yǎng)液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于納米磁珠的核酸提取純化方法，其特征在于，所述納米磁珠為超順磁性氧化硅納米磁性微珠，直徑為100 V 800nm。
7.一種基于納米磁珠的核酸提取純化試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中的組分包括裂解緩沖液、洗滌緩沖液和洗脫緩沖液，所述裂解緩沖液包括:碘化鈉1.5~3M，鹽酸胍2~3M，EDTAl~10mM，Tween_203%，納米磁珠8%，SDS2%，異丙醇35% ;所述洗滌緩沖液包括:EDTA1~10mM，Tris-cll50mM,乙醇75% ;所述洗脫緩沖液采用ImM氫氧化鈉液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基于納米磁珠的核酸提取純化方法，其特征在于，所述裂解緩沖液的PH值=7.4。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基于納米磁珠的核酸提取純化方法，其特征在于，所述洗滌緩沖液的PH值=6.4。
【文檔編號】C12N15/10GK103820431SQ201410062784
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月25日
【發(fā)明者】李明, 李紅東, 苗保剛, 彭年才, 倪曉龍, 李政 申請人:蘇州天隆生物科技有限公司