專利名稱：：紅細胞膜抗原磁珠試劑盒及在血型抗體檢測方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：1900年Landsteiner發(fā)現(xiàn)了人類紅細胞的ABO血型抗原，這一劃時代的成果，開啟了世人對臨床輸血的深入探討，并為今天的臨床安全輸血奠定了基礎(chǔ)。臨床輸血前進行的血型血清學(xué)檢測概括為三類1、血型檢定；2、抗體篩檢和鑒定；3、交叉配血。血型檢定檢査確定受血者和獻血者的紅細胞血型，最主要是ABO血型和Rh血型。英國藥典特別強調(diào)檢測ABO血型不僅要檢測紅細胞表面抗原，而且必須還要檢測血清(或血漿)中抗體，即正反定型。也就是說人類ABO血型表面抗原和血清(或血漿)中抗體要共同檢測，只有兩者結(jié)果相符時，即正反定型相符，才能正確判定人類ABO血型。人體內(nèi)ABO血型抗原不僅存在于紅細胞膜，而且更廣泛的存在于很多組織細胞膜和體液、分泌液中。人體內(nèi)ABO血型抗體最多是IgM類自然發(fā)生的抗體。在妊娠或輸ABO不相容血液后也可以產(chǎn)生IgG類免疫抗體。長期以來，人們一直用人血清制備的抗A、抗B抗體來檢測人類ABO血型表面抗原。自從1975年Kohler和Milstein發(fā)明淋巴細胞雜交瘤技術(shù)后，單克隆抗體血型試劑逐漸取代了人血清抗體。此種單克隆抗體血型試劑在鑒定人紅細胞血型抗原，進而判定人的血型等方面具有很多的優(yōu)點。然而在臨床實際工作中仍存在著許多的影響因素，例如個體差異、環(huán)境因素、藥物影響以及多種疾病等，主要是造成紅細胞表面抗原的抗原性減弱以至于破壞。如此，在進行臨床輸血血型配合試驗中就會出現(xiàn)假陰性或假陽性的結(jié)果，并由此會造成臨床病人出現(xiàn)輸血反應(yīng)。隨著臨床輸血工作的不斷發(fā)展，如何更加準確的進行血型定型檢測就成為臨床的必需。臨床進行血型檢測主要采用玻片法，試管法及微孔法，其本質(zhì)都為凝集技術(shù)。進行正定型檢測是用血型單克隆抗體試劑檢測紅細胞上抗原，反定型檢測是用紅細胞試劑檢測血清中抗體。目前應(yīng)用的檢測紅細胞多為輸血單位自行配制，他們多采用保存液保存紅細胞。紅細胞保護液的成份及理化性質(zhì)的差異，會造成反定型用紅細胞試劑的質(zhì)量不穩(wěn)定，導(dǎo)致血清抗體檢測結(jié)果不準確，甚至造成血型錯判，嚴重影響臨床輸血安全，更影響反定型檢測方法的推廣。臨床進行不規(guī)則抗體篩檢及鑒定主要采用試管抗人球蛋白技術(shù)及微珠凝膠抗人球蛋白技術(shù)。不規(guī)則抗體指不符合ABO血型系統(tǒng)Landsteiner法則的血型抗體，即抗A抗B以外的血型抗體，一般因為輸血、妊娠等發(fā)生同種免疫而產(chǎn)生，多屬于IgG類抗體。它是一種7S球蛋白，分子量小，分子長度只250A與紅細胞相應(yīng)抗原結(jié)合后，在鹽水介質(zhì)中只能與紅細胞結(jié)合而不出現(xiàn)肉眼可見的凝集反應(yīng)，必須通過特殊的方法才能使致敏細胞發(fā)生凝集反應(yīng)，從而檢出此類抗體。如果受血者體內(nèi)存在有臨床意義的抗體，就會破壞輸入的含有相應(yīng)抗原的紅細胞，發(fā)生溶血性輸血反應(yīng)，影響紅細胞輸注的療效，重者危及患者生命。孕婦體內(nèi)如含有不規(guī)則抗體，則會引起新生兒溶血病，產(chǎn)生核黃疸等其他嚴重影響新生兒發(fā)育的綜合癥，給家庭和社會帶來沉重的負擔(dān)，甚至引起新生兒死亡。因此，開展不規(guī)則抗體篩查是十分必要的。歐美等許多發(fā)達國家已將不規(guī)則抗體篩查作為常規(guī)檢測，在我國，衛(wèi)生行政部門還沒有相關(guān)的要求。臨床上，醫(yī)院及血站僅是對少數(shù)患者進行抗體篩檢。對獻血者的抗體篩檢更是空白，存在極大的安全隱患。目前臨床進行不規(guī)則抗體篩檢所使用的檢測細胞為紅細胞保存液保存的篩檢細胞，篩檢細胞是從O型獻血員中篩選抗原譜而得到，其獲得不易，保存期短，臨床并不常用，故往往l套試劑進行少量標本檢測后就會發(fā)生溶血，不能繼續(xù)使用，極大的浪費。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是用紅細胞膜抗原磁珠制作試劑盒并在血型抗體檢測方面的應(yīng)用。本發(fā)明試劑盒包括a、具有紅細胞血型抗原性的紅細胞膜抗原磁珠；b、96孔U型反應(yīng)板；c、紅細胞膜抗原磁珠稀釋液。本發(fā)明所述的紅細胞抗原磁珠稀釋液的制備配制低離子液取NaCl、甘氨酸于燒杯中，加入雙蒸餾水溶解后，加入KH2P04和Na2HP04，充分混勻，最后用NaOH調(diào)節(jié)PH至6.7;用低離子液配制濃度為1%的牛血清白蛋白液，即為紅細胞膜抗原磁珠稀釋液。本發(fā)明的試劑盒在血型抗體檢測方面的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點是紅細胞膜抗原磁珠保存期長，有利于對紅細胞稀有抗原的保存。應(yīng)用紅細胞膜抗原磁珠檢測不完全抗體時，洗滌過程不需離心；進行ABO系統(tǒng)血型凡定型檢測時，檢測方法簡便、易行；可同時對大量樣本進行檢測，易于自動化。具體實施例方式本發(fā)明的試劑盒包括a、具有紅細胞血型抗原性的紅細胞膜抗原磁珠；b、96孔U型反應(yīng)板；c、紅細胞膜抗原磁珠稀釋液。紅細胞膜抗原磁珠的制備1、紅細胞抗原的制備(1)取新鮮血細胞，離心去上清，取壓積血細胞進入下一步處理；(2)在壓積血細胞中加入SDS，然后置于室溫；(3)離心去上清，留沉淀物并向沉淀物中加入蒸餾水；2、磁性粒子的制備(1)將FeCl2和FeCl:,加入到蒸餾水中進行溶解；(2)在劇烈攪拌的條件下，將氫氧化鈉加入到上述金屬鹽溶液中，使其水解為金屬復(fù)合氧化物，從而得到四氧化三鐵顆粒溶液；3、細胞膜抗原包被磁性粒子將步驟2.1獲得的紅細胞膜抗原加入步驟2.2獲得的四氧化三鐵顆粒溶液中，再加入聚乙二醇，進行孵育，離心后棄上清，留沉淀，再在沉淀中加入低滲磷酸鹽緩沖液洗滌，即得細胞膜抗原包被的磁性粒子。96孔U型反應(yīng)板制備用pH9.6，0.05M碳酸鹽緩沖液將將純化的血小板單克隆抗體配制成10ug/ml濃度，按100ul/孔加入反應(yīng)孔中，置4。C冰箱中包被過夜，次日取出，用含有0.05%吐溫的pH7.2，0.01M磷酸鹽緩沖液洗滌5次，拍干，置-2(TC保存?zhèn)溆?。本發(fā)明所述的紅細胞抗原磁珠稀釋液的制備配制低離子液取NaC10.875g，甘氨酸9g于500ml燒杯中，加入400ml雙蒸熘水溶解后，加入5.65ml0.15MKH2PO4和4.35ml0.15MNa2HP04，充分混勻后定容至500ml，最后用NaOH調(diào)節(jié)PH至6.7。用低離子液配制濃度為1%的牛血清白蛋白液，即為紅細胞膜抗原磁珠稀釋液。本發(fā)明的試劑盒在血型抗體檢測方面的應(yīng)用。實施例lABO系統(tǒng)血型反定型檢測用已知的A型紅細胞、B型紅細胞如具體實施方式制備A紅細胞膜抗原磁珠、B紅細胞膜抗原磁珠。由于紅細胞膜抗原磁珠上包被有A抗原及B抗原，故可代替新鮮紅細胞用于ABO系統(tǒng)血型反定型檢測。A型人血清巾含有抗B抗體，B型人血清中含有抗A抗體，AB型人血清中不含有抗體，O型人血清中含有抗AB抗體。AB0血型系統(tǒng)抗體多為自然發(fā)生的抗體，為IgM類抗體，紅細胞膜抗原磁珠能夠與血清中的相應(yīng)IgM抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，形成肉眼可見的凝集。依據(jù)反應(yīng)后的格局判定血型。ABO血型表現(xiàn)性反應(yīng)格局表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>反應(yīng)程序向標記好的反應(yīng)板屮分別加入待檢血清25ul，然后加入紅細胞膜抗原磁珠50ul，混勻，置程控磁化振蕩器上，按設(shè)定好的程序反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)板，對照反應(yīng)格局判度結(jié)果。實施例2紅細胞不規(guī)則抗體的篩檢用已知特異性的抗體檢測紅細胞，確定篩檢細胞的抗原譜如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>將上述篩檢細胞如具體實施方式制備篩檢細胞膜磁珠，篩檢細胞膜抗原磁珠表面具有新鮮篩檢細胞上全部抗原，可用于臨床進行IgG抗體的篩檢。IgG抗體一般因為輸血、妊娠等發(fā)生同種免疫而產(chǎn)生。它是一種7S球蛋白，分子量小，分子長度只250A與紅細胞相應(yīng)抗原結(jié)合后，在鹽水介質(zhì)中只能與紅細胞結(jié)合而不出現(xiàn)肉眼可見的凝集反應(yīng)，必須通過加入抗人球蛋白試劑后才能使致敏細胞發(fā)生凝集反應(yīng)，從而檢出此類抗體。反應(yīng)程序向標記好的反應(yīng)板中分別加入待檢血清50ul，然后加入篩檢紅細胞膜抗原磁珠50ul，混勻，置37。C水浴箱中孵育30分鐘，置程控磁化振蕩器上，用洗液洗滌3次，200ul/次，最后一次徹底去上清，每孔加入50ul抗人球蛋白試劑，混勻，按設(shè)定好的程序反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)板，觀察結(jié)果。若為陽性反應(yīng)則表明待檢者血清中含與篩檢細胞抗原相對應(yīng)的抗體。若為陰性反應(yīng)則表明待檢者血清中不含有與篩檢細胞抗原相對應(yīng)的抗體。實施例3紅細胞不規(guī)則抗體的鑒定用已知特異性抗體檢測10人份或10人份以上o型紅細胞，確定其抗原譜，將其作為紅細胞譜細胞。作為譜細胞的紅細胞要求，應(yīng)用其能夠鑒定出臨床最常見的有臨床意義的同種異型抗體。將紅細胞譜細胞如具體實施方式制備成譜細胞膜磁珠，譜細胞膜抗原磁珠表面具有新鮮紅細胞譜細胞上全部抗原，可用于臨床進行IgG抗體的鑒定。反應(yīng)程序向標記好的反應(yīng)板中分別加入待檢血清50ul，然后加入譜紅細胞膜抗原磁珠50ul，混勻，置37"C水浴箱中孵育30分鐘，置程控磁化振蕩器上，用洗液洗滌3次，200ul/次，最后一次徹底去上清，每孔加入50ul抗人球蛋白試劑，混勻，按設(shè)定好的程序反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)板，通過與紅細胞譜細胞格局觀察結(jié)果。權(quán)利要求1、一種紅細胞膜抗原磁珠試劑盒，其特征是a、具有紅細胞血型抗原性的紅細胞膜抗原磁珠；b、96孔U型反應(yīng)板；c、紅細胞膜抗原磁珠稀釋液。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅細胞膜抗原磁珠試劑盒，其特征在于所述的紅細胞抗原磁珠稀釋液的制備配制低離子液取NaCl、甘氨酸于燒杯中，加入雙蒸餾水溶解后，加入KH2P04和Na2HP04，充分混勻，最后用NaOH調(diào)節(jié)PH至6.7;用低離子液配制濃度為1%的牛血清白蛋白液，即為紅細胞膜抗原磁珠稀釋液。3、權(quán)利要求1所述的試劑盒在血型抗體檢測方面的應(yīng)用。全文摘要一種紅細胞膜抗原磁珠試劑盒及在血型抗體檢測方面的應(yīng)用，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明的目的是用紅細胞膜抗原磁珠制作試劑盒并在血型抗體檢測方面的應(yīng)用。本發(fā)明試劑盒包括紅細胞膜抗原磁珠、96孔U型反應(yīng)板、紅細胞膜抗原磁珠稀釋液。本發(fā)明的優(yōu)點是紅細胞膜抗原磁珠保存期長，有利于對紅細胞稀有抗原的保存。文檔編號G01N33/80GK101387648SQ200810051319公開日2009年3月18日申請日期2008年10月24日優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日發(fā)明者墅周,孔維臣,孫玉昌,宇張,景維東,東李,勇李,楊文沖,段生寶,軍童,馬學(xué)嚴申請人:勇李