一種熱穩(wěn)定性提高的淀粉酶突變體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種熱穩(wěn)定性提高的淀粉酶突變體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于遺傳工程領(lǐng)域。本發(fā)明以SEQ?ID?NO.1所示序列為出發(fā)序列，將第193位天冬酰胺替換成苯丙氨酸或第206位蛋氨酸替換為苯丙氨酸或第240位賴氨酸替換成精氨酸或第242位絲氨酸替換成谷氨酰胺或丙氨酸或缺失第180位甘氨酸和181異亮氨酸或其任意組合得到的突變體。在此改造條件下，嗜熱脂肪芽孢桿菌淀粉酶在95℃的半衰期由對(duì)照(突變前)例的10min提高到240min。利用此策略可以顯著提高淀粉酶的熱穩(wěn)定性，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種熱穩(wěn)定性提高的淀粉酶突變體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種淀粉酶突變體及其方法，具體涉及一種熱穩(wěn)定性提高的酸性淀粉酶突變體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]淀粉酶是最早用于工業(yè)生產(chǎn)的酶制劑，是迄今用于最廣，產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一。淀粉酶具有相當(dāng)大的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，廣泛用于酒精、有機(jī)酸、氨基酸及紡織等行業(yè)。但是來(lái)源于野生菌株未經(jīng)改造的淀粉酶在熱穩(wěn)定性等方面具有一定局限性，限制了其應(yīng)用范圍。因此基于已得到的酸性淀粉酶在大腸桿菌中的表達(dá)系統(tǒng)，利用定點(diǎn)突變的手段，對(duì)酸性淀粉酶進(jìn)行分子改造，以得到酶學(xué)性質(zhì)更適合工業(yè)應(yīng)用的酸性淀粉酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種熱穩(wěn)定性提高的淀粉酶突變體，對(duì)淀粉酶結(jié)構(gòu)域A、B、C內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸進(jìn)行替換，提高了淀粉酶的熱穩(wěn)定性。
[0004]所述淀粉酶突變體以SEQ ID N0.1為出發(fā)序列，將第193位天冬酰胺替換成苯丙氨酸或第206位蛋氨酸替換為苯丙氨酸或第240位賴氨酸替換成精氨酸或第242位絲氨酸替換成谷氨酰胺或丙氨酸或缺失第180位甘氨酸和181異亮氨酸或其任意組合得到的突變體。 [0005]所述氨基酸突變體為第193位天冬酰胺替換成苯丙氨酸的突變體。
[0006]所述氨基酸突變體為第242位絲氨酸替換成谷氨酰胺或丙氨酸的突變體。
[0007]所述氨基酸突變體為缺失第180位甘氨酸和181異亮氨酸的突變體。
[0008]所述氨基酸突變體為第193位天冬酰胺替換成苯丙氨酸、第242位絲氨酸替
[0009]換成谷氨酰胺或丙氨酸、缺失第180位甘氨酸和181異亮氨酸的突變體。
[0010]能表達(dá)上述淀粉酶突變體的載體也屬于本專(zhuān)利要求保護(hù)的范圍。
[0011]能表達(dá)上述淀粉酶突變體的基因工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也屬于本專(zhuān)利要求保護(hù)的范圍。
[0012]本發(fā)明還提供一種制備所述淀粉酶突變體的方法，是將淀粉酶催化部位一個(gè)或多個(gè)氨基酸通過(guò)PCR或化學(xué)合成的方法進(jìn)行替換。
[0013]具體而言，是以SEQ ID N0.1為出發(fā)序列，將第193位天冬酰胺替換成苯丙氨酸、第206位蛋氨酸替換為苯丙氨酸、第240位賴氨酸替換成精氨酸、第242位絲氨酸替換成谷氨酰胺或丙氨酸、缺失第180位甘氨酸和181異亮氨酸或其任意組合。
[0014]所述制備所述淀粉酶突變體的方法，具體步驟如下:
[0015]I)根據(jù)嗜熱脂肪芽孢桿菌淀粉酶序列SEQ ID N0.1所示，采用化學(xué)全合成的方法全合成后克隆到質(zhì)粒pET-20b (+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-20b (+) -Amy (圖1);
[0016]2)利用Swiss-model軟件對(duì)源自嗜熱脂肪芽孢桿菌淀粉酶進(jìn)行模擬，獲得淀粉酶空間結(jié)構(gòu)；[0017]3)通過(guò)對(duì)淀粉酶的序列以及空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，確定要突變的氨基酸為位點(diǎn)，分別為第193位、第206位、第240位、第242位、第180位及第181位；
[0018]4)設(shè)計(jì)突變引物，對(duì)淀粉酶基因序列進(jìn)行定點(diǎn)突變，將所述位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行替換或缺失，獲得含有突變淀粉酶序列的重組載體；
[0019]5)將突變后重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)，獲得淀粉酶突變體。
[0020]表1淀粉酶突變引物序列
[0021]
【權(quán)利要求】
1.一種熱穩(wěn)定提高的淀粉酶突變體，其特征在于以SEQ ID N0.1所示序列為出發(fā)序列，將第193位天冬酰胺替換成苯丙氨酸或第206位蛋氨酸替換為苯丙氨酸或第240位賴氨酸替換成精氨酸或第242位絲氨酸替換成谷氨酰胺或丙氨酸或缺失第180位甘氨酸和181異亮氨酸或其任意組合得到的突變體。
2.權(quán)利要求1所述淀粉酶突變體，其特征在于第193位天冬酰胺替換成苯丙氨酸。
3.權(quán)利要求2所述淀粉酶突變體，其特征在于第242位絲氨酸替換成谷氨酰胺或丙氨酸。
4.權(quán)利要求1所述淀粉酶突變體，其特征在于缺失第180位甘氨酸和181異亮氨酸。
5.權(quán)利要求1所述突變體，其特征在于第193位天冬酰胺替換成苯丙氨酸、第242位絲氨酸替換成谷氨酰胺或丙氨酸、缺失第180位甘氨酸和181異亮氨酸。
6.能表達(dá)生產(chǎn)權(quán)利要求1所述淀粉酶突變體的載體。
7.能表達(dá)生產(chǎn)權(quán)利要求1所述淀粉酶突變體的基因工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
8.權(quán)利要求1所述淀粉酶突變體的制備方法，其特征在于，將SEQID N0.1所示淀粉酶活性位點(diǎn)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸通過(guò)PCR或化學(xué)合成的方法進(jìn)行替換或缺失，將第193位天冬酰胺替換成苯丙氨酸或第206位蛋氨酸替換為苯丙氨酸或第240位賴氨酸替換成精氨酸或第242位絲氨酸替換成谷氨酰胺或丙氨酸或缺失第180位甘氨酸和181異亮氨酸或其任意組合得到的突變 體。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，具體步驟如下: 1)根據(jù)嗜熱脂肪芽孢桿菌淀粉酶序列SEQID N0.1所示，采用化學(xué)全合成的方法全合成后克隆到質(zhì)粒pET-20b (+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒； 2)利用Swiss-model軟件對(duì)源自嗜熱脂肪芽孢桿菌淀粉酶進(jìn)行模擬，獲得淀粉酶空間結(jié)構(gòu)； 3)通過(guò)對(duì)淀粉酶的序列以及空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，確定要突變的氨基酸位點(diǎn)，分別為第193位、第206位、第240位、第242位、第180位及第181位； 4)設(shè)計(jì)突變引物，對(duì)淀粉酶基因序列進(jìn)行定點(diǎn)突變，將所述位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行替換或缺失，獲得含有突變淀粉酶序列的重組載體； 5)將突變后重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)，獲得淀粉酶突變體。
10.權(quán)利要求1-2任一所述淀粉酶突變體在洗滌、織物退漿、淀粉液化、醫(yī)藥、食品領(lǐng)域的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/56GK103789285SQ201410055374
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年2月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月19日
【發(fā)明者】吳敬, 李祝 申請(qǐng)人:江南大學(xué)