專利名稱：記錄蛋白質(zhì)相互作用及功能關(guān)系的檢測系統(tǒng)的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)相互作用檢測系統(tǒng)。
遺傳分析是了解調(diào)節(jié)生物過程的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的工具。遺傳學(xué)家進行的操作(例如，溫敏突變體的分離，雙突變體的構(gòu)建和分析，以及F1和F2子代的產(chǎn)生和觀測)定義了基因間的關(guān)系?；蜷g的這些抽象關(guān)系常常反映了基本生物事實。例如，上位性關(guān)系可提示一個基因正常地作用于另一個基因，使產(chǎn)生一種表型；等位特異性抑制關(guān)系可提示兩個基因產(chǎn)物物理地相互作用(Hartman和Roth，遺傳學(xué)進展(Adv.Genet.)171-105(1973)；Jarvik和Botstein，美國國家科學(xué)院院報702046-50(1973))，依賴關(guān)系可提示一個基因產(chǎn)物的作用在時間上優(yōu)先于另一個基因產(chǎn)物的作用(Hereford和Hartwell，分子生物學(xué)雜志84445-61(1974))。
從這些遺傳操作中得到的信息的特點是質(zhì)量非常高，但要獲得這些信息常常非常困難。近來對新編碼序列識別速率的提高重新喚起了人們對用于了解基因功能的全局系統(tǒng)方法的興趣。這些方法包括“雙雜交體”或“相互作用俘獲”法，它們已開發(fā)用于測定一個單餌與相互作用蛋白質(zhì)之間的接觸(Fields和Song，自然340245-6(1989)；Chien等，美國國家科學(xué)院院報88578-82(1991)；Cyuris等，細胞75791-803(1993)；Durfee等，基因發(fā)展(Genes Dev.)7555-69(1993)；Estojak等，分子與細胞生物學(xué)155820-9(1995))。這些系統(tǒng)中兩種蛋白質(zhì)之間的接觸定義了一種物理關(guān)系，這種關(guān)系經(jīng)常在生物學(xué)上具有重要意義。
在一個優(yōu)選的實施方案中，該方法還涉及將步驟(b)和步驟(c)的表達輸出結(jié)果與用下述宿主細胞測得的表達輸出結(jié)果進行比較，所述宿主細胞是(a)一個第一比較宿主細胞，它含有(ⅰ)一個可通過操作與包括蛋白質(zhì)結(jié)合位點的DNA序列相連的報道基因；(ⅱ)一個表達第一融合蛋白的第一融合基因，該第一融合蛋白包括與能特異性結(jié)合到蛋白質(zhì)結(jié)合位點上的結(jié)合部分共價結(jié)合的第一蛋白質(zhì)；和(ⅲ)一個表達第二融合蛋白的第二融合基因，該第二融合蛋白包括與基因活化部分共價結(jié)合的第三蛋白質(zhì)；或者(b)一個第二比較宿主細胞，它含有(ⅰ)可通過操作與包括蛋白質(zhì)結(jié)合位點的DNA序列相連的報道基因；(ⅱ)一個表達第一融合蛋白的第一融合基因，該第一融合蛋白包括與能特異性結(jié)合到蛋白質(zhì)結(jié)合位點上的結(jié)合部分共價結(jié)合的第二蛋白質(zhì)；和(ⅲ)一個表達第二融合蛋白的第二融合基因，該第二融合蛋白包括與基因活化部分共價結(jié)合的第三蛋白質(zhì)；或者(c)第一比較宿主細胞和第二比較宿主細胞。此外，在多個“雙餌”細胞之間或者在一個“雙餌”細胞和多個“單餌”細胞之間或者在二者之間可以進行許多種比較。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，至少第一或第二報道基因之一的表達水平可以降低；第一或第二蛋白質(zhì)結(jié)合位點之一是四環(huán)素操縱基因；第一或第二報道基因之一是URA3或lacZ；第一或第二報道基因之一產(chǎn)生一個可被第二細胞接收和檢測的信號；宿主細胞是酵母細胞或哺乳動物細胞；第一和第二報道基因可以同時表達；第一蛋白質(zhì)和第二蛋白質(zhì)是等位變體。
在第二個方面，本發(fā)明的特征在于一種檢測蛋白質(zhì)的方法，該蛋白質(zhì)介導(dǎo)另一種蛋白質(zhì)的狀態(tài)變化，所述方法涉及(a)提供一個宿主細胞，它含有(ⅰ)一個可通過操作與包括蛋白質(zhì)結(jié)合位點的DNA序列相連的報道基因；(ⅱ)一個表達第一融合蛋白的第一融合基因，該第一融合蛋白包括一個與結(jié)合部分共價結(jié)合的第一蛋白質(zhì)，所述結(jié)合部分能特異性結(jié)合到蛋白質(zhì)結(jié)合位點上；和(ⅲ)一個表達第二融合蛋白的第二融合基因，該第二融合蛋白包括一個能與第一蛋白質(zhì)相互作用并且與基因活化部分共價結(jié)合的第二蛋白質(zhì)，其中至少第一或第二蛋白質(zhì)之一可以顯示狀態(tài)變化；(b)使第一和第二蛋白質(zhì)相互作用；(c)測量報道基因的表達，作為第一蛋白質(zhì)和第二蛋白質(zhì)之間相互作用的量度；(d)向細胞中引進一個表達第三蛋白質(zhì)的第三基因；(e)測量報道基因的表達，在第三蛋白質(zhì)存在下報道基因表達的變化指示，第三蛋白質(zhì)介導(dǎo)第一或第二蛋白質(zhì)的狀態(tài)變化，從而導(dǎo)致第一蛋白質(zhì)和第二蛋白質(zhì)相互作用的能力改變。
在一個相關(guān)方面，本發(fā)明的特征在于另一種檢測蛋白質(zhì)的方法，該蛋白質(zhì)介導(dǎo)另一種蛋白質(zhì)的狀態(tài)變化，所述方法涉及(a)提供一個第一宿主細胞，它含有(ⅰ)一個可通過操作與包括蛋白質(zhì)結(jié)合位點的DNA序列相連的報道基因；(ⅱ)一個表達第一融合蛋白的第一融合基因，該第一融合蛋白包括一個與結(jié)合部分共價結(jié)合的第一蛋白質(zhì)，所述結(jié)合部分能特異性結(jié)合到第一蛋白質(zhì)結(jié)合位點上；和(ⅲ)一個表達第二融合蛋白的第二融合基因，該第二融合蛋白包括一個能與第一蛋白質(zhì)相互作用并且與基因活化部分共價結(jié)合的第二蛋白質(zhì)，其中至少第一或第二蛋白質(zhì)之一可以顯示狀態(tài)變化；(b)使第一和第二蛋白質(zhì)相互作用；(c)測量第一宿主細胞中報道基因的表達，作為第一蛋白質(zhì)和第二蛋白質(zhì)之間相互作用的量度；(d)提供一個第二宿主細胞，它含有(ⅰ)可通過操作與包括蛋白質(zhì)結(jié)合位點的DNA序列相連的報道基因；(ⅱ)表達第一融合蛋白的第一融合基因；(ⅲ)表達第二融合蛋白的第二融合基因；(ⅳ)表達第三蛋白質(zhì)的第三基因；(e)使第一和第二蛋白質(zhì)在第三蛋白質(zhì)的存在下相互作用；(f)測量第二宿主細胞中報道基因的表達，作為在第三蛋白質(zhì)存在下第一蛋白質(zhì)和第二蛋白質(zhì)之間相互作用的量度，與在第一宿主細胞中測得的報道基因表達相比，在第二宿主細胞中報道基因表達的變化指示，第三蛋白質(zhì)介導(dǎo)第一或第二蛋白質(zhì)的狀態(tài)變化，從而導(dǎo)致第一蛋白質(zhì)和第二蛋白質(zhì)相互作用的能力改變。
在上述各方法的優(yōu)選實施方案中，狀態(tài)的變化是構(gòu)象變化；顯示構(gòu)象變化的蛋白質(zhì)是Ras蛋白質(zhì)；宿主細胞是酵母細胞或哺乳動物細胞；第一融合蛋白和第三蛋白質(zhì)為響應(yīng)細胞外刺激而發(fā)生表達；報道基因產(chǎn)生可被第二細胞接收和檢測的信號。
在另一個相關(guān)方面，本發(fā)明的特征在于一種細胞，它包括(ⅰ)一個可通過操作與包括第一蛋白質(zhì)結(jié)合位點的DNA序列相連的第一報道基因；(ⅱ)一個可通過操作與包括第二蛋白質(zhì)結(jié)合位點的DNA序列相連的第二報道基因；(ⅲ)一個表達第一融合蛋白的第一融合基因，該第一融合蛋白包括一個與結(jié)合部分共價結(jié)合的第一蛋白質(zhì)，所述結(jié)合部分能特異性結(jié)合到第一蛋白質(zhì)結(jié)合位點上；(ⅳ)一個表達第二融合蛋白的第二融合基因，該第二融合蛋白包括一個與結(jié)合部分共價結(jié)合的第二蛋白質(zhì)，所述結(jié)合部分能特異性結(jié)合到第二蛋白質(zhì)結(jié)合位點上；和(ⅴ)一個表達第三融合蛋白的第三融合基因，該第三融合蛋白包括一個與基因活化部分共價結(jié)合的第三蛋白質(zhì)。
在優(yōu)選的實施方案中，至少第一或第二報道基因之一的表達水平可以降低；第一或第二蛋白質(zhì)結(jié)合位點之一是四環(huán)素操縱基因；第一或第二報道基因之一是URA3或lacZ；第一或第二報道基因之一產(chǎn)生一個可被第二細胞接收和檢測的信號；宿主細胞是酵母細胞或哺乳動物細胞。
在另一個相關(guān)方面，本發(fā)明的特征在于一種報道基因，它包括一個可通過操作與編碼可檢測產(chǎn)物的基因(例如URA3基因或lacZ基因)相連的四環(huán)素操縱基因。
在最后一個方面，本發(fā)明的特征在于一種檢測候選蛋白質(zhì)是否與轉(zhuǎn)錄激活物相互作用的方法，該方法涉及(a)提供一個宿主細胞，它含有(ⅰ)一個表達水平可以降低的報道基因，該報道基因通過操作與包括蛋白質(zhì)結(jié)合位點的DNA序列相連；(ⅲ)一個表達第一融合蛋白的第一融合基因，該第一融合蛋白包括與結(jié)合部分共價結(jié)合的轉(zhuǎn)錄激活物，所述結(jié)合部分能特異性結(jié)合到蛋白質(zhì)結(jié)合位點上；和(ⅴ)一個表達第二融合蛋白的第二融合基因，該第二融合蛋白包括與基因活化部分共價結(jié)合的候選蛋白質(zhì)；(b)檢測報道基因表達的增加，作為候選蛋白質(zhì)與轉(zhuǎn)錄激活物之間相互作用的指示。
在優(yōu)選的實施方案中，報道基因是URA3基因；表達水平是由6-氮尿嘧啶降低的；蛋白質(zhì)結(jié)合位點是四環(huán)素操縱基因；表達水平是由四環(huán)素或四環(huán)素衍生物降低的；宿主細胞是酵母細胞或哺乳動物細胞。
“報道基因”是指其表達可以被測定的核酸序列；這類基因包括但不限于lacZ，氨基酸生物合成基因，和哺乳動物氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因。例如，報道基因可以通過細胞活力的變化或顏色反應(yīng)來測定。
“表達輸出”是指報道基因表達的任何可測量的變化。
“蛋白質(zhì)結(jié)合位點”是指可被蛋白質(zhì)或肽識別和結(jié)合的核酸序列。
“轉(zhuǎn)錄激活物”是指能夠增加其結(jié)合的基因的表達的氨基酸序列?！盎蚧罨糠帧笔侵改軌蛟黾踊虮磉_的這種轉(zhuǎn)錄激活物的全部或一部分。
“四環(huán)素衍生物”是指與四環(huán)素有關(guān)并能抑制四環(huán)素阻抑物與四環(huán)素操縱基因結(jié)合的化合物。舉例性的四環(huán)素衍生物是無水四環(huán)素。
“狀態(tài)的變化”是指蛋白質(zhì)的改變其活性的任何物理或化學(xué)變化。狀態(tài)變化的實例包括磷酸化模式或構(gòu)象的變化。
通過下列詳細描述和權(quán)利要求書，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將是顯而易見的。詳細描述首先描述附圖。
圖2是一張表，顯示了記錄有關(guān)相互作用關(guān)系A(chǔ)1和A2的邏輯“與”和判別關(guān)系(“Ls1”和“Ls2”)的細胞。細胞含有所示的餌和犧牲蛋白質(zhì)；犧牲者僅在半乳糖和棉子糖培養(yǎng)基上表達。在所示培養(yǎng)基上的生長或藍色反應(yīng)指示了報道基因輸出。對于“與”關(guān)系來說，犧牲蛋白質(zhì)與兩個餌接觸并激活兩個報道基因(TetOp-URA3和LexOp-LacZ)。對于Ls1關(guān)系來說，犧牲蛋白質(zhì)僅與LexA融合基因餌接觸，并僅激活LexOp-LacZ報道基因。類似地，在Ls2關(guān)系中，犧牲蛋白質(zhì)僅與TetR融合基因餌接觸，并僅激活TetOp-URA3報道基因。
圖3A-3C是一系列結(jié)果，顯示了記錄有關(guān)輸出蛋白質(zhì)的邏輯與運算的細胞。圖3A是一張顯示LexOp-LacZ報道基因在CWXY2細胞1和2中的表達的表；表達由在LHWK/Gal+Raff+Xgal平板(見下文)上的藍色強度以及它們的β-半乳糖苷酶活性(以Miller單位表示)來指示。圖3B用圖式說明了在Gal+Raff+Xgal培養(yǎng)基(見下文)上的、帶有TetR-Cdc25(907-1589)或TetR-GAP的兩個細胞。在Gal+Raff平板上的細胞1中，TetR-Cdc25給LexA-RasA186加載上GTP，使得更多的B42-c-Raf1結(jié)合并使LexAOp-lacZ報道基因的轉(zhuǎn)錄增加。在細胞2中，TetR-GAP刺激Ras GTP酶活性，使得更多的LexA-Ras為GDP形式，從而導(dǎo)致較少的B42-c-Raf1結(jié)合，并使LexAOp-lacZ報道基因的轉(zhuǎn)錄降低。圖3C是一張真值表，描述了有關(guān)蛋白質(zhì)輸入的運算結(jié)果。在該圖中，第二列中的“1”分別表示存在TetR-Gap或TetR-Cdc25，第三列中的“0”或“1”分別表示低或高輸出的β-半乳糖苷酶。
圖4用圖式說明了產(chǎn)生可被生產(chǎn)者細胞或第二、受體細胞閱讀的輸出的細胞。
圖5用圖式說明了具有四個輸入-輸出通道的細胞。
圖6用圖式說明了充當(dāng)晶體管的整個生物學(xué)回路。
如本文所述，本發(fā)明提供了用于檢測或記錄兩個或多個蛋白質(zhì)之間的復(fù)合關(guān)系的方法和試劑。許多這樣的關(guān)系，例如，“橋連”(或連接)和“判別”相互作用，可用于了解基因功能。如下所述，通過對新的和現(xiàn)有的雙雜交細胞相互作用的表型輸出進行邏輯運算，可以確定各途徑和復(fù)合物中蛋白質(zhì)功能的詳細模型。由這些細胞檢測的蛋白質(zhì)關(guān)系與經(jīng)典遺傳關(guān)系如上位關(guān)系類似，但它們可以在嚴(yán)格的分析準(zhǔn)則內(nèi)進行解釋，并且它們可以針對整個基因組的產(chǎn)物系統(tǒng)地進行。此外，記錄這類關(guān)系的細胞可以就蛋白質(zhì)輸入進行邏輯運算，并因此可以定義構(gòu)造生物學(xué)計算裝置的路徑。初步考慮雙雜交系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)邏輯關(guān)系在經(jīng)典的(“單餌”)雙雜交系統(tǒng)中，報道基因的輸出取決于與DNA結(jié)合的餌和激活標(biāo)記的犧牲者之間的相互作用。由一些報道基因，例如URA3表達的遺傳標(biāo)記允許對報道基因的轉(zhuǎn)錄進行選擇，并因此缺乏相互作用(Le Douarin等，核酸研究23876-8(1995))。這些系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)之間的關(guān)系可以用符號邏輯項來描述。
從這方面來考慮，餌(Ba1)和犧牲者(P1)間的接觸定義了一個變量(A1)，此處叫做接觸關(guān)系。由于A1是由報道基因輸出運算定義的，因此A1項也用來指報道基因輸出。關(guān)于此關(guān)系有四種可能的布爾運算或函數(shù)(Schneeweiss，布爾函數(shù)工程學(xué)應(yīng)用與計算機程序(Springer-Verlag，Berlin，New York，1989))。其中兩種是常數(shù)函數(shù)F1(A1)=0和F2(A2)=1，兩種是真函數(shù)F3(A1)=A1和F4(A1)=非A。
在單餌系統(tǒng)中，報道基因輸出的表型結(jié)果可記錄這些有關(guān)接觸關(guān)系的運算中的兩種-F3和F4。結(jié)果顯示在表1中。在該表中，A1表示餌Ba1和犧牲者P1之間的接觸關(guān)系，該關(guān)系由報道基因的輸出來測量。因此，A1值(0和1)指的是接觸關(guān)系的計算結(jié)果和報道基因的斷續(xù)狀態(tài)?！癆1值”顯示了兩種可能的A1值(0和1或斷開和連續(xù))?！斑\算”顯示了有關(guān)A1的兩種容許的運算(函數(shù))。兩小列“運算結(jié)果”指的是關(guān)于A1的運算結(jié)果?！疤娲Q”給出了這些運算的俗名?！敖忉尅泵枋隽损D和犧牲者蛋白質(zhì)之間相互作用的狀態(tài)?！岸x表型”給出了單餌系統(tǒng)中接觸關(guān)系的表型，“生物學(xué)關(guān)系舉例”給出了可導(dǎo)致這類輸出的生物學(xué)狀況的實例。
在表1中，F(xiàn)3和F4都具有重要的生物學(xué)關(guān)系。從單餌系統(tǒng)考慮，其中Ba1和P1間的接觸(例如由于這些蛋白質(zhì)發(fā)生異源二聚合)產(chǎn)生了一個正輸出(在X-Gal上為藍色，在無尿嘧啶培養(yǎng)基上生長)，而沒有這種接觸(例如由于突變或被肽aptamer破壞)(Colas等，自然380548-550(1996))則產(chǎn)生一個負(fù)輸出(在X-Gal上為白色，在5-FOA培養(yǎng)基上生長)(表1)。在5-FOA培養(yǎng)基上生長的細胞與進行有關(guān)接觸關(guān)系的邏輯非運算的裝置類似，或者另一方面，作為記錄狀態(tài)(非A1)的細胞。檢測更復(fù)雜蛋白質(zhì)關(guān)系的細胞構(gòu)建可同時選擇和對抗兩種不同蛋白質(zhì)間相互作用的細胞(

圖1A-1C)。這種雙餌相互作用阱利用了LexA和TetR的DNA結(jié)合部分，LexA和TetR是細菌轉(zhuǎn)座子Tn10的四環(huán)素阻抑物(Gossen和Bujard，國家科學(xué)院院報895547-51(1992))。LexA和TetR融合餌蛋白質(zhì)是在酵母細胞中表達的，該酵母細胞中還含有整合型TetOp-URA3報道基因和附加型LexAOp-lacZ報道基因。餌在這些“雙餌”細胞中的表達處于ADH1啟動子的控制下。TetOp-URA3報道基因整合到LYS2基因中。pSH18-34的衍生物-LexAOp-lacZ報道基因攜帶在pCXW24上，pCXW24是帶有LYS2標(biāo)記的2μm質(zhì)粒。犧牲者載體是pJG4-5，其GAL1啟動子有條件地指導(dǎo)激活標(biāo)記的蛋白質(zhì)從2μm TRP1質(zhì)粒的表達(Gyuris等，細胞75791-803(1993))。雙餌相互作用阱中有關(guān)接觸關(guān)系的邏輯運算在雙餌細胞中，兩種接觸關(guān)系(和相應(yīng)的報道基因的輸出)表達為布爾變量A1和A2。關(guān)于這些變量有16種可能的運算(Schneeweiss，布爾函數(shù)工程學(xué)應(yīng)用與計算機程序(Springer-Verlag，Berlin，New York，1989))，其中4種記錄在這些細胞中。這些運算稱作“與”、“或非”，以及兩種判別運算-邏輯狀態(tài)1(Ls1)和邏輯狀態(tài)2(Ls2)?！芭c”、“Ls1”和“Ls2”被認(rèn)為代表了特別有用的確定蛋白質(zhì)功能的運算。這些運算綜合顯示在表2中。在該表中，A1表示Ba1和P1之間的接觸關(guān)系，該關(guān)系由TetOp-URA3報道基因的輸出來測量。A2表示Ba2和P2之間的接觸關(guān)系，該關(guān)系由LexAOp-lacZ報道基因的輸出來測量。A1和A2值(0和1)再次用于指接觸關(guān)系的計算結(jié)果和報道基因的計算結(jié)果(斷續(xù)狀態(tài))。四小列“變量值”表示兩個變量值的可能的四種不同組合?！斑\算”顯示了在此系統(tǒng)中有關(guān)這些變量的四種可能的運算?！疤娲Q”給出了這些運算的常用名?！敖忉尅泵枋隽损D和犧牲者蛋白質(zhì)之間相互作用的狀態(tài)。“定義表型”給出了單餌系統(tǒng)中接觸關(guān)系的表型，“生物學(xué)關(guān)系舉例”給出了可導(dǎo)致這類輸出的生物學(xué)狀況的實例。
為了測試該系統(tǒng)的一般利用，使用一組說明性蛋白質(zhì)，稱作RasA186，RasA15A186，RasV12A186，GAP，hSos1(殘基601-1019)，Cdc25(殘基907-1589)，c-Raf1(殘基1-313)，Max和Mxil。Harveyras基因產(chǎn)物Ras是一種GTP酶，它以兩種不同構(gòu)象存在，一種是與GDP結(jié)合的(失活)形式，一種是與GTP結(jié)合的(活化)形式。Ras在這些構(gòu)象之間循環(huán)的事實使得它是控制細胞增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的開關(guān)蛋白質(zhì)(Boguski和McCormack，自然366643-654(1993))。本文中所述的所有Ras蛋白質(zhì)的186位上Cys變化為Ala，這使得法尼基化位點失活，蛋白質(zhì)的表觀核濃度增加。RasA186以GDP和GTP結(jié)合形式的混合物存在，而RasA15A186和RasV12A186分別主要以GDP和GTP結(jié)合形式存在。刺激Ras的GTP酶活性的GAP結(jié)合到與GTP結(jié)合的Ras上。c-Raf1是Ras的一個下游目標(biāo)，它也結(jié)合與GTP結(jié)合的Ras。與此相對，hSos1和Cdc25二者均激活Ras，它們僅結(jié)合到與GDP結(jié)合的Ras上。Max和Mxil緊密地異源二聚合，它們用作陽性對照(Zervos等，細胞79388(1993))。
圖2顯示了記錄邏輯與運算的雙餌細胞。該關(guān)系是由可以與兩個餌相互作用的蛋白質(zhì)完成的，諸如各種途徑中的橋連蛋白質(zhì)。在該實驗中，攜帶B42-RasA186的酵母菌株CWXY2作為犧牲者，TetR-c-Raf1和LexA-hSos1作為餌，TetOp-URA3和LexAOp-lacZ作為報道基因。B42-RasA186與TetR-c-Raf1和LexA-hSos1均相互作用。細胞在Xgal上是藍色的，并且在沒有尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長。這種橋連或連接關(guān)系與“Ras與兩種蛋白質(zhì)均相互作用”的觀念一致，并且提示激活兩種報道基因的蛋白質(zhì)可以從基因組范圍的篩選(genome-widescreens)中選擇。
另外，圖2顯示了還記錄判別關(guān)系-Ls1和Ls2的雙餌系統(tǒng)。這些關(guān)系預(yù)期在與一種餌相互作用而不與另一種餌作用的蛋白質(zhì)中存在。此時，在表達TetR-RasV12A186和LexA-Max餌以及B42-c-Raf1犧牲者的細胞中，Ras-Raf相互作用激活了TetOp-URA3報道基因，這些細胞在沒有尿嘧啶的培養(yǎng)基中生長；Raf不與LexA-Max相互作用，因此不激活lacZ報道基因。另一方面，在表達TetR-RasV12A186和LexA-Max餌以及B42-Mxil犧牲者的細胞中，Max-Mxil相互作用激活了LexAop-LacZ報道基因，這些細胞在Xgal上變?yōu)樗{色；Mxil不與Ras相互作用，因此不激活URA3報道基因。
此外，圖2中的結(jié)果顯示這些細胞可以把兩種密切相關(guān)的等位變體區(qū)別開來。在表達TetR-RasA15A186、LexA-RasV12A186和B42-c-Raf1的細胞中，Raf/RasV12A186相互作用激活了LexAop-LacZ報道基因的表達；這些細胞在Xgal上變藍，但不在沒有尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長。與此相對，在表達TetR-RasA15A186、LexA-RasV12A186和B42-Cdc25的細胞中，Cdc25/RasA15A186相互作用激活了TetOp-URA3報道基因，并允許這些細胞在沒有尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長，但使其在Xgal上保持白色。此結(jié)果提示，這些細胞可以從基因組文庫或組合文庫中鑒別出與對疾病狀態(tài)具有特異性的等位蛋白質(zhì)變體相互作用的蛋白質(zhì)和肽。將等位變體區(qū)別開的肽aptamers的鑒別用含有TetR-RasV12和LexA-RasA15的雙餌細胞來分離特異性地與RasV12相互作用的肽aptamer文庫中的成員。URA+文庫轉(zhuǎn)化體針對lacZ-細胞進行篩選，據(jù)推測lacZ-細胞含有不與LexA-RasA15相互作用的aptamers。然后將編碼aptamers的質(zhì)粒從這些lacZ+細胞中拯救出來并重新確認(rèn)它們的表型。使用該系統(tǒng)，鑒別出兩種有差別的aptamers-Pep22和Pep104。Pep22既與RasV12相互作用，也與RasA15相互作用，相反，Pep104僅與RasV12相互作用。特別是，含有Pep22的細胞在無尿嘧啶培養(yǎng)基上生長，并且在X-gal培養(yǎng)基上為藍色。含有Pep104的細胞在無尿嘧啶培養(yǎng)基上生長，但在X-gal培養(yǎng)基上為白色。這些結(jié)果證明了該系統(tǒng)在特異性肽aptamers的選擇中的功用。對于Pep22，第二個餌通過消除潛在的假陽性而增加了該系統(tǒng)的選擇性，所述假陽性有可能是由于單報道基因的假象激活引起的。對于Pep104，第二個餌容許檢測對在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中有活性的蛋白質(zhì)等位形式具有特異性的aptamers。Pep22和Pep104的序列分別是DMDWFFRFYASVSRLFRHLH(SEQ ID NO15)和FWQATLRLVS DKLILLYPDP(SEQ ID NO16)。有關(guān)蛋白質(zhì)輸入的邏輯運算細胞也可以對蛋白質(zhì)輸入進行邏輯運算，并通過在輸出中的改變記錄那些運算的結(jié)果。圖3A-3C顯示了有關(guān)蛋白質(zhì)輸入的邏輯與運算。在表達LexA-RasA186、B42-c-Raf1和TetR-GAP的細胞中，LexAop-lacZ報道基因的輸出低(在Xgal培養(yǎng)基上為淡藍色)，大概是由于GAP使大多數(shù)Ras成為與GDP結(jié)合的構(gòu)象狀態(tài)。相反，TetR-Cdc25的輸入增加了RasA186/c-Raf1相互作用，正如在Xgal平板上的藍色的強度所顯示的，大概是由于Ras變成了Raf結(jié)合構(gòu)象。在該實驗中，細胞有兩個輸入，其中之一-B42-c-Raf1(邏輯值1)是經(jīng)常存在的，而另一個要么是TetR-GAP(邏輯值0)要么是TetR-Cdc25(邏輯值1)；輸出或高(1)或低(0)。在這種情況下，LexAop-lacZ報道基因的輸出因此受到LexA-Ras開關(guān)蛋白質(zhì)的控制，該開關(guān)蛋白質(zhì)的構(gòu)象取決于輸入的值。
在可代替上述系統(tǒng)的另一個系統(tǒng)中，Cdc25可以替換為hSos1，所得到的結(jié)果類似。另外，可以進一步調(diào)節(jié)系統(tǒng)成分的表達。例如，在上述系統(tǒng)中，B42-c-Raf1可以使用GAL1啟動子表達，和/或Cdc25和hSos1可以從通常被TetR-sin3阻抑的啟動子表達。這導(dǎo)致B42-c-Raf1的表達依賴于生長培養(yǎng)基中半乳糖的存在，Cdc25和hSos1的表達依賴于生長培養(yǎng)基中四環(huán)素或四環(huán)素衍生物的存在。在這些系統(tǒng)中，細胞對兩種不同的細胞外輸入作出反應(yīng)，一種控制修飾蛋白質(zhì)的表達，另一種控制犧牲者的表達。雙雜交系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)關(guān)系在上述實驗的基礎(chǔ)上，報道基因在單餌雙雜交系統(tǒng)中的輸出可以看作是反映了兩種基本邏輯狀態(tài)。報道基因的激活具體表達了餌1(Ba1)和犧牲者(P1)之間的接觸關(guān)系A(chǔ)1。非A1(Ba1和P1之間)定義了沒有相互作用，例如由相互作用對中的突變引起的，或者定義了第三蛋白質(zhì)或肽aptamer的相互作用的破壞(Colas等，自然380548-550(1996))。具有獨立功能性相互作用報道基因的細胞的構(gòu)建如上所述，構(gòu)建能通過制備相互作用阱的變型而檢測更復(fù)雜的蛋白質(zhì)關(guān)系的細胞，相互作用阱的變型是利用LexA和TetR的DNA結(jié)合部分，LexA和TetR是細菌轉(zhuǎn)座子Tn10的四環(huán)素阻抑物。含有這些部分的融合蛋白在還含有TetOp-URA3和LexAop-lacZ報道基因的細胞中表達為兩個餌。該系統(tǒng)容許在單個細胞中同時測定兩組基因的相互作用。
包含TetR餌和TetOp-URA3報道基因顯著促進了相互作用阱的應(yīng)用。依賴于TetOp-URA3報道基因的表型比依賴于lacZ和LEU2報道基因的表型更敏感(參見，例如Gyuris等，細胞75791-803(1993)和Estojak等，分子與細胞生物學(xué)155820-9(1995))，它們促進弱相互作用的檢測。另外，URA3和LacZ報道基因均可定量測定(Shostak等，分析生物化學(xué)191365-9(1990))。而且，該URA3報道基因的敏感度可以以兩種方式下調(diào)。URA3報道基因的表達可以用6-氮尿嘧啶滴定測量，6-氮尿嘧啶是URA3基因產(chǎn)物(乳清苷-5’-一磷酸脫羧酶)(OMP脫羧酶)的一種抑制劑(Le Douarin等，核酸研究23876-8(1995))。四環(huán)素或其衍生物(例如無水四環(huán)素)也可以降低報道基因的活性，它們破壞了TetR餌與Tet操縱基因的結(jié)合。優(yōu)選地，這類化合物在平板上以不超過100μg/ml的濃度使用。這兩種抑制劑減小了URA3報道基因的敏感度，使其可以與激活轉(zhuǎn)錄的餌一起使用，并使其與lacZ一起用于相互作用親和力的粗略估計。此外，URA3報道基因容許使用5-FOA來針對基因表達進行選擇(Boeke等，分子與普通遺傳學(xué)197345-6(1984))。在這種情況下，四環(huán)素和6-氮尿嘧啶可以調(diào)節(jié)所選定的轉(zhuǎn)錄的閾值，促進打斷特異性蛋白質(zhì)相互作用的肽aptamers的選擇。二元和高級蛋白質(zhì)關(guān)系的邏輯分析如表2中所示，雙餌細胞記錄四種邏輯關(guān)系或非、與、Ls1和Ls2。三種是特別重要的。與兩個餌均接觸的犧牲蛋白質(zhì)(連接蛋白質(zhì))發(fā)現(xiàn)為與關(guān)系A(chǔ)1(Ba1和P1之間)和A2(Ba2和P1之間)(表2)。這類蛋白質(zhì)的鑒別可用于稠密的基因網(wǎng)絡(luò)圖的連續(xù)構(gòu)建和以前不知道是相關(guān)的連接途徑。這樣的各組相互作用蛋白質(zhì)有時稱作“蛋白質(zhì)重疊群”。
判別關(guān)系Ls1和Ls2也是重要的。這些關(guān)系相對復(fù)雜例如，Ls1關(guān)系涉及有關(guān)兩種相互作用的兩種運算非A1(Ba1和P1之間)和A2(Ba2和P1之間)。這些運算具有許多生物學(xué)聯(lián)系，其中記錄這種關(guān)系的細胞容許檢測與無關(guān)蛋白質(zhì)、等位變體、和不同構(gòu)象態(tài)發(fā)生不同相互作用的蛋白質(zhì)(圖2)，還容許檢測與不同修飾態(tài)發(fā)生不同相互作用的蛋白質(zhì)。使用這些關(guān)系來觀測組合文庫和基因組產(chǎn)物，使得可選擇與由疾病狀態(tài)等位基因編碼的蛋白質(zhì)特異性相互作用的蛋白質(zhì)，或者與因不同的剪接或翻譯后修飾而與野生型不同的蛋白質(zhì)特異性相互作用的蛋白質(zhì)。高級蛋白質(zhì)關(guān)系的分析可從雙餌細胞中推斷出的蛋白質(zhì)關(guān)系并不總是與單餌細胞顯示的那些相同。例如，如果Ba1和Ba2均發(fā)生低聚反應(yīng)形成一個與P相互作用的表面，則無論是Ba1/P還是Ba2/P相互作用都不會在單餌細胞中檢測到。接觸關(guān)系中的這種差異是有用的，因為從單餌細胞和雙餌細胞獲得的綜合數(shù)據(jù)可使實驗者作出有關(guān)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、時序序列、和翻譯后修飾與蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)系的推斷。
表3顯示了有關(guān)三種蛋白質(zhì)X、Y和Z之間物理相互作用的推論(ⅰ)從檢測接觸關(guān)系A(chǔ)1(X和Z之間)、A2(Y和Z之間)和A3(X和Y之間)的雙餌細胞的可能的輸出入手。在該表中，“報道基因輸出”顯示了由在三個單餌細胞中和單個雙餌細胞中的報道基因的輸出記錄的接觸關(guān)系的狀態(tài)。X和Z融合到活化域中形成犧牲者[P(X)和P(Z)]，Y和X融合到DNA結(jié)合域中形成餌[Ba(X)和Ba(Y)]。在雙餌細胞中，報道基因的輸出顯示了蛋白質(zhì)X、Y和Z的接觸關(guān)系的狀態(tài)，其中它們與兩個DNA結(jié)合域[Ba1(X)或Ba2(Y)]之一和活化域[P(Z)]融合?！拔锢斫忉尅憋@示了有關(guān)組合的單餌和雙餌數(shù)據(jù)或者僅有關(guān)單餌數(shù)據(jù)的該組報道基因輸出的一種可能的生物學(xué)解釋。盡管表3中的所有模式可以不具有生物學(xué)關(guān)系，但許多已被觀察到，例如，餌1和依賴于餌2存在的犧牲者的相互作用。諸如表3中描述的那些指示單餌和雙餌數(shù)據(jù)的結(jié)合的實驗可用于定序蛋白質(zhì)在各途徑和復(fù)合物中的功能。有關(guān)基因功能分析的應(yīng)用該雙餌系統(tǒng)，特別是與現(xiàn)有的單餌系統(tǒng)結(jié)合時，擴大了酵母相互作用技術(shù)在分析各途徑中基因功能時的應(yīng)用范圍。它可幫助鑒別將蛋白質(zhì)的等位變體區(qū)別開的蛋白質(zhì)和肽aptamers。另外，來自雙餌細胞的數(shù)據(jù)(或許由單獨的實驗產(chǎn)生)和來自單餌細胞的數(shù)據(jù)(可能從基因組范圍的觀測得到)的結(jié)合使得可詳細地分析各途徑和復(fù)合物中的蛋白質(zhì)功能和接觸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。它還使得可更精確地分析多蛋白質(zhì)復(fù)合物中蛋白質(zhì)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，并且它提供了穩(wěn)健的、可度量的、半自動的方式來區(qū)別蛋白質(zhì)相互作用的可供選擇的模型。此外，由于以這種方式定義的蛋白質(zhì)間的關(guān)系能對它們自身進行系統(tǒng)分析，因此它們可以在工業(yè)上被確定。朝向以蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)的邏輯環(huán)路上述實驗使用了在兩種構(gòu)象態(tài)之間循環(huán)的蛋白質(zhì)Ras，和與處于構(gòu)象態(tài)之一的Ras結(jié)合的激活標(biāo)記的蛋白質(zhì)Raf。Ras開關(guān)的狀態(tài)及其由轉(zhuǎn)錄測量的輸出顯示根據(jù)輸入蛋白質(zhì)是否為GAP或Cdc25而變化。在這些實驗中，細胞充當(dāng)與門，其中一個輸入B42-c-Raf1保持恒定(邏輯值1)，另一個或者是GAP(邏輯值0)或者是Cdc25(邏輯值1)，由報道基因的表達引起的表型構(gòu)成輸出。對于B42-c-Raf1和GAP，輸出具有低β-半乳糖苷酶活性(0)。對于B42-c-Raf1和Cdc25，輸出具有高β-半乳糖苷酶活性(1)。盡管它還由報道基因的表達計分，但這種與運算不是有關(guān)早先描述的那些接觸關(guān)系的運算。相反，該運算是關(guān)于蛋白質(zhì)輸入的，在這種情況下，細胞充當(dāng)真邏輯門。
在本文所描述的細胞中，為了改變輸入，使用不同的DNA構(gòu)造表達相互作用蛋白質(zhì)；為了測量輸出，需要人或其他觀察者。整個基于生物學(xué)轉(zhuǎn)錄的邏輯環(huán)路的構(gòu)建需要用邏輯輸入代替這些輸入，所述邏輯輸入會響應(yīng)細胞外刺激而發(fā)生變化，諸如分泌型肽信息素或光的刺激，并用產(chǎn)生這種刺激的輸出代替這些輸出。
圖4-6中顯示了應(yīng)用這種生物學(xué)環(huán)路的示范性系統(tǒng)。特別是，在圖4中，描述了一個生產(chǎn)可被生產(chǎn)者細胞閱讀或被一個響應(yīng)輸入的第二受體細胞閱讀的輸出的細胞。如圖4中所述，輸入蛋白質(zhì)酵母α-因子的加入導(dǎo)致了TGF-β輸出通過G蛋白質(zhì)途徑的表達，輸出可被相同或第二細胞接受，并可在受體細胞中產(chǎn)生表型變化。圖4還描述了一個系統(tǒng)，其中TGF-β輸入蛋白質(zhì)結(jié)合到其受體上，導(dǎo)致LexA-Madd(也叫做LexA-Smad)蛋白質(zhì)的激活和易位。該LexA-Madd蛋白質(zhì)觸發(fā)酵母α-因子輸出的表達，信號再次可被生產(chǎn)者細胞閱讀或被一個第二受體細胞閱讀，并可在受體細胞中產(chǎn)生表型變化。
圖5擴展了該系統(tǒng)并說明了一個具有四個不同輸入-輸出通道的細胞，由此允許各種各樣的邏輯運算。在圖5中，輸入蛋白質(zhì)α-因子、TGF-β、δ和緩激肽分別與α-因子受體、TGF-β受體、凹口受體和緩激肽受體相互作用，激活各途徑產(chǎn)生可被細胞系統(tǒng)例如作為轉(zhuǎn)錄變化閱讀的輸出蛋白質(zhì)的表達。當(dāng)輸入和輸出選項的數(shù)目增加時，可被編程的通道的數(shù)目增加；例如，具有10個輸入/輸出通道的細胞可以以210編程，或多于1000個不同狀態(tài)。在一個增加輸入/輸出通道的示范性方法中，蛋白質(zhì)，諸如上面所討論的LexA-Smad蛋白質(zhì)，可以人工改造成含有不同aptameric部分，每個都帶來在嵌合體上的不同受體特異性。另外，在這些系統(tǒng)中，輸入可以是一些其他細胞外刺激，諸如光或特定波長的觸發(fā)特殊感光途徑的光，而不僅僅是蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，在這樣一個系統(tǒng)中，輸出是熒光蛋白質(zhì)，例如綠色、紅色或藍色熒光蛋白質(zhì)。
圖6中描述了一個最終類型的完全生物學(xué)回路。該細胞代表一個示范性“晶體管”。在該細胞中，在綠光的存在下，報道基因被觸發(fā)來表達HIV蛋白酶。然后該蛋白酶切割開將藍色熒光蛋白質(zhì)-綠色熒光蛋白質(zhì)嵌合體連接在一起的靶接頭，釋放出這兩種成分，并導(dǎo)致綠光輸出大大降低。
上述完全生物學(xué)邏輯裝置可能不是非常迅速的。盡管這些開關(guān)蛋白質(zhì)之一-Ras可以在數(shù)毫秒內(nèi)循環(huán)，大量信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以在數(shù)分鐘內(nèi)提供輸入(Bray，自然376307-312(1995))，但報道基因輸出可需要數(shù)分鐘到數(shù)小時成為可檢測的。不過，由于所需的接近DNA的構(gòu)建工作可以使用簡單的工藝完成，因此有可能基因表達將保持有用的輸出。通過迅速增加自然和人工選定的、具有有用的變構(gòu)和尋靶性能的蛋白質(zhì)域的數(shù)目，可以促進這類回路的構(gòu)建(Colas等，自然380548-550(1996))。因此有可能這種基于轉(zhuǎn)錄的技術(shù)提供了進行生物學(xué)計算的及早途徑。材料與方法雙餌系統(tǒng)在上述實驗中，用載體pEG202和pJG4-5作為Ba2和犧牲者表達質(zhì)粒(Gyuris等，細胞75791-803(1993))。另外，構(gòu)建Ba1表達質(zhì)粒、pCWX200、LexAOp-LacZ報道基因質(zhì)粒、pCWX24和TetOp-URA3報道基因載體，并將它們整合到釀酒酵母菌株中，如下所述建造CWXY1和CWXY2。
TetR-融合蛋白表達載體pCWX200的構(gòu)建。pCWX200攜帶2μm復(fù)制基因和LEU2標(biāo)記。啟動子和克隆區(qū)由pEG202產(chǎn)生，骨架來自于pBC100，pBC100是Yeplac181的衍生物(Gietz和Sugino，基因74527-534(1988))。為了除去pBC100多接頭區(qū)(從AccⅠ到EcoRⅠ)以及編碼β-半乳糖苷酶的氨基酸末端片段的DNA，載體用NarⅠ/AccⅠ消化并再連接得到pCWX100。然后通過用HindⅢ消化pCWX100而刪除HindⅢ位點，用Klenow使突出端平鈍，并再連接得到pCWX100△HindⅢ。然后將含有ADH1啟動子、多接頭LexA和ADH1終止子的pEG202的SphⅠ片段插入到pCWX100△HindⅢ的SphⅠ位點，得到pCWX150(Gyuris等，細胞75791-803(1993)和Estojak等，分子與細胞生物學(xué)155820-9(1995))。最后，用編碼Tet阻抑物(TetR)的具有EcoR1/HindⅢ末端的PCR片段代替pCWX150的EcoRⅠ/HindIII LexA片段(Zervos等，細胞79388(1993))。所得質(zhì)粒pCWX200具有與pEG202等價的克隆位點(Gossen和Bujard，國家科學(xué)院院報895547-51(1992))。
LexAop-laeZ報道基因pCWX24的構(gòu)建。LexAop-lacZ報道基因、LYS2標(biāo)記、2μm復(fù)制基因、和pCWX24質(zhì)粒骨架的其余部分分別來自中間質(zhì)粒pCWX221、pCWX01和pCWX21。
pCWX221的構(gòu)建。為了構(gòu)建該質(zhì)粒，SH18-34T用KpnⅠ完全消化，用BamH1進行部分消化，并將該載體連接到pBluescript的BamHⅠ/KpnⅠ消化的骨架上。LexAOp-LacZ報道基因在pCWX221的NotⅠ/KpnⅠ片段上。
pCWX01的構(gòu)建。為了構(gòu)建pCWX01，YeP426用SalⅠ/ClaⅠ消化(Ma等，基因58201-16(1987))，得到一個約5600bp的ClaⅠ-XbaⅠ片段，它攜帶LYS2(Barnes和Thorner，分子與細胞生物學(xué)62828-38(1996))和約300bp的pBR322四環(huán)素抗性基因。該片段與用ClaⅠ/SalⅠ消化的(pBluescript△KpnⅠ)pBS△KpnⅠ骨架連接，生成pCWX01。
pCWX21的構(gòu)建。pRF24用NotⅠ消化并用Klenow平端化處理得到pCWX20△NotⅠ。為了制備pCWX21，pCWX20△NotⅠ用BamHⅠ消化并連接到自退火的5’-GATCCGCGGCCGCG-3’(SEQ ID NO1)上，生成一個新的NotⅠ位點。
pCWX24的裝配。為了裝配pCWX24，將pCWX221的NotⅠ/KpnⅠLexOp-LacZ片段插入到pCWX21的NotⅠ/KpnⅠ位點，制成pCWX22。接著，在pCWX22的SphⅠ位點插入自退火的5’-CTAGGGCCCTAGCATG-3’片段，生成ApaⅠ位點和載體pCWX23。pCWX23用ApaⅠ/PmeⅠ消化后，插入pCWXO1的SmaⅠ/ApaⅠ消化的LYS2片段，制成pCWX24。
TetOp-URA3的構(gòu)建。從中間質(zhì)粒pCWX211、pCWX213T2、pCWX213T10、pCWX02T2和pCWX02T10生成TetOp-URA3構(gòu)建物。
pCWX211的構(gòu)建。從pSH200用5’-AAAAGGAAAAGCGGCCGCTTAGTTTTGCTGGCCGCATCTTC-3’(SEQ ID NO2)和5’-CGGAATTCTTTCGAAAGCTACATATAAGGAAC-3’(SEQ ID NO3)擴增URA3基因后，將具有NotⅠ/EcoRⅠ末端的PCR產(chǎn)物連接到EcoRⅠ/NotⅠ消化的pBS上，生成pCWX211。
pCWX213T2和pCWX213T10的構(gòu)建。為了構(gòu)建這些載體，將來自pLR1△1的、含有帶有單一XhoⅠ位點的酵母Gal1/Gal10啟動子區(qū)的BamHⅠ片段(West等，分子與細胞生物學(xué)42467-78(1984))插入到pBS的BamHⅠ位點，制成pCWX210。然后將兩個鏈合成并自退火，制成具有XhoⅠ/SalⅠ末端的DNA片段，該片段含有兩個TetO2操縱基因(Meier等，歐洲分子生物學(xué)組織雜志7567-72(1988))，如下所述(SEQ ID NO4和5) Tet操縱基因DNA與其自身連接后，將其用XhoⅠ/SalⅠ消化并在0.8％瓊脂糖膠上分級分離。將大小在100bp到200bp范圍內(nèi)的DNA插入pCWX210的XhoⅠ位點。使用該方案得到了兩種質(zhì)粒pCWX210T2和pCWX210T10，它們分別含有4和6個TetO2操縱基因。將pCWX210T2和T10的具有EcoRⅠ末端的Gal1/Gal10啟動子區(qū)插入到pCWX211的EcoRⅠ位點，分別生成pCWX211T2和pCWX211T10。另外，在這些質(zhì)粒中通過在NotⅠ位點插入自退火的寡(5’-GGCCGCGGTACCGC-3’)(SEQ IDNO6)而生成KpnⅠ位點，從而分別制成pCWX212T2和pCWX212T10。在這些載體中，TetOp-URA3報道基因位于KpnⅠ片段上。刪除這些質(zhì)粒中的ClaⅠ位點，生成質(zhì)粒pCWX213T2和pCWX213T10。用來自pCWX213T2和pCWXT10的具有KpnⅠ末端的TetOp-URA3構(gòu)建物代替來自pCWX01的LYS2的KpnⅠ片段，制成pCWX02T2和pCWX02T10。
TetOp-URA3報道基因在LYS2上的整合。pCWX02T2和pCWX02T10用CalⅠ/XbaⅠ消化后，將這些載體轉(zhuǎn)化到含有pCWX200Cdi2的釀酒酵母菌株EGY40中(Gietz等，酵母11355-60(1995))，pCWX200Cdi2是一種指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活物TetR-Cdi2基因表達的載體(Finley和Brent，國家科學(xué)院院報9112980-84(1984))。轉(zhuǎn)化體在沒有尿嘧啶和亮氨酸的培養(yǎng)基上選擇。挑選每個pCWX02T2和pCWX02T10轉(zhuǎn)化的10個獨立的克隆，并將它們劃線到α-氨基己二酸平板上，以選擇其中LYS2被滅活的那些(Chattoo等，遺傳學(xué)9351-65(1979))。TetOp-URA3基因在LYS2位點的整合利用PCR證實，其中使用雜交到LYS2的KpnⅠ片段的旁側(cè)區(qū)的引物。所得菌株CWXY1和CWXY2(MATaura3 his3 trp1 leu2 lys2△KpnTetOp-URA3)分別含有URA3基因上游的4和6個TetO2操縱基因。與和判別關(guān)系的測定為了測定相互作用關(guān)系，構(gòu)建一系列載體。將c-Raf1(1-313)克隆到載體pCWX200和JG4-5的EcoR1/Xho1位點中。RasA15A186、hSos1(601-1019)和Cdc25(907-1589)用RasA15A186引物5’-GCCTGAATTCATGACGGAATATAAGCTGG-3’(SEQ ID NO7)和5’-CCCGAACTCGAGTCAGGAGAGCACTGCCTTGCAGC-3’(SEQ ID NO8)、hSos1(601-1019)引物5’-GCCTGAATTCAAAGCAGGAACTGTT-3’(SEQ IDNO9)和5’-CCCGAACTCGAGCTATCGTGGTTCTATTTCTAG-3’(SEQ ID NO10)、和Cdc25催化域(907-1589)引物5’-GCCTGAATTCATGTCTTCGGTCTCCTCAG-3’(SEQ ID NO11)和5’-CCCGAACTCGAGTTATCGAAATAACCTAGAAGG-3’(SEQ ID NO12)擴增后，將RasA15A186、hSos1(601-1019)和Cdc25(907-1589)的具有EcoRⅠ/XhoⅠ末端的PCR產(chǎn)物也克隆到載體pEG202和pJG4-5的EcoR1/Xho1位點中。含有pCWX24的CWXY2用上述圖2中所示的兩個餌和犧牲者的組合物轉(zhuǎn)化后，將轉(zhuǎn)化體劃線到?jīng)]有亮氨酸、組氨酸、賴氨酸和色氨酸的離去(dropout)平板(“LHKW”)上，含有葡萄糖作為碳源(“Glu”)，并添加100μg/ml 6-氮尿嘧啶，它是URA3的抑制劑(Le Douarin等，核酸研究23876-8(1995))。這些平板在30℃下培養(yǎng)12-48小時。然后將酵母菌落影印到四個離去平板上如上所示的LHKW/Glu+X Gal、LHKW/半乳糖(Gal)+棉子糖(Raff)+Xgal、LHKWU/Glu和LHKWU/Gal+Raff，所得產(chǎn)物在30℃下培養(yǎng)12-72小時后評分。有關(guān)蛋白質(zhì)輸入的與運算的測定為了進行其他測定，將用引物5’-GCCTGAATTCATGAAGGGGTGGTATCACGGA-3’(SEQ ID NO13)和5’-CCCGAACTCGAGCTA-CTTGACCATCATTGGTTTTTG-3’(SEQ ID NO14)擴增的人GAP1的具有EcoRⅠ/XhoⅠ末端的PCR產(chǎn)物克隆到pCWX200中。具有EcoRⅠ/XhoⅠ末端的Cdc25(907-1589)(如圖2中所示)也克隆到pCWX200中。然后將含有pEG202RasA186和pJGRaf(1-313)的CWXY2進一步用pCWX200、pCWX200CDC25(907-1589)或pCWX200GAP轉(zhuǎn)化。將從＞50個獨立的轉(zhuǎn)化體合并的轉(zhuǎn)化體的菌落影印到LHKW/Glu+X gal和LHKW/Gal+Raff+Xgal離去平板上，并將這些平板在30℃下培養(yǎng)2-3天。前一個板上的細胞沒有顯示藍色，而在后一個板上顯示了不同強度的藍色。β-半乳糖苷酶活性以三等份細胞集合體利用液體測定來測量(Estojak等，分子與細胞生物學(xué)155820-9(1995))，每個集合體含有50個以上的獨立轉(zhuǎn)化體。LHKW/Gal+Raff培養(yǎng)基在0.2OD600下接種生長到晚對數(shù)期或在LHKW/Glu液體培養(yǎng)基中飽和的洗滌細胞，培養(yǎng)物在30℃下再培養(yǎng)5小時，如Estojak等所述進行β-半乳糖苷酶測定(分子與細胞生物學(xué)155820-29(1995))。
表1
表2
表3 10000Y打斷X/Z二聚體 X，Z形成二聚體10001X修飾Z，修飾Z結(jié)合Y X，Z形成二聚體10010X，Z形成二聚體，Z將X和Y區(qū)別開 X，Z形成二聚體10011X，Z形成二聚體，Y結(jié)合X/Z二聚體形成 X，Z形成二聚體X/Y/Z三聚體01100X，Y和Y，Z形成二聚體，X/Y二聚體阻止Y Y，Z和Y，X形成二聚體結(jié)合Z01101X，Y和Y，Z形成二聚體，Y/Z二聚體阻止X Y，Z和Y，X形成二聚體結(jié)合Y01110Y修飾X，修飾X結(jié)合Z Y，Z和Y，X形成二聚體01111X/Y和Y/Z二聚體通過Y相互作用形成Y，Z和Y，X形成二聚體X/Y/Z三聚體10100X，Y和X，Z形成二聚體，X/Y二聚體阻止X X，Z和X，Y形成二聚體結(jié)合Z10101X修飾Y，修飾Y結(jié)合Z X，Z和X，Y形成二聚體10110X，Y和X，Z形成二聚體，X/Z二聚體阻止X X，Z和X，Y形成二聚體結(jié)合Y10111X/Z和X/Y二聚體通過X相互作用形成X，Z和X，Y形成二聚體X/Y/Z三聚體11 0 0 0 X，Z和Y，Z形成二聚體，兩個二聚體相互滅 X，Z和Y，Z形成二聚體活11 0 0 1 X，Z和Y，Z形成二聚體，Y/Z二聚體阻止X X，Z和Y，Z形成二聚體結(jié)合Z11 0 1 0 X，Z和Y，Z形成二聚體，X/Z二聚體阻止Y X，Z和Y，Z形成二聚體結(jié)合Z11 0 1 1 X，Z和Y，Z形成二聚體 X，Z和Y，Z形成二聚體11 1 0 0 X，Y形成二聚體，X/Y二聚體滅活Z X，Y和X，Z和Y，Z形成二聚體，可形成X/Y/Z三聚體11 1 0 1 X，Y和X，Z和Y，Z形成二聚體，Y修飾X， X，Y和X，Z和Y，Z形成修飾X與Z弱結(jié)合 二聚體，可形成X/Y/Z三聚體111 1 0 X，Y和X，Z和Y，Z形成二聚體，X修飾Y， X，Y和X，Z和Y，Z形成修飾Y與Z弱結(jié)合 二聚體，可形成X/Y/Z三聚體111 1 1 X，Y和X，Z和Y，Z形成二聚體，可形成X/Y/Z X，Y和X，Z和Y，Z形成三聚體 二聚體，可形成X/Y/Z三聚體其他實施方案在上述方法的一個替代方法中，本文中描述的涉及兩個報道基因的系統(tǒng)可用于選擇或篩選與兩個不同的蛋白質(zhì)結(jié)合位點結(jié)合的蛋白質(zhì)。為了進行這些篩選，將兩個不同的DNA片段插入兩個報道基因(例如，URA3和lacZ基因)的上游，在還含有表達候選結(jié)合蛋白質(zhì)的基因的細胞中測定每個基因的表達。該候選結(jié)合蛋白質(zhì)可以以其天然狀態(tài)表達，或者作為與活化域連接的融合蛋白表達。
本文中所述的任何一種方法都可以用于篩選蛋白質(zhì)，肽或aptamers，但不限于此。
其他實施方案包含在權(quán)利要求書中。
序列表<110>The General Hospital Corporation<120>記錄蛋白質(zhì)相互作用及功能關(guān)系的檢測系統(tǒng)<130>00786/317WO2<150>60/065，273<151>1997-11-10<160>16<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>14<212>DNA<213>釀酒酵母<400>1gatccgcggc cgcg 14<210>2<211>41<212>DNA<213>釀酒酵母<400>2aaaaggaaaa gcggccgctt agttttgctg gccgcatctt c 41<210>3<211>32<212>DNA<213>釀酒酵母<400>3cggaattctt tcgaaagcta catataagga ac 32<210>4<211>56<212>DNA<213>大腸桿菌<400>4tcgagcactc cctatcagtg atagagaaaa cactccctat cagtgataga gaaaag56<210>5<211>56<212>DNA<213>大腸桿菌
<400>5cgtgagggat agtcactatc tcttttgtga gggatagtca ctatctcttt tcagct56<210>6<211>14<212>DNA<213>釀酒酵母<400>6ggccgcggta ccgc 14<210>7<211>29<212>DNA<213>人類<400>7gcctgaattc atgacggaat ataagctgg 29<210>8<211>35<212>DNA<213>人類<400>8cccgaactcg agtcaggaga gcactgcctt gcagc 35<210>9<211>25<212>DNA<213>人類<400>9gcctgaattc aaagcaggaa ctgtt 25<210>10<211>33<212>DNA<213>人類<400>10cccgaactcg agctatcgtg gttctatttc tag 33<210>11<211>29<212>DNA<213>釀酒酵母<400>11gcctgaattc atgtcttcgg tctcctcag′29<210>12<211>33<212>DNA<213>釀酒酵母
<400>212cccgaactcg agttatcgaa ataacctaga agg 33<210>13<211>31<212>DNA<213>人類<400>13gcctgaattc atgaaggggt ggtatcacgg a31<210>14<211>35<212>DNA<213>人類<400>14cccgaactcg agctacttga catcattggt ttttg35<210>15<211>20<212>PRT<213>人類<400>15Asp Met Asp Trp Phe Phe Arg Phe Tyr Ala Ser Val Ser Arg Leu Phe1 5 10 15Arg His Leu His20<210>16<211>20<212>PRT<213>人類<400>16Phe Trp Gln Ala Thr Leu Arg Leu Val Ser Asp Lys Leu Ile Leu Leu1 5 10 15Tyr Pro Asp Pro20
權(quán)利要求
1.一種檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法，該方法包含(a)提供一個宿主細胞，它含有(ⅰ)一個第一報道基因，其可通過操作與包括第一蛋白質(zhì)結(jié)合位點的DNA序列相連；(ⅱ)一個第二報道基因，其可通過操作與包括第二蛋白質(zhì)結(jié)合位點的DNA序列相連；(ⅲ)一個表達第一融合蛋白的第一融合基因，所述第一融合蛋白包括一個與結(jié)合部分共價結(jié)合的第一蛋白質(zhì)，該結(jié)合部分能特異性結(jié)合到所述第一蛋白質(zhì)結(jié)合位點上；(ⅳ)一個表達第二融合蛋白的第二融合基因，所述第二融合蛋白包括一個與結(jié)合部分共價結(jié)合的第二蛋白質(zhì)，該結(jié)合部分能特異性結(jié)合到所述第二蛋白質(zhì)結(jié)合位點上；和(ⅴ)一個表達第三融合蛋白的第三融合基因，所述第三融合蛋白包括一個與基因活化部分共價結(jié)合的第三蛋白質(zhì)；(b)測量所述第一報道基因的表達輸出，作為所述第一蛋白質(zhì)和第三蛋白質(zhì)之間相互作用的量度；(c)測量所述第二報道基因的表達輸出，作為所述第二蛋白質(zhì)和第三蛋白質(zhì)之間相互作用的量度；和(d)解釋步驟(b)和步驟(c)的表達輸出結(jié)果，由此(ⅰ)所述第一報道基因和第二報道基因二者輸出的增加指示所述第三融合蛋白與所述第一和第二融合蛋白相互作用；(ⅱ)所述第一報道基因輸出增加而第二報道基因輸出不增加，指示所述第三融合蛋白與第一融合蛋白相互作用，而不與第二融合蛋白作用；(ⅲ)所述第二報道基因輸出增加而第一報道基因輸出不增加，指示所述第三融合蛋白與第二融合蛋白相互作用，而不與第一融合蛋白作用；和(ⅳ)所述第一或第二報道基因的輸出均沒有變化，指示所述第三融合蛋白不與所述第一或第二融合基因相互作用。
2.權(quán)利要求1所述的方法，該方法進一步包含將所述步驟(b)和步驟(c)的表達輸出結(jié)果與用下述宿主細胞測得的表達輸出結(jié)果進行比較，所述宿主細胞是(a)一個第一比較宿主細胞，它含有(ⅰ)一個可通過操作與包括蛋白質(zhì)結(jié)合位點的DNA序列相連的報道基因；(ⅱ)一個表達第一融合蛋白的第一融合基因，所述第一融合蛋白包括與能特異性結(jié)合到所述蛋白質(zhì)結(jié)合位點上的結(jié)合部分共價結(jié)合的所述第一蛋白質(zhì)；和(ⅲ)一個表達第二融合蛋白的第二融合基因，所述第二融合蛋白包括與基因活化部分共價結(jié)合的所述第三蛋白質(zhì)；或者(b)一個第二比較宿主細胞，它含有(ⅰ)可通過操作與包括蛋白質(zhì)結(jié)合位點的DNA序列相連的報道基因；(ⅱ)一個表達第一融合蛋白的第一融合基因，所述第一融合蛋白包括與能特異性結(jié)合到所述蛋白質(zhì)結(jié)合位點上的結(jié)合部分共價結(jié)合的所述第二蛋白質(zhì)；和(ⅲ)一個表達第二融合蛋白的第二融合基因，所述第二融合蛋白包括與基因活化部分共價結(jié)合的所述第三蛋白質(zhì)；或者(c)所述第一比較宿主細胞和所述第二比較宿主細胞兩者。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中至少所述第一或所述第二報道基因之一的表達水平可以降低。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一或所述第二蛋白質(zhì)結(jié)合位點之一是四環(huán)素操縱基因。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一或所述第二報道基因之一是URA3或lacZ。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一或所述第二報道基因之一產(chǎn)生一個可被第二細胞接收和檢測的信號。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述宿主細胞是酵母細胞或哺乳動物細胞。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述宿主細胞是酵母細胞。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一和所述第二報道基因可以同時表達。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一蛋白質(zhì)和所述第二蛋白質(zhì)是等位變體。
11.一種檢測蛋白質(zhì)的方法，該蛋白質(zhì)介導(dǎo)另一種蛋白質(zhì)的狀態(tài)變化，所述方法包含(a)提供一個宿主細胞，它含有(ⅰ)一個可通過操作與包括蛋白質(zhì)結(jié)合位點的DNA序列相連的報道基因；(ⅱ)一個表達第一融合蛋白的第一融合基因，所述第一融合蛋白包括一個與結(jié)合部分共價結(jié)合的第一蛋白質(zhì)，該結(jié)合部分能特異性結(jié)合到所述蛋白質(zhì)結(jié)合位點上；和(ⅲ)一個表達第二融合蛋白的第二融合基因，所述第二融合蛋白包括一個能與所述第一蛋白質(zhì)相互作用并且與基因活化部分共價結(jié)合的第二蛋白質(zhì)，其中至少所述第一或所述第二蛋白質(zhì)之一可以顯示狀態(tài)變化；(b)使所述第一和所述第二蛋白質(zhì)相互作用；(c)測量所述報道基因的表達，作為所述第一蛋白質(zhì)和所述第二蛋白質(zhì)之間相互作用的量度；(d)向所述細胞中引進一個表達第三蛋白質(zhì)的第三基因；(e)測量所述報道基因的表達，在所述第三蛋白質(zhì)存在下所述報道基因表達的變化，指示所述第三蛋白質(zhì)介導(dǎo)所述第一或第二蛋白質(zhì)的狀態(tài)變化，從而導(dǎo)致所述第一蛋白質(zhì)和所述第二蛋白質(zhì)相互作用的能力改變。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述狀態(tài)的變化是構(gòu)象變化。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述顯示構(gòu)象變化的蛋白質(zhì)是Ras蛋白質(zhì)。
14.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述宿主細胞是酵母細胞或哺乳動物細胞。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述宿主細胞是酵母細胞。
16.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述第一融合蛋白和所述第三蛋白質(zhì)為響應(yīng)細胞外刺激而各自發(fā)生表達。
17.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述報道基因產(chǎn)生可被第二細胞接收和檢測的信號。
18.一種檢測蛋白質(zhì)的方法，該蛋白質(zhì)介導(dǎo)另一種蛋白質(zhì)的狀態(tài)變化，所述方法包含(a)提供一個第一宿主細胞，它含有(ⅰ)一個可通過操作與包括蛋白質(zhì)結(jié)合位點的DNA序列相連的報道基因；(ⅱ)一個表達第一融合蛋白的第一融合基因，所述第一融合蛋白包括一個與結(jié)合部分共價結(jié)合的第一蛋白質(zhì)，該結(jié)合部分能特異性結(jié)合到所述第一蛋白質(zhì)結(jié)合位點上；和(ⅲ)一個表達第二融合蛋白的第二融合基因，所述第二融合蛋白包括一個能與所述第一蛋白質(zhì)相互作用并且與基因活化部分共價結(jié)合的第二蛋白質(zhì)，其中至少所述第一或第二蛋白質(zhì)之一可以顯示狀態(tài)變化；(b)使所述第一和所述第二蛋白質(zhì)相互作用；(c)測量所述第一宿主細胞中所述報道基因的表達，作為所述第一蛋白質(zhì)和所述第二蛋白質(zhì)之間相互作用的量度；(d)提供一個第二宿主細胞，它含有(ⅰ)可通過操作與包括所述蛋白質(zhì)結(jié)合位點的所述DNA序列相連的所述報道基因；(ⅱ)表達所述第一融合蛋白的所述第一融合基因；和(ⅲ)表達所述第二融合蛋白的所述第二融合基因；(ⅳ)表達第三蛋白質(zhì)的第三基因；(e)使所述第一和所述第二蛋白質(zhì)在所述第三蛋白質(zhì)的存在下相互作用；(f)測量所述第二宿主細胞中所述報道基因的表達，作為在所述第三蛋白質(zhì)存在下所述第一蛋白質(zhì)和所述第二蛋白質(zhì)之間相互作用的量度，與在所述第一宿主細胞中測得的報道基因表達相比，在所述第二宿主細胞中報道基因表達的變化指示，所述第三蛋白質(zhì)介導(dǎo)所述第一或第二蛋白質(zhì)的狀態(tài)變化，從而導(dǎo)致所述第一蛋白質(zhì)和所述第二蛋白質(zhì)相互作用的能力改變。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述狀態(tài)的變化是構(gòu)象變化。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述顯示構(gòu)象變化的蛋白質(zhì)是Ras蛋白質(zhì)。
21.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述宿主細胞各自是酵母細胞或哺乳動物細胞。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述宿主細胞各自是酵母細胞。
23.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述第一融合蛋白和所述第三蛋白質(zhì)為響應(yīng)細胞外刺激而各自發(fā)生表達。
24.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述報道基因產(chǎn)生可被第二細胞接收和檢測的信號。
25.一種細胞，它包括(ⅰ)一個可通過操作與包括第一蛋白質(zhì)結(jié)合位點的DNA序列相連的第一報道基因；(ⅱ)一個可通過操作與包括第二蛋白質(zhì)結(jié)合位點的DNA序列相連的第二報道基因；(ⅲ)一個表達第一融合蛋白的第一融合基因，所述第一融合蛋白包括一個與結(jié)合部分共價結(jié)合的第一蛋白質(zhì)，該結(jié)合部分能特異性結(jié)合到所述第一蛋白質(zhì)結(jié)合位點上；(ⅳ)一個表達第二融合蛋白的第二融合基因，所述第二融合蛋白包括一個與結(jié)合部分共價結(jié)合的第二蛋白質(zhì)，該結(jié)合部分能特異性結(jié)合到所述第二蛋白質(zhì)結(jié)合位點上；和(ⅴ)一個表達第三融合蛋白的第三融合基因，所述第三融合蛋白包括一個與基因活化部分共價結(jié)合的第三蛋白質(zhì)。
26.權(quán)利要求25所述的細胞，其中至少所述第一或第二報道基因之一的表達水平可以降低。
27.權(quán)利要求25所述的細胞，其中所述第一或第二蛋白質(zhì)結(jié)合位點之一是四環(huán)素操縱基因。
28.權(quán)利要求25所述的細胞，其中所述第一或第二報道基因之一是URA3或lacZ。
29.權(quán)利要求25所述的細胞，其中所述第一或第二報道基因之一產(chǎn)生一個可被第二細胞接收和檢測的信號。
30.權(quán)利要求25所述的細胞，其中所述宿主細胞是酵母細胞或哺乳動物細胞。
31.權(quán)利要求25所述的細胞，其中所述宿主細胞是酵母細胞。
32.一種報道基因，它包括一個可通過操作與編碼可檢測產(chǎn)物的基因相連的四環(huán)素操縱基因。
33.權(quán)利要求32所述的報道基因，其中所述編碼可檢測產(chǎn)物的基因是URA3基因或lacZ基因。
34.一種檢測候選蛋白質(zhì)是否與轉(zhuǎn)錄激活物相互作用的方法，該方法包含(a)提供一個宿主細胞，它含有(ⅰ)一個表達水平可以降低的報道基因，所述報道基因通過操作與包括蛋白質(zhì)結(jié)合位點的DNA序列相連；(ⅲ)一個表達第一融合蛋白的第一融合基因，所述第一融合蛋白包括與結(jié)合部分共價結(jié)合的所述轉(zhuǎn)錄激活物，該結(jié)合部分能特異性結(jié)合到所述蛋白質(zhì)結(jié)合位點上；和(ⅴ)一個表達第二融合蛋白的第二融合基因，所述第二融合蛋白包括與基因活化部分共價結(jié)合的所述候選蛋白質(zhì)；(b)檢測所述報道基因表達的增加，作為所述候選蛋白質(zhì)與所述轉(zhuǎn)錄激活物之間相互作用的指示。
35.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述報道基因是URA3基因。
36.權(quán)利要求35所述的方法，其中所述表達水平是由6-氮尿嘧啶降低的。
37.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)結(jié)合位點是四環(huán)素操縱基因。
38.權(quán)利要求37所述的方法，其中所述表達水平是由四環(huán)素或四環(huán)素衍生物降低的。
39.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述宿主細胞是酵母細胞或哺乳動物細胞。
40.權(quán)利要求39所述的方法，其中所述宿主細胞是酵母細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了復(fù)雜蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)功能關(guān)系的檢測方法,以及實施這些方法所用的試劑。
文檔編號C12P21/04GK1285846SQ98813011
公開日2001年2月28日 申請日期1998年11月6日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月10日
發(fā)明者R·布倫特, C·W·徐, A·R·門德爾松, W·L·洛克 申請人:綜合醫(yī)院公司