一種利用海洋細(xì)菌交替假單胞菌mb004產(chǎn)的膠原蛋白酶基因的克隆表達(dá)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種利用海洋細(xì)菌交替假單胞菌MB004產(chǎn)的膠原蛋白酶基因的克隆表達(dá)方法，以交替假單胞菌MB004基因組DNA為模板，用PCR方法克隆MB004的編碼基因，將該基因重組到表達(dá)質(zhì)粒中，獲得重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒線(xiàn)性化，以原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法整合到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，獲得整合了質(zhì)粒的重組表達(dá)菌株，接種培養(yǎng)基中培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，表達(dá)的蛋白經(jīng)離心后收集，濃縮，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、親和層析純化獲得重組蛋白純化產(chǎn)物。本發(fā)明從海洋細(xì)菌中篩選出能產(chǎn)生膠原蛋白酶的細(xì)菌MB004，從而獲得其膠原蛋白酶基因，膠原蛋白酶PNJC的酶活力為160.34U/mg，達(dá)到膠原蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品的70.48%。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種利用海洋細(xì)菌交替假單胞菌MB004產(chǎn)的膠原蛋白酶基因的克隆表達(dá)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種利用海洋細(xì)菌交替假單胞菌MB004產(chǎn)的膠原蛋白酶基因的克隆表達(dá)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]膠原是一種廣泛存在于動(dòng)物的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，是由動(dòng)物細(xì)胞合成的一種生物性高分子。廣泛存在于動(dòng)物骨、腳、軟骨和皮膚及其它結(jié)締組織中，約占哺乳動(dòng)物總蛋白的1/3。多數(shù)類(lèi)型的膠原蛋白分子都由3條螺旋肽鏈相互盤(pán)繞而成，3鏈相互纏繞，形成了膠原蛋白分子特有的桿狀結(jié)構(gòu)。膠原蛋白是一類(lèi)重要的資源，目前，己廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、日用化學(xué)品工業(yè)等方面都有重要的作用。
[0003]在飼料工業(yè)中:膠原蛋白作為一種高效的動(dòng)物性蛋白營(yíng)養(yǎng)添加劑。
[0004]在生物醫(yī)學(xué)材料方面的應(yīng)用:制作心臟瓣膜；血管修復(fù)的替換血管裝置；作為燒傷傷口的敷料(使血液凝固，具有止血功能)；制造人造皮膚。
[0005]在食品方面:膠原蛋白材料制備薄膜材料；制造腸衣等可食用包裝材料；作為肉制品添加劑、保健食品等。
[0006]另外，膠原 蛋白具有優(yōu)良的吸濕、保濕性能以及抗皮膚衰老功效，一些知名品牌公司已推出了純膠原蛋白和一系列添加了純膠原蛋白的護(hù)膚品。
[0007]膠原蛋白得到了廣泛的應(yīng)用，大量的需求突出了提取膠原蛋白迫切性，用膠原蛋白酶進(jìn)行生產(chǎn)就是其中重要的一種方法。
[0008]膠原蛋白酶是指作用于膠原或其變性明膠而不作用其它蛋白質(zhì)的酶類(lèi)，它來(lái)源廣泛，多種微生物以及動(dòng)物的許多組織細(xì)胞都可以產(chǎn)生膠原酶。膠原酶在環(huán)境保護(hù)上可用于皮革邊角廢棄物變廢為寶，高值轉(zhuǎn)化；在醫(yī)學(xué)研究中可用于治療腰椎間盤(pán)突出癥、瘢痕疙瘩、杜普伊特倫癥等，具有極大的應(yīng)用價(jià)值。來(lái)自溶組織梭菌(Clostridiumhistolyticum)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)等的膠原蛋白酶已有廣泛的研究。目前，已從許多動(dòng)物組織和微生物中獲得膠原蛋白酶。但對(duì)于來(lái)自于海洋微生物中的膠原蛋白酶的研究甚少，而海洋由于其多變復(fù)雜的環(huán)境，多樣的生命形式，使得海洋中蘊(yùn)藏著種類(lèi)多樣，功能各異且具有強(qiáng)烈活性的生物蛋白酶。本研究試從實(shí)驗(yàn)室保存的海洋微生物中篩選膠原蛋白酶產(chǎn)生菌，并將其膠原蛋白酶基因?qū)牍こ叹羞M(jìn)行異源表達(dá)，對(duì)海洋來(lái)源膠原蛋白酶進(jìn)行一個(gè)初探式研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)上述的技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種利用海洋細(xì)菌交替假單胞菌MB004產(chǎn)的膠原蛋白酶基因的克隆表達(dá)方法。
[0010]一種利用海洋細(xì)菌交替假單胞菌MB004產(chǎn)的膠原蛋白酶基因的克隆表達(dá)方法，是以交替假單胞菌MB004基因組DNA為模板，該交替假單胞菌MB004的核苷酸序列如〈400>1所述，用PCR方法克隆MB004的編碼基因，將該基因重組到表達(dá)質(zhì)粒pET28a中，獲得重組質(zhì)粒pET28a_Pnjc,將重組質(zhì)粒線(xiàn)性化，以原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法整合到大腸桿菌Rosseta感受態(tài)細(xì)胞中，獲得整合了質(zhì)粒的重組表達(dá)菌株Rosseta (DE3)/pET28a-Pnjc，接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，重組蛋白以可溶性的形式分泌到培養(yǎng)液中，表達(dá)的蛋白經(jīng)離心后收集，濃縮，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、親和層析純化獲得重組蛋白純化產(chǎn)物。
[0011]進(jìn)一步地，所述PCR方法中所用引物為: [0012]引物Pl:5，-CGGGATCCATGTTTGTACCAGAACTTCT-3> ；
[0013]引物P2:5 ’ -CCCAAGCTTTTATGCCTTTTTAAAAGGAT-3 ’ ；
[0014]并在引物PI和引物p2的5 ’端分別弓丨入酶切位點(diǎn)Bgl II和Xho I位點(diǎn)。
[0015]進(jìn)一步地，所述PCR方法中的PCR反應(yīng)條件為:95°C 5min ；95°C 30s, 51 °C 30s，72°C 90s，共 35 個(gè)循環(huán);72°C延伸 IOmin。
[0016]進(jìn)一步地，所述交替假單胞菌MB004基因組DNA的克隆采用16S rRNA通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段經(jīng)回收純化后與pMD18_T Vector連接，然后轉(zhuǎn)化到DH5a細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行目的片段的測(cè)序。
[0017]進(jìn)一步地，所述引物27F 為:5’ -AGAGTTTGATCCTGGC-3’。
[0018]進(jìn)一步地，所述引物1492R:5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
[0019]本發(fā)明所涉及的海洋細(xì)菌交替假單胞菌MB004經(jīng)16S rRNA系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析屬于Pseudoalteromonas,該菌株己在 GenBank 公開(kāi)(GenBank 登錄號(hào):AY621063, http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/AY621063)。
[0020]其中，海洋細(xì)菌交替假單胞菌MB004的分離培養(yǎng)方法與形態(tài)特征:
[0021]1.1海洋細(xì)菌的分離培養(yǎng)方法
[0022]取數(shù)管實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，冰浴溶解，用接種環(huán)蘸取少量菌液在2216E活化培養(yǎng)基平板上劃線(xiàn)活化，在培養(yǎng)皿上做好信息標(biāo)記，培養(yǎng)皿在25°C下倒置培養(yǎng)2-3天至長(zhǎng)出單菌落。從活化培養(yǎng)基上挑取單菌落接種于2216E初篩固體培養(yǎng)基中心處，培養(yǎng)皿在25°C下倒置培養(yǎng)2天，在菌落周?chē)渭?-3滴酸性汞試劑，顯色2分鐘。測(cè)定光圈直徑(D2)與菌落直徑(D1)，并做好記錄，選取D2/D1比值較大的菌種，接種于2216E液體培養(yǎng)基，25°C，180rpm條件下振蕩培養(yǎng)1-2天，菌液分裝于菌液保藏管，加20%甘油保存。經(jīng)初篩獲得的菌株接種于含2216E液體培養(yǎng)基的試管中，25°C，180rpm條件下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取ImL菌液，在10，OOOrpm、室溫條件下離心lmin，取上清。以I型膠原為底物測(cè)定膠原蛋白酶活性。通過(guò)產(chǎn)酶培養(yǎng)基復(fù)篩獲得菌株。
[0023]1.2海洋細(xì)菌的形態(tài)特征:
[0024]將實(shí)驗(yàn)室保存的300株海洋細(xì)菌接種于初篩平板上，37°C培養(yǎng)24h。共分離到69株產(chǎn)明膠酶菌株。挑選水解圈直徑與菌落直徑比值最大的菌MB004(圖1)來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)，觀(guān)察該菌，菌落顯圓形，邊緣不整齊，表面干燥有褶皺，無(wú)粘性，不透明，灰白色，滴加酸性汞試劑能產(chǎn)生透明水解圈，菌落直徑平均約0.75cm，透明水解圈直徑平均約3.0Ocm,比值為4.0，可以確定海洋細(xì)菌MB004產(chǎn)生了膠原蛋白酶。
[0025]由于膠原蛋白酶能分解明膠，從而使菌落周?chē)a(chǎn)生一個(gè)被分解了的圓圈，酸性汞試劑能與明膠反應(yīng)產(chǎn)生白色物質(zhì)，而不會(huì)與明膠分解后的產(chǎn)物產(chǎn)生白色物質(zhì)，故在能分解明膠的菌落周?chē)渭铀嵝怨噭┖髸?huì)產(chǎn)生一個(gè)透明水解圈，水解圈與菌落的直徑比越大，可基本說(shuō)明該菌產(chǎn)生的酶活力或酶數(shù)量越大，以此初步判斷出目的菌。
[0026]1.3海洋細(xì)菌產(chǎn)膠原蛋白酶的分子生物學(xué)鑒定
[0027]按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取目的菌株的基因組DNA，隨后采用16SrRNA通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其引物的序列為27F: 5 ’ -AGAGTTTGATCCTGGC-3 ’ ；1492R:5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，并且 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的片斷大小為 1405bp。
[0028]目的片段經(jīng)回收純化與PMD18-T Vector連接，然后轉(zhuǎn)化到DH5 α細(xì)胞，最后提取重組質(zhì)粒進(jìn)行目的片段的測(cè)序，測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。獲得的16SrRNA序列提交GenBank用BLAST軟件(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)與已知序列進(jìn)行對(duì)比，用ClustalXl.8.msw軟件進(jìn)行排列，利用MEGA3.1軟件繪制系統(tǒng)樹(shù)并確定它們的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)地位。根據(jù)ORF的基因功能提示，我們發(fā)現(xiàn)交替假單胞菌MB004基因組中含有一條完整的膠原蛋白酶編碼基因，命名為Pnjc。該基因全長(zhǎng)1359bp，GC含量45.62%，編碼由452個(gè)氨基酸殘基組成的約51kD大小的膠原蛋白酶(圖4)。經(jīng)Blast比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的膠原蛋白酶PNJC與同屬中的蛋白酶相似性均在85%以上，其中可以看出MB004菌與交替假單胞菌piscicida中的蛋白酶相似性最高,達(dá)到99%。
[0029]1.4海洋細(xì)菌菌株的分子生物學(xué)鑒定
[0030]將親緣關(guān)系較近的菌株16S rRNA應(yīng)用MEGA軟件進(jìn)行多重比較，用中鄰接法(Neibor-joining method)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),如圖2所示,從進(jìn)化樹(shù)可以看出MB004菌株屬于交替假單胞桿菌。
[0031]1.5膠原蛋白酶活性檢測(cè)
[0032]以不溶性I型膠`原蛋白為底物，采用茚三酮顯色法，膠原蛋白酶水解底物釋放的水溶性氨基酸和短肽。反應(yīng)體系:0.1mL酶液，0.5mL pH7.50.lmol/L Tris-HCl緩沖液(含50mmol CaC12)，不溶性I型膠原lmg。37°C孵育30min，加入0.6mll0%的三氯乙酸(TCA)終止反應(yīng)。反應(yīng)物10, 000r/min離心IOmin,取上清液0.6mL并加入0.6ml pH5.42mol/L乙酸緩沖液及0.6mL茚三酮顯色溶液，充分混合后，100°C水浴中加熱15min，冰水冷卻5min，經(jīng)60%乙醇稀釋后于570nm處測(cè)定吸光值。以不加目的蛋白作為陰性對(duì)照，膠原蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品作為酶活反應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照，每組反應(yīng)均重復(fù)三次。以甘氨酸為標(biāo)準(zhǔn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
[0033]酶活力定義為:在37°C，PH值7.5條件下，每分鐘水解膠原蛋白產(chǎn)生相當(dāng)于Iug甘氨酸的酶量為I個(gè)酶活力單位(U)。
[0034]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明從海洋細(xì)菌中篩選出能產(chǎn)生膠原蛋白酶的細(xì)菌MB004，從而獲得其膠原蛋白酶基因，并通過(guò)異源表達(dá)與親和層析純化獲得重組蛋白PNJC。膠原蛋白酶PNJC的酶活力為160.34U/mg,達(dá)到膠原蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品的70.48%，具有重要的研究開(kāi)發(fā)價(jià)值。原核表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)條件的優(yōu)化、重組蛋白純化方法的改進(jìn)、氨基酸位點(diǎn)的突變將有助于我們獲得高質(zhì)量的具有生物活性的重組蛋白PNJC，并鑒定了其編碼蛋白的膠原蛋白酶活性，高酶活力表明海洋細(xì)菌來(lái)源的膠原蛋白酶具有重要的研究?jī)r(jià)值，為膠原蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了捷徑，其操作簡(jiǎn)便，成本低廉，為首個(gè)交替假單胞菌屬來(lái)源的膠原蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。膠原蛋白作為一種重要的天然蛋白質(zhì)資源，無(wú)論在生物醫(yī)學(xué)、食品保健還是在化妝品、紡織行業(yè)中的應(yīng)用都十分廣泛，綜合利用的研究進(jìn)展速度很快，其良好的生物相容性、生物可降解性，使它在食品工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用前景和發(fā)展。依靠微生物產(chǎn)生膠原蛋白酶，再制備膠原蛋白是一個(gè)發(fā)展迅速的膠原蛋白獲得方式。本研究為海洋來(lái)源膠原蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
[0035]保藏說(shuō)明
[0036]1、MB004菌株，即假交替單孢菌Pseudoaltermonas sp,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC M2014010。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0037]以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中:
[0038]圖1為本發(fā)明在平板上的透明圈；
[0039]圖2為本發(fā)明菌株16S rRNA進(jìn)化樹(shù)分析圖；
[0040]圖3膠原蛋白酶編碼基因Pnjc的PCR擴(kuò)增；
[0041 ] 圖4重組蛋白PNJC的誘導(dǎo)表達(dá)與SDS-PAGE檢測(cè)； [0042]圖5A31結(jié)構(gòu)域蛋白親和層析純化的SDS-PAGE結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0043]為以下將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0044]實(shí)施例1交替假單胞菌MB004表達(dá)載體的構(gòu)建
[0045]PCR引物:根據(jù)本發(fā)明中已克降到的交替假單胞菌MB004(基因登錄號(hào):KF439859)基因兩端序列設(shè)計(jì)引物，同時(shí)為構(gòu)建載體方便，在引物的5’端分別引入限制性?xún)?nèi)切酶Bgl II 和 Xho I 位點(diǎn)，引物 Pl:5’ -CGGGATCCATGTTTGTACCAGAACTTCT-3> ;引物 P2:5’ -CCCAAGCTTTTATGCCTTTTTAAAAGGAT-3，;引物由Invitrogen公司生產(chǎn)合成。交替假單胞菌MB004細(xì)菌基因組DNA的提取是按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取目的菌株的基因組DNA獲得，隨后采用16SrRNA通用引物27F和1492R，用PCR技術(shù)獲得目的序列。測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。其中，PCR反應(yīng)條件為:以MB004基因組為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:95°C 5min ；95°C 30s,51°C 30s, 72°C 90s，共35個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收目的片段；
[0046]PCR產(chǎn)物的克隆和鑒定:利用限制性?xún)?nèi)切酶Bgl II和Xho I分別對(duì)表達(dá)質(zhì)粒pET28a和膠原蛋白酶基因進(jìn)行雙酶切，回收的酶切片段經(jīng)DNA T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosseta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)菌落PCR檢測(cè)篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，獲得重組質(zhì)粒pET28a-Pnjc。核苷酸序列的測(cè)序由Invitrogen公司完成。
[0047]利用帶有酶切位點(diǎn)的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段大小與交替假單胞菌NJ631中膠原蛋白酶編碼基因Pnjc的序列大小相符(如圖3所示)。圖3中M為DNAmaker分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，I為PCR產(chǎn)物陰性對(duì)照，2，3為Pnjc DNA片段擴(kuò)增。將Pnjc與表達(dá)載體pET28a分別經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切后，回收酶切片段。經(jīng)轉(zhuǎn)化、菌落PCR檢測(cè)，篩選獲得重組轉(zhuǎn)化子。測(cè)序結(jié)果顯示pET28a在酶切位點(diǎn)Bgl II和Xho I之間成功插入Pnjc基因片段且無(wú)突變點(diǎn)。
[0048]實(shí)施例2重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)的表達(dá)和免疫印跡(Western-blotting)
[0049]以pET28a為表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)重組蛋白PNJC在大腸桿菌Rosseta (DE3)中得到高效表達(dá)(圖4)，在51kD附近有明顯蛋白條帶，與膠原蛋白酶PNJC大小相符。PNJC在IPTG誘導(dǎo)濃度為0.2mmol/L時(shí)的表達(dá)量與lmmol/L IPTG誘導(dǎo)下的表達(dá)量相當(dāng)。細(xì)胞裂解液上清液與沉淀的分析結(jié)果表明可溶性重組蛋白PNJC表達(dá)顯著。圖4中M為Markers ;1為未誘導(dǎo)的pET28a_PNJC轉(zhuǎn)化子的細(xì)胞裂解上清液；2為未誘導(dǎo)的pET28a-PNJC轉(zhuǎn)化子的細(xì)胞裂解沉淀；3為0.2mmol/L IPTG誘導(dǎo)的pET28a_PNJC轉(zhuǎn)化子的細(xì)胞裂解上清液；4為0.2mmol/L IPTG誘導(dǎo)的pET28a_PNJC轉(zhuǎn)化子的細(xì)胞裂解沉淀；5為lmmol/L IPTG誘導(dǎo)的pET28a_PNJC轉(zhuǎn)化子的細(xì)胞裂解上清液；6為lmmol/L IPTG誘導(dǎo)的pET28a-PNJC轉(zhuǎn)化子的細(xì)胞裂解沉淀。
[0050]實(shí)施例3重組菌的重組蛋白純化
[0051]將含有重組蛋白PNJC的細(xì)胞裂解上清液上樣N1-NTA瓊脂糖凝膠純化柱，利用PNJC碳端帶有組氨酸標(biāo)簽對(duì)其進(jìn)行親和層析純化，通過(guò)梯度洗脫獲得純化重組蛋白。SDS-PAGE檢測(cè)表明成功獲得純化的膠原蛋白酶PNJC (圖5)。經(jīng)蛋白定量試劑盒檢測(cè)顯示純化得到的膠原蛋白酶PNJC蛋白濃度約為lmg/mL。如圖5所示，M為Markers ；1為未誘導(dǎo)組的細(xì)胞裂解上清液；2為0.2mmol/L誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解上清液；3為流穿液；4為雜蛋白清洗；5為純化的目的蛋白。`
【權(quán)利要求】
1.一種利用海洋細(xì)菌交替假單胞菌MB004產(chǎn)的膠原蛋白酶基因的克隆表達(dá)方法，是以交替假單胞菌MB004基因組DNA為模板，該交替假單胞菌MB004的核苷酸序列如〈400>1所述，用PCR方法克隆MB004的編碼基因，將該基因重組到表達(dá)質(zhì)粒pET28a中，獲得重組質(zhì)粒pET28a_Pnjc,將重組質(zhì)粒線(xiàn)性化，以原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法整合到大腸桿菌Rosseta感受態(tài)細(xì)胞中，獲得整合了質(zhì)粒的重組表達(dá)菌株Rosseta (DE3)/pET28a-Pnjc，接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，重組蛋白以可溶性的形式分泌到培養(yǎng)液中，表達(dá)的蛋白經(jīng)離心后收集，濃縮，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、親和層析純化獲得重組蛋白純化產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用海洋細(xì)菌交替假單胞菌MB004產(chǎn)的膠原蛋白酶基因的克隆表達(dá)方法，其特征在于所述PCR方法中所用引物為:
引物 Pl:5’ -CGGGATCCATGTTTGTACCAGMCTTCT-3，；
引物 Pl:5，-CCCAAGCTTTTATGCCTTTTTAAAAGGAT-3> ； 并在引物Pl和引物p2的5’端分別引入酶切位點(diǎn)Bgl II和Xho I位點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用海洋細(xì)菌交替假單胞菌MB004產(chǎn)的膠原蛋白酶基因的克隆表達(dá)方法，其特征在于所述PCR方法中的PCR反應(yīng)條件為:95°C 5min ；95°C 30s，51°C 30s, 72°C 90s，共 35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用海洋細(xì)菌交替假單胞菌MB004產(chǎn)的膠原蛋白酶基因的克隆表達(dá)方法，其特征在于所述交替假單胞菌MB004基因組DNA的克隆采用16SrRNA通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段經(jīng)回收純化后與pMD18_T Vector連接，然后轉(zhuǎn)化到DH5ci細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行目的片段的測(cè)序。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用海洋細(xì)菌交替假單胞菌MB004產(chǎn)的膠原蛋白酶基因的克隆表達(dá)方法，其特征在于所述引`物27F為:5’ -AGAGTTTGATCCTGGC-3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用海洋細(xì)菌交替假單胞菌MB004產(chǎn)的膠原蛋白酶基因的克隆表達(dá)方法,其特征在于所述引物1492R:5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103773787SQ201410030498
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】周宇芳, 朱鵬, 相興偉, 楊會(huì)成, 肖金星, 徐珊 申請(qǐng)人:浙江省海洋開(kāi)發(fā)研究院, 寧波大學(xué)