專利名稱：：海洋微生物低溫淀粉酶及其產(chǎn)生菌交替假單胞菌gs230的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種從中國(guó)黃海連云港海域的海水中分離得到的交替假單胞菌GS230(尸sewcfoateromo"assp.GS230)CGMCCNO.2156(已于2007年9月26日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCCNO.2156);本發(fā)明還涉及該交替假單胞菌產(chǎn)低溫淀粉酶的方法與產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
：淀粉酶(Amylase)是能催化淀粉水解轉(zhuǎn)化成葡萄糖、麥芽糖及其它低聚糖的一類酶的總稱，它廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中。廣泛應(yīng)用于造紙、食品、醫(yī)藥工業(yè)和洗滌劑工業(yè)中。普通淀粉酶和高溫淀粉酶在淀粉水解工藝處理中溫度較高、原料容易變質(zhì)，制約了淀粉酶的進(jìn)一步應(yīng)用。低溫酶(Coldtemperature-enzyme)是指在低溫條件下能有效催化生化反應(yīng)的一類酶，最適反應(yīng)溫度比普通酶要低203(TC，而且在(TC有一定的活性。低溫淀粉酶酶促作用溫度低，在不加熱的情況下就可以保證較高的催化效率。另外，在生產(chǎn)中由于低溫淀粉酶對(duì)熱敏感，所以可以通過較低溫度的熱處理就可以使酶失活，節(jié)約了能源。低溫淀粉酶的這些特殊性質(zhì)使其在以下工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中具有較大優(yōu)勢(shì)。低溫發(fā)酵可生產(chǎn)許多風(fēng)味食品，節(jié)約能源及減少中溫菌的污染。如烘焙加工中，低溫淀粉酶可縮短生面團(tuán)發(fā)酵時(shí)間，提高面團(tuán)和面包瓤的質(zhì)量。低溫微生物具有高生長(zhǎng)速率、高酶活力及高催化效率，可大大縮短處理過程的時(shí)間并省卻昂貴的加熱等系統(tǒng)，在節(jié)能方面有相當(dāng)大的進(jìn)步?？勺鳛槠胀ǖ矸勖傅牧己锰娲?，可應(yīng)用于白酒、葡萄酒、啤酒等釀造、干酪生產(chǎn)、發(fā)酵食品的生產(chǎn)中的催熟作用等和動(dòng)物飼養(yǎng)等行業(yè)。低溫淀粉酶作為清潔劑的添加劑可節(jié)約能源，并能減少衣物扯破及磨損的幾率。低溫微生物在受污染環(huán)境中的生物增殖及接種，低溫微生物產(chǎn)生的低溫淀粉酶有助于提高對(duì)難處理化學(xué)物質(zhì)的生物降解能力。由于這些微生物具有高催化活性酶及它們?cè)谳^低的適宜溫度下的特殊專一性，使得低溫微生物及其產(chǎn)生的低溫淀粉酶成為生物治理的理想工具。由于低溫淀粉酶廣泛應(yīng)用于以上工業(yè)，成為應(yīng)用最為廣泛的酶之一，因此對(duì)低溫淀粉酶的需求量逐年增加，使得低溫淀粉酶的需求量大，存在巨大的缺口。目前的低溫淀粉酶產(chǎn)量難以滿足市場(chǎng)的要求。人們開始從冰山凍土篩選低溫淀粉酶產(chǎn)生菌，隨著陸地資源的不斷開發(fā)而面臨枯竭，將海洋微生物作為獲得活性物質(zhì)的新來源，成為人們研究的重點(diǎn)。海洋約占地球表面積的71%，其中蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源。特殊而復(fù)雜的海洋環(huán)境賦予海洋微生物特殊的遺傳結(jié)構(gòu)和生活習(xí)性，特別是海洋的低溫環(huán)境可能使海洋微生物產(chǎn)生不同于陸地來源生物低溫酶類。國(guó)內(nèi)對(duì)低溫淀粉酶的研究報(bào)道較少，王曉紅等從新疆高海拔地區(qū)分離得到一株解淀粉類芽孢桿菌(尸m"/Z^c/〃m/^_y/o/,'cw)產(chǎn)低溫淀粉酶。張剛從黃海分離到青霉菌(尸^/c/〃wwsp.)產(chǎn)低溫淀粉酶。目前國(guó)內(nèi)尚沒有海洋交替假單胞菌產(chǎn)低溫淀粉酶的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，通過選育一種新的交替假單胞菌來生產(chǎn)低溫淀粉酶。本發(fā)明所要解決的另外的技術(shù)問題是研究該菌株的生長(zhǎng)特性，及其產(chǎn)低溫淀粉酶的方法和產(chǎn)品。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明的特征包括交替假單胞菌GS230(尸化wtfofl/feTOmo"ossp.GS230)菌株本身，以及利用該菌株產(chǎn)低溫淀粉酶的方法，以及利用該菌株所產(chǎn)的低溫淀粉酶產(chǎn)品。本發(fā)明所涉及的菌株是在中國(guó)黃海連云港海域的海水中分離到的交替假單胞菌GS230(/^ew^a/feAwwo"ossp.GS230)，該交替假單胞菌GS230于2007年9月26日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCCN0.2156。一、本發(fā)明菌株的形態(tài)特征與生理生化特征。1.1形態(tài)特征對(duì)該菌進(jìn)行不同染色后，顯微鏡觀察該菌為革蘭氏陰性桿菌，有莢膜，無芽孢，大小為2.2-2.7|imx0.7-1.3|am。在淀粉固體培養(yǎng)基上的菌落特征直徑4mm-7mm，白色、濕潤(rùn)、邊緣光滑、中間突起、易挑取，能產(chǎn)生明顯的透明圈(見圖1-3)。1.2生理生化特征菌株GS230的生理生化特征以及與其它交替假單胞菌的比較見表1-2，該菌氧化酶、過氧化氫酶、VP試驗(yàn)均為陽性，不能發(fā)酵葡萄糖，賴氨酸脫羧酶、MR試驗(yàn)為陰性，能產(chǎn)生吲哚，不產(chǎn)生H2S;菌株能利用乳糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、檸檬酸鹽、丙酮酸鹽，丙氨酸、谷氨酸，而不能利用蔗糖、纖維二糖、蜜二糖。通過Bergey，sManualofSystematicBacteriology(第二版)分析比較菌株GS230與尸^Woa/ferawo"as屬內(nèi)其它種間理化特征，結(jié)果顯示GS230同Ae^foa/fcram，w的其它菌均有-定相似性，但又不完全相同，結(jié)合進(jìn)化樹的結(jié)果初步推測(cè)該菌為交替假單胞菌的一個(gè)新種。表1菌株GS230的生理生化特征特征結(jié)果特征氧化酶+聚-P-羥丁酸過氧化氫酶+Na4依賴VP-賴氨酸脫羧酶n引哚+明膠液化酶MR+H2S革蘭氏染色-發(fā)酵D-葡萄糖"+"為陽性，"一"為陰性表2菌株GS230的理化特征與其它交替假單胞菌的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>1.3菌株GS230的分子生物學(xué)鑒定16SrDNAPCR擴(kuò)增和序列分析用Takara試劑盒提取DNA模板，并于-40。C保存。正向引物P1:5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物P2:5'-CGGCTACCTTGTTACGAC-3'。反應(yīng)體系50pl，Taq酶2U，反應(yīng)條件為94i:預(yù)變性5min，94。C變性30s，54。C退火40s，72。C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)，72t:延伸7min。PCR產(chǎn)物的純化、克隆、測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。擴(kuò)增菌株GS230的16SrDNA，其長(zhǎng)度為1439bp。將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)菌株GS230與尸^wAa/terawo"w的16SrDNA自然類聚。選擇與其同源性高于98%的13株菌與GS230進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育的構(gòu)建，如圖4所示。從圖中可以看出菌株GS230與尸se"(ioa/妙o附owas1an:ric，/^eMotoa/欣o膨wos"'frea聚為~^群，表明它與這兩株菌的親緣關(guān)系最近。1.4菌株GS230的16SrDNA序列見說明書最后部分。因?yàn)樗猩锏?6SrDNA都具有高度的保守性，被稱為"細(xì)菌化石"，其進(jìn)化與時(shí)間有著密切的關(guān)系，采用16SrDNA作為物種的鑒定指標(biāo)，有著快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。二、本發(fā)明菌株的生長(zhǎng)特性本發(fā)明提供的交替假單胞菌GS230，對(duì)其生長(zhǎng)特性進(jìn)行了細(xì)致的研究，基本摸清不同條件下該菌的生長(zhǎng)情況。2.1關(guān)于本發(fā)明中的培養(yǎng)基2216E培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨5，酵母粉l，海水配制，pH8.0。淀粉固體培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉2，蛋白胨10，牛肉膏5，瓊脂20，海水配制，pH8.0。種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨IO，牛肉膏5，海水配制，pH8.0。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉2，蛋白胨IO，牛肉膏5，海水配制，pH8.0。產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉4，牛肉膏2.5，蛋白胨15,海水配制，pH8.0。微量礦物鹽(每升)CuS04.5H20,O.Olg;ZnS047H20，O.lg;CoCl2'6H20,O扁g;MnCl2.4H20,0.2g;Na2Mo04.2H20,O.lg;KBr,0.05g;KI,0.05g;H3B03.O.lg;NaF，0.05g;LiCl，0.05g;A12(S04)3.0,05g;NiCl2-6H20,O.Olg;VoS04-2H20,0.005g;H2W04.2H20，0.002g;Na2Se04,0.005g;SrC1.6H20，0.005g;BaCl2，O德g.2.2種子液的制備將保藏在2216E培養(yǎng)基的斜面菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速180r/min，裝液量20%，25。C培養(yǎng)16h。2.3不同溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響將種子液以2%接種量于發(fā)酵培養(yǎng)基，pH8.0，轉(zhuǎn)速180r/min，裝液量20%，分別在不同溫度下培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間測(cè)定細(xì)胞濃度，選擇在600nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌生長(zhǎng)溫度范圍為crc-3(rc，該菌在25t:下生長(zhǎng)最好，高于3(TC生長(zhǎng)受到抑制，表明它是一株耐冷菌(見圖5)。2.4pH對(duì)生長(zhǎng)的影響在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入終濃度為10mmol/L的磷酸醋酸硼酸(1:1:1)作為緩沖液，使發(fā)酵培養(yǎng)基的pH分別為3.0-11.0之間，在25"C培養(yǎng)24小時(shí)，其他條件同2.2，測(cè)定細(xì)胞濃度，結(jié)果見圖6，生長(zhǎng)pH范圍為5-10，最適生長(zhǎng)pH為7.0。2.5NaCl對(duì)生長(zhǎng)的影響按照2.2方法制備種子液，在發(fā)酵培養(yǎng)基(將用海水配制改用微量礦物鹽溶液代替，每升培養(yǎng)基加入10ml)中加入NaCl，使之為0%到11%的NaCl,在25t:培養(yǎng)24小時(shí)，其他條件同2.2，測(cè)定細(xì)胞濃度，結(jié)果見圖6。生長(zhǎng)的NaCl濃度為1%-9%，最適生長(zhǎng)的NaCl濃度為5%(見圖7)。三、產(chǎn)酶條件對(duì)酶產(chǎn)生的影響本發(fā)明提供的交替假單胞菌GS230產(chǎn)海洋低溫淀粉酶，對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行了較深入的研究，研究了不同因素對(duì)產(chǎn)酶的影響，在各種單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，選取了多因素進(jìn)行了正交試驗(yàn)，最終的優(yōu)化結(jié)果較大的提高了產(chǎn)酶。3.1發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響將種子液接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25。C、180r/min下，振蕩培養(yǎng)36h，每4h取出發(fā)酵液測(cè)酶活力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種后隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)酶活力逐漸升高，發(fā)酵24h達(dá)到最高，繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間后產(chǎn)酶開始下降，見圖8。3.2發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶影響將種子液接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在不同溫度(15°C、20°C、25°C、30°C、35°C)下進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，于180r/min、不同溫度下培養(yǎng)24h小時(shí)后取出測(cè)定酶活。結(jié)果顯示2(TC時(shí)產(chǎn)酶達(dá)到最高，高于2(TC后產(chǎn)酶迅速下降，15"C下有較高的產(chǎn)酶量，達(dá)到最高產(chǎn)酶的80。％，見圖9。3.3培養(yǎng)基pH對(duì)產(chǎn)酶的影響用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH，使培養(yǎng)基的pH在510之間，于2(TC、180r/min下振蕩培養(yǎng)24h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明隨著pH的升高酶產(chǎn)量逐漸增加，當(dāng)pH達(dá)到8.0時(shí)產(chǎn)酶量達(dá)到最大，pH繼續(xù)升咼后酶產(chǎn)量迅速下降，在低于pH5.0或高于pH10.0時(shí)酶產(chǎn)量均很低，見圖IO。3.4裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響搖瓶裝液量分別為10%、15%、20%、25%、30%、40%、和60%進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，裝液量太少溶氧過大，對(duì)菌體造成傷害不利于產(chǎn)酶，裝液量太多溶氧太差，不利于菌體生長(zhǎng)，同樣降低產(chǎn)酶，結(jié)果顯示裝液量在15%25%時(shí)產(chǎn)酶最高，見圖ll。3.5不同碳氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響去除培養(yǎng)基中的可溶性淀粉，分別在培養(yǎng)基加入0.5。^的各種碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、糊精、可溶性淀粉、纖維素、馬鈴薯淀粉)進(jìn)行碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響的發(fā)酵試驗(yàn)。去除培養(yǎng)基中的蛋白胨、牛肉膏，分別加入0.5%的各類氮源(蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米粉、酪蛋白、硫酸氨、硝酸銨)進(jìn)行氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響的發(fā)酵試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可溶性淀粉最能促進(jìn)產(chǎn)酶，糊精次之，葡萄糖、蔗糖和纖維素不利于產(chǎn)酶；牛肉膏和蛋白胨有利于產(chǎn)酶，無機(jī)氮源和酵母膏、酪蛋白、玉米粉等氮源不利于產(chǎn)酶，見表3。表3培養(yǎng)基中碳氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響HI相對(duì)酶活(％)Sl相對(duì)酶活(％)纖維素葡萄糖可溶性淀粉蔗糖糊精馬鈴薯淀粉5.6士1.413.0±4.7100.0±2.76.6±0.986.1±0.751.8±0.164.7±0.43.6正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)94.9±5.042.7±2.6100.0±3.626.0±2.719.0±1.27.3±3.421.4±3.7胨膏膏銨銨白粉白母肉酸酸蛋米蛋酵牛硝硫酪玉以發(fā)酵時(shí)間，接種量，可溶性淀粉，牛肉膏，蛋白胨為因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L16(45)進(jìn)行正交試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，幾個(gè)因素共同作用下最佳產(chǎn)酶條件為發(fā)酵時(shí)間32小時(shí)，接種量2.5%，可溶性淀粉0.4%，牛肉膏0.25%，蛋白胨1.5%，與單因素實(shí)驗(yàn)有所不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。表4正交試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>四、低溫淀粉酶的性質(zhì)4.1粗酶液的制備將種子液以2.5%的接種量，接種于產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，180r/min，2(TC培養(yǎng)32h，10000r/min離心10min，去除菌體，以65%的飽和度向上清液中加入硫酸銨，待硫酸銨充分溶解后于fC下鹽析2h，然后再以12000r/min離心20min，用25mM的Tris-HCl將沉淀溶解，在含有5mMCa2+的25mM的Tris-HCl溶液中4。C下透析8h，中間換一次透析液，結(jié)束后以10000r/min離心10min，除去雜質(zhì)，所得上清液即為粗酶液，可置于-4(TC冰箱保存。4.2酶作用溫度對(duì)酶活性的影響將酶分別在0。C、4°C、10°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40。C和50。C下，用pH8.0的Tris—HC1溶液(50mM)配制的1%淀粉溶液作為底物進(jìn)行酶活測(cè)定，結(jié)果見圖12，酶最適作用溫度為30°C,酶在低溫時(shí)仍然保持一定的酶活力，酶活下降緩慢，在0。C仍有28y。的催化效率。4.3酶的熱穩(wěn)定性取適量酶液(添加或不添加Ca2、終濃度分別在lmM禾B5mM)分別在不同溫度(25°C，30。C，35°C)下保溫2.5h，每隔0.5取出一組樣品，迅速置于(TC冰水混合物內(nèi)，待保溫結(jié)束后統(tǒng)一在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定殘余酶活，以未處理的酶液的酶活設(shè)為100%結(jié)果見圖13-15，酶熱穩(wěn)定性的研究在低溫下具有較好的熱穩(wěn)定性，25。C保溫2.5h，殘余酶活力超過80%，溫度升高后酶的熱穩(wěn)定性很差，3(TC時(shí)的半衰期為1.5小時(shí)，35。C保溫1.5h酶完全失活，Ca2+可以顯著提高酶的熱穩(wěn)定性，當(dāng)酶液中含有l(wèi)mM的C^+時(shí)3(TC保溫1.5h殘余酶活接近80%，當(dāng)酶液中含有5mMCa^時(shí)，3(TC保溫1.5h殘余酶活為93%。4.4酶的作用pH對(duì)酶活性的影響以不同pH緩沖液配制的1.0%的可溶性淀粉溶液作為底物，3(TC下進(jìn)行酶活力測(cè)定，不同pH值的緩沖液為50mM乙酸鈉緩沖液(pH4.06.0);50mM磷酸鈉緩沖液(pH6.08.0);50mMTris-鹽酸緩沖液(pH8.09.0);50mMGly-NaOH(pH9ll)。結(jié)果見圖16，隨著pH的升高酶活性呈上升趨勢(shì)，pH8.0時(shí)，酶活性達(dá)到最高，之后酶活性開始下降，pH9.0時(shí)相對(duì)酶活不到60/0。4.5酶的pH穩(wěn)定性將蒸餾水透析過夜的酶液與50mM的不同pH緩沖液以1:4的比例混勻，于30。C下保溫lh,測(cè)定殘余酶活力，以未處理的酶液的酶活設(shè)為100%,不同pH值的緩沖液同酶的作用pH—致。結(jié)果見圖17，隨著pH升高酶的穩(wěn)定性增強(qiáng)，當(dāng)pH8.0時(shí)酶的穩(wěn)定性最好，pH6.0-9.0酶穩(wěn)定性較好。4.6金屬離子、化學(xué)試劑對(duì)酶的作用將各種金屬離子與pH8.0的Tris—HCl溶液(50mM)配制的1%淀粉溶液，使其終濃度分別達(dá)到lmM和5.0mM，然后在3(TC下測(cè)酶活。將各種化學(xué)試劑與pH8.0的Tris—HCl溶液(50mM)配制的1%淀粉溶液混勻，使其終濃度分別為5mM和10mM，3(TC測(cè)酶活。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同離子對(duì)酶的反應(yīng)活性有著不同的影響，其中Na+、K+、Ba2+、Mg2+、C^+對(duì)低溫淀粉酶有著一定的激活作用，而Hg2+、Ag+、Pb2+、Cu2+、F^+對(duì)低溫淀粉酶有著較強(qiáng)強(qiáng)的抑制作用(見表5)。在幾種化學(xué)試劑對(duì)低溫淀粉酶的影響實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)EDTA、SDS、I-HAC、TCA對(duì)酶都有較強(qiáng)的抑制作用，DTT對(duì)酶有一定的激活作用，見表6。表5金屬離子對(duì)蛋白酶活力影響<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表6化學(xué)試劑對(duì)蛋白酶活力影響<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>4.7淀粉酶活測(cè)定。①淀粉酶活測(cè)定方法將10ul酶液加入到190ul1。/。的可溶性淀粉Tris-HCl緩沖液(50mM，pH8.0)中，在30。C水浴中反應(yīng)15min,用DNS測(cè)定還原糖②酶活力單位定義在3(TC、pH8.0的條件下每分鐘水解淀粉產(chǎn)生lug葡萄糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。圖1為菌株電子顯微鏡鏡檢圖。圖2為菌株革蘭氏染色的光學(xué)顯微鏡鏡檢圖。圖3為菌株在淀粉固體培養(yǎng)基上的透明圈圖。圖4菌株16SrRNA進(jìn)化樹分析圖。圖5為溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響圖。圖6為pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響圖。圖7為氯化鈉對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響圖。圖8為發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響圖。圖9為發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶影響圖。圖10為培養(yǎng)基pH對(duì)產(chǎn)酶的影響圖。圖ll為裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響圖。圖12為酶作用溫度對(duì)酶活性的影響圖。圖13為酶的熱穩(wěn)定性圖(25°C(A)5mMCa2+，(醒)lmMCa2+,(noCa2+)。圖14為酶的熱穩(wěn)定性圖(30。C(A)5mMCa2+,0i)lmMCa2+,(令)noCa2+)。圖15為酶的熱穩(wěn)定性圖(35°C(▲)5mMCa2+，(>)lmMCa2+,(>)noCa2+)。圖16為pH對(duì)酶活性的影響圖，()50mmol/L乙酸鈉緩沖液pH4.06.0,(國(guó))50mmol/L磷酸鈉緩沖液pH6.0~8.0,(▲)50mmol/LTris-HCl緩沖液pH8.0~9.0，(x)50mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液pH9~ll。圖17為酶的pH穩(wěn)定性圖，()50mmol/L乙酸鈉緩沖液pH4.06.0，(畫)50mmol/L磷酸鈉緩沖液pH6.0~8.0,(▲)50mmol/LTris-HCl緩沖液pH8.09.0,(x)50mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液pH9~ll。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1。參照?qǐng)Dl-17。一種交替假單胞菌GS230(i^ewctoa/feramo"assp.GS230)CGMCCNO.2156。該菌株具有以下特征為革蘭氏陰性桿菌，有莢膜，無芽孢，大小為2.2-2.7pnx0.7-1.3|mi;在淀粉固體培養(yǎng)基上的菌落特征直徑4mm-7mm，白色、濕潤(rùn)、邊緣光滑、中間突起、易挑取，能產(chǎn)生明顯的透明圈；其生理生化特征為，該菌氧化酶、過氧化氫酶、VP試驗(yàn)均為陽性，不能發(fā)酵葡萄糖，賴氨酸脫羧酶、MR試驗(yàn)為陰性，能產(chǎn)生吲哚，不產(chǎn)生H2S;菌株能利用乳糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、檸檬酸鹽、丙酮酸鹽，丙氨酸、谷氨酸，而不能利用蔗糖、纖維二糖、蜜二糖。實(shí)施例2。實(shí)施例1所述的交替假單胞菌GS230CGMCCN0.2156，該菌生長(zhǎng)溫度范圍為0。C-3(TC，屬耐冷菌；生長(zhǎng)pH范圍為5-10;生長(zhǎng)的NaCl濃度為范圍1%-9%。實(shí)施例3。實(shí)施例1所述的交替假單胞菌GS230CGMCCNO.2156，該菌適合生長(zhǎng)溫度為25°C，適合生長(zhǎng)pH為7.0，適合生長(zhǎng)的NaCl濃度為5%。實(shí)施例4。一種如實(shí)施例1-3中任何一項(xiàng)所述的交替假單胞菌GS230CGMCCNO.2156產(chǎn)低溫淀粉酶的方法，其步驟如下，將種子液以2.5%的接種量接種于產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，180r/min，2(TC培養(yǎng)32h，10000r/min離心10min，去除菌體，以65%的飽和度向上清液中加入硫酸銨，待硫酸銨充分溶解后于4TT下鹽析2h，然后再以12000r/min離心20min，用25mM的Tris-HCl將沉淀溶解，在含有5mMCa2+、25mM的Tris-HCl溶液中4°C下透析8h，中間換一次透析液，結(jié)束后以10000r/min離心10min，除去雜質(zhì)，所得上清液即為低溫淀粉酶。實(shí)施例5。一種如實(shí)施例4所述的方法所產(chǎn)低溫淀粉酶，所述的低溫淀粉酶的理化性質(zhì)為低溫淀粉酶的適合作用溫度為3(TC，酶在低溫時(shí)仍然保持一定的酶活力，在低溫下具有熱穩(wěn)定性，25。C保溫2.5h，殘余酶活力超過80%，Ca^可以顯著提高酶的熱穩(wěn)定性；適合作用pH8.0，pH6.0-9.0酶具有穩(wěn)定性；Na+、K+、Ba2+、Mg2+、(^2+對(duì)低溫淀粉酶有著一定的激活作用，Hg2+、Ag+、Pb2+、Cu2+、Fe3+對(duì)低溫淀粉酶有抑制作用；EDTA、SDS、I-HAC、TCA對(duì)酶有抑制作用，DTT對(duì)酶有激活作用?！?10〉淮海工學(xué)院〈120〉海洋微生物低溫淀粉酶及其產(chǎn)生菌交替假單胞菌GS230<160〉1〈210〉1〈211〉菌〈212〉RNA〈213〉交替假單胞菌GS230(Pseudoalteromonassp.GS230)〈400〉1ctttgctgaccaacagttggtctcgcctttgcgacgatccagsctcctaccatgccgcgtttagtggttatgccagcagccgtacgcaggtttcgaactgatgcgt卿gctcatgtBCgacgatgtctagaccgcctggaagcggtggatacagag犯cggctgtcgtcatccttagtt鄉(xiāng)鄉(xiāng)gtggacaatggcgccgtagtccggtatcag朋tgggagtgggttt已gtttagcagcggcggaja犯cgactgcagattggcccctagctggttgtgtg犯g犯eitacccgttscgcggtaatacggtttgttagcaaactagaatctgaagga咖gcgtgggctagaagctcggagtacggcgcatgtggttagctcgtgttgctagc郷tggacgacgtcatacagagtgattggagtctacgcggtgaagctcctgaag1388cgggtgagtataataccgcaaagtgggatttg卿ggatgggccttcggggctgtgacgtcggagggtgcagcg卿tgtgtgtgat卿ataccgatggg3gC犯3Cggggagcctcggcgcaaggttatggtttggtggtg卿tgttaatgctg已gaaagtcatcatctgcgaactcgcaactxgactacgttcccgtttatagtctatgcttgggat組gtctacagctagttggatcagccacattgtaaagcatactgacagag3gcgttaeitgaaagccccggggtggt卿Cg犯ggC3gCgattagatacwtctgtttttaaactcaaatcaacgcgasgccttcgggaagggtt鄉(xiāng)tcactctaaggaggcccttacggcgaaagtaatccatgaagtggccttgtacgccctggggaacatgccttgaggtggggga60ggaccaaagggggcttcggc120tgaggtaatggctcaccaag180ctgggactgagacacggccc240gggcgcaagcctgatgcagc300ctttcagtcaggaggaaagg360agaagcaccggctaactccg420cggaattactgggcgta卿480ggctcaacctggggiactgCEi540atttcaggtgtagcggtgaei600cacctgggtcaacactgacg660cccggtagtccacgccgtaa720caaagct幼cgcattaagta780gaattgacgggggcccgcaic840aaccttacctacacttgaca900ctctgatacaggtgctgcat960ccgcaacgagcgcaacccct1020gactgccggtgataaaccgg1080tgtagggctacacacgtgct1140gcgaatcacttaaagtgcgt1200cggaatcgctagtaatcgcg1260acaccgcccgtcacaccatg1320aacaagtaagcacggg卿g1380權(quán)利要求1.一種交替假單胞菌GS230(Pseudoalteromonassp.GS230)CGMCCNO.2156。2.根據(jù)權(quán)利要求1的交替假單胞菌GS230CGMCCNO.2156，該菌株具有以下特征為革蘭氏陰性桿菌，有莢膜，無芽孢，大小為2.2-2.7μmx0.7-1.3μm;在淀粉固體培養(yǎng)基上的菌落特征直徑4mm-7mm，白色、濕潤(rùn)、邊緣光滑、中間突起、易挑取，能產(chǎn)生明顯的透明圈；其生理生化特征為，該菌氧化酶、過氧化氫酶、VP試驗(yàn)均為陽性，不能發(fā)酵葡萄糖，賴氨酸脫羧酶、MR試驗(yàn)為陰性，能產(chǎn)生噴哚，不產(chǎn)生H》；菌株能利用乳糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、檸檬酸鹽、丙酮酸鹽，丙氨酸、谷氨酸，而不能利用蔗糖、纖維二糖、蜜二糖。3.根據(jù)權(quán)利要求1的交替假單胞菌GS230CGMCCN0.2156，其特征在于，該菌生長(zhǎng)溫度范圍為0°C-30°C，屬耐冷菌；生長(zhǎng)pH范圍為5-10;生長(zhǎng)的NaCl濃度為范圍1%-9%。4.根據(jù)權(quán)利要求1的交替假單胞菌GS230CGMCCN0.2156，其特征在于，該菌適合生長(zhǎng)溫度為25'C，適合生長(zhǎng)pH為7.0，適合生長(zhǎng)的NaCl濃度為5%。5.根據(jù)權(quán)利要求1的交替假單胞菌GS230CGMCCNO.2156，其特征在于，該菌株16SrRNA序列為ctttgctgaccagcggcggacgggtgagtaatgcttgggaacatgccttgaggtggggga60caacagttggaaacgactgctaataccgcataatgtctacggaccaaagggggcttcggc120tctcgcctttagattggcccaagtgggattagctagttggtgaggtaatggctcaccaag180gcgacgatccctagctggtttgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggccc240agactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagc300catgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcacttteagteaggaggaaagg360ttagtggttaatacccgttagctgtgacgttactgacagaagaagcaccggctaactccg420tgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcggaattactgggcgtaaag480cgtacgcaggcggtttgttaagcgagatgtgaaagccccgggctcaacctgggaactgca560tttcgaactggcaaactagagtgtgatagagggtggtagaatttcaggtgtagcggtgaa620atgcgtagagatctgaaggaataccgatggcgaaggcagccacctgggtcaacactgacg680ctcatgtacgaaagcgtggggagcaaacgggattagataccccggtagtccacgccgtaa720acgatgtctactagaagctcggagcctcggwtctgtttttcaaagctaacgcattaagta780gaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcac840aagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctacacttgaca900tacagagaacttaccagagatggtttggtgccttcgggaactctgatacaggtgctgcat960ggctgtcgtcagctcgtgttgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccct1020atccttagttgctagcaggtaatgctgagaactctaaggagactgccggtgataaaccgg1080aggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatggcccttacgtgtagggctacacacgtgct1140acaatggcgcatacagagtgctgcgaactcgcgaaagtaagcgaatcacttaaagtgcgt1200cgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcg1260tateagaatgacgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatg1320ggagtgggttgctcctgaagtttatagtctgccctggggaaacaagtaagcacgggagag1380tagtttag13886.—種如權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)所述的交替假單胞菌GS230CGMCCNO.2156產(chǎn)低溫淀粉酶的方法，其特征在于，其步驟如下，將種子液以2.5%的接種量接種于產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，180r/min，20。C培養(yǎng)32h，10000r/min離心10min，去除菌體，以65%的飽和度向上清液中加入硫酸銨，待硫酸銨充分溶解后于4i:下鹽析2h，然后再以12000r/min離心20min，用25mM的Tris-HCl將沉淀溶解，在含有5mMCa2+、25mM的Tris-HCl溶液中4"C下透析8h，中間換一次透析液，結(jié)束后以10000r/min離心10min，除去雜質(zhì)，所得上清液即為低溫淀粉酶。7.—種如權(quán)利要求6所述的方法所產(chǎn)低溫淀粉酶，其特征在于，所述的低溫淀粉酶的理化性質(zhì)為低溫淀粉酶的適合作用溫度為30°C，酶在低溫時(shí)仍然保持一定的酶活力，在低溫下具有熱穩(wěn)定性，25°C保溫2.5h，殘余酶活力超過80%，Ca2+可以顯著提高酶的熱穩(wěn)定性；適合作用pH8.0，pH6.0-9.0酶具有穩(wěn)定性；Na+、K+、Ba2+、Mg2+、C對(duì)低溫淀粉酶有著一定的激活作用，Hg2+、Ag+、Pb2+、Cu2+、Fe3+對(duì)低溫淀粉酶有抑制作用；EDTA、SDS、I-HAC、TCA對(duì)酶有抑制作用，DTT對(duì)酶有激活作用。全文摘要本發(fā)明是一種交替假單胞菌GS230(Pseudoalteromonassp.GS230)CGMCCNO.2156。該菌株能夠在4℃下生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)溫度范圍為0-30℃，最適生長(zhǎng)溫度為25℃；生長(zhǎng)pH范圍為5-10，最適生長(zhǎng)pH為7.0；生長(zhǎng)的NaCl濃度為1％-9％，最適生長(zhǎng)的NaCl濃度為5％，屬于海洋耐冷菌。本發(fā)明還公開了一種利用交替假單胞菌產(chǎn)低溫淀粉酶的方法及按該方法得到的低溫淀粉酶產(chǎn)品。該低溫淀粉酶可應(yīng)用到焙烤業(yè)用于產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)，可以與蛋白酶混合后直接室溫洗滌，節(jié)省能源；且在飼料、紡織、環(huán)保、醫(yī)藥等領(lǐng)域也具有廣泛的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C12N1/20GK101200699SQ20071019040公開日2008年6月18日申請(qǐng)日期2007年11月21日優(yōu)先權(quán)日2007年11月21日發(fā)明者殊劉,劉紅飛,呂明生,房耀維,王淑軍,麗陳申請(qǐng)人:淮海工學(xué)院