專利名稱：：起搏通道基因亞型hcn4重組慢病毒載體的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種起搏通道基因亞型HCN4重組慢病毒載體的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：哺乳動物基因組編碼四種HCN基因，分別命名為HCN1HCN4。這四種異構(gòu)體在心臟中均已發(fā)現(xiàn)，但不同種屬、不同心臟組織和發(fā)育不同階段這些異構(gòu)體的表達(dá)存在差異不同種屬成年動物竇房結(jié)均優(yōu)勢表達(dá)HCN4，約占竇房結(jié)總體HCN的80%。在四種異構(gòu)體中HCN1，2，4是心臟中的主要部分，HCN3只在胚胎起搏細(xì)胞中有低水平表達(dá)。起搏活性小的區(qū)域(如心室肌)，HCN2的表達(dá)占優(yōu)勢；而起搏活性高的區(qū)域HCN4的表達(dá)占優(yōu)勢。目前對于生物起搏的研究集中于HCN2和HCN4。目前的研究大多使用腺病毒表達(dá)系統(tǒng)來初步探討生物起搏的可行性；雖然此類研究也獲得了較大的成就，但由于腺病毒表達(dá)系統(tǒng)具有高免疫原性，其病毒基因組游離于宿主基因組外，所以只能瞬時表達(dá)外源基因，國外體內(nèi)的研究僅僅持續(xù)了3-10天，這就限制了它的發(fā)展。慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的基本結(jié)構(gòu)，但也有不同于逆轉(zhuǎn)錄病毒的組份和特性，該病毒既可以感染分裂細(xì)胞又可以感染非分裂細(xì)胞；其病毒基因組可以整合于宿主基因組中，長時間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因并具有較低的免疫原性，這是其最為突出的優(yōu)點?？梢娐《究赡苁腔蛑委煹淖罴演d體，以后的發(fā)展趨勢也許是利用慢病毒為載體，結(jié)合細(xì)胞治療和基因治療；把起搏基因HCNl-4轉(zhuǎn)到干細(xì)胞中，增加起搏細(xì)胞的起搏電流(If)來治療慢性心律失常。而構(gòu)建起搏通道基因亞型HCN重組慢病毒載體是研究HCN基因、起搏電流的特性以及生物起搏等的前提和基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種起搏通道基因亞型HCN4重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，將帶有HCN4基因的穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN4與慢病毒一起建立HCN4重組病毒載體，成為慢性心律失常的細(xì)胞治療和基因治療的基礎(chǔ)。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種起搏通道基因亞型HCN4重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，包括將帶有HCN4基因的穿梭質(zhì)粒與病毒系統(tǒng)一起建立HCN4重組病毒載體，所述穿梭質(zhì)粒為pCDHl-GFP-HCN4，所述病毒為慢病毒。本發(fā)明進(jìn)一步的技術(shù)方案是一種起搏通道基因亞型HCN4重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，包括將帶有HCN4基因的穿梭質(zhì)粒與病毒系統(tǒng)一起建立HCN4重組病毒載體，所述穿梭質(zhì)粒為pCDHl-GFP-HCN4，所述病毒為慢病毒；所述穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN4的獲得包括以下步驟(1)將目的片段HCN4基因從pcDNA3-HCN4中切下，連接入Pucl9質(zhì)粒中，獲得Pucl9-HNC4質(zhì)粒；(2)將目的片段HCN4基因從Pucl9-HNC4中切下，連接入pcDNA3.1A質(zhì)粒中，獲得pcDNA3.1A-HNC4質(zhì)粒；(3)將目的片段HCN4基因從pcDNA3.1A-HNC4中切下，連接入pCDHl-MCSl-EFl-copGFP質(zhì)粒中，獲得穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN4。所述構(gòu)建方法還包括將穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN4與慢病毒系統(tǒng)重組后的慢病毒載體包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，獲得病毒液；對病毒液進(jìn)行病毒滴度測定，并進(jìn)行濃縮和純化得到高質(zhì)量的病毒液。在病毒液的制備過程中，首先對穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN4的制備步驟(l)所得的Pucl9-HCN4質(zhì)粒利用EcoRl單酶切進(jìn)行鑒定；其次對穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN4的制備步驟(2)所得的pcDNA3.1A-HNC4質(zhì)粒利用XbaI單酶切進(jìn)行鑒定；然后對穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN4的制備步驟(3)所得的pCDHl-GFP-HCN4質(zhì)粒利用XbaI單酶切進(jìn)行鑒定；最后通過感染宿主細(xì)胞對病毒液中的HCN4重組慢病毒載體進(jìn)行了鑒定，證明了穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN4與慢病毒系統(tǒng)重組后的HCN4慢病毒載體是正確的。本發(fā)明的優(yōu)點是慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，其最為突出的優(yōu)點包括其既可以感染分裂細(xì)胞又可以感染非分裂細(xì)胞；其病毒基因組可以整合于宿主基因組中，長時間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因并具有較低的免疫原性。把帶有起搏基因HCN4的片段重組到慢病毒中，進(jìn)而再轉(zhuǎn)到干細(xì)胞中，以增加起搏細(xì)胞的起搏電流(If)來治療慢性心律失常。因此，構(gòu)建起搏通道基因亞型HCN重組慢病毒載體是研究HCN基因、起搏電流的特性以及生物起搏等的前提和基礎(chǔ)。圖1為獲取Puc-19-HCN4質(zhì)粒的EcoRI單酶切產(chǎn)激諒脂糖凝膠電泳結(jié)果A泳道XDNA/HindIIIMarker;B、D、E泳道陽性菌落(Pucl9+目的片段^6.3kb)，艮卩Pucl9隱HNC4;C泳道陰性菌落(PUC19:2.7kb);圖2為獲取pcDNA3.1A-HNC4質(zhì)粒的XbaI單酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果-A泳道ADNA/HindIIIMarker;B、C、D泳道陽性菌落(pCDNA3.1A:5.5kb;目的片段3.6kb)，即pCDNA3.1A-HNC4;圖3為獲取pCDHl-GFP-HNC4質(zhì)粒的XbaI單酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果A、E、G、I泳道陽性菌落(pCDHl-GFP:7.5kb;目的片段3.6kb)，即pCDHl-GFP-HNC4;B、C、D、F、H泳道陰性菌落；J泳道ADNA/HindIIIMarker;圖4為pCDHl-GFP-HNC4質(zhì)粒的PCR反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果A泳道MarkerI(TIANGEN);B、C、D、E泳道分別為A、E、G、I質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物(432bp);圖5為轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24小時后的熒光照片；圖6為病毒感染豬骨髓干細(xì)胞48小時后，目的細(xì)胞的熒光照片；圖7為Westernblot蛋白電泳圖一；干擾原代細(xì)胞；對照穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞；圖8為Westernblot蛋白電泳圖二；干擾原代細(xì)胞；對照穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞；圖9為RNA電泳圖10為HCN4real-timeRT-PCR實時定量檢測結(jié)果圖11為慢病毒包裝系統(tǒng)建立穩(wěn)定表達(dá)HCN4基因的骨髓干細(xì)胞的操作流程圖。具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述實施例一種起搏通道基因亞型HCN4重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，包括將帶有HCN4基因的穿梭質(zhì)粒與病毒系統(tǒng)一起建立HCN4重組病毒載體，所述穿梭質(zhì)粒為pCDHl-GFP-HCN4，所述病毒為慢病毒。所述穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN4的獲得包括以下步驟(1)將目的片段HCN4基因從pcDNA3-HCN4中切下，連接入Pucl9質(zhì)粒中，獲得Pucl9-HNC4質(zhì)粒；(2)將目的片段HCN4基因從Pucl9-HNC4中切下，連接入pcDNA3.1A質(zhì)粒中，獲得pcDNA3.1A-HNC4質(zhì)粒；(3)將目的片段HCN4基因從pcDNA3.1A-HNC4中切下，連接入pCDHl-MCSl-EFl-copGFP質(zhì)粒中，獲得穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN4。所述構(gòu)建方法還包括將穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN4與慢病毒系統(tǒng)混合重組后的HCN4慢病毒載體包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，獲得病毒液；對病毒液進(jìn)行病毒滴度測定，并進(jìn)行濃縮和純化得到高質(zhì)量的病毒液。具體實施例一、HCN4-cDNA表達(dá)載體的構(gòu)建
發(fā)明內(nèi)容1、試劑和耗材1)載體pCDHl-MCSl-EFl-copGFP(7544bp)(上?？党缮锕?；pcDNA3(5.4kb)(上?？党缮锕?；pucl9(2686bp)(上?？党缮锕?；pcDNA.3.1/myc-His(-)A(5.5kb)(上?？党缮锕?；pCDNA3-hHCN4(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科實驗室保存)。2)LaTaq酶TAKARA3)連接試齊U盒Epicentre4)限制性內(nèi)切酶NEB5)制備感受態(tài)試劑盒BIOSCIENCES6)小量抽提試齊U盒Axygen、Qiagen7)凝膠回收試劑盒Qiagen8)入DNA/HindIIIMarker:TAKARADNAMarkerI:TIANGEN9)電熱恒溫培養(yǎng)箱上海森信實驗儀器有限公司10)恒溫?fù)u床華美生化儀器11)電熱恒溫水浴鍋上海森信實驗儀器有限公司12)電泳儀君意東方電泳設(shè)備13)數(shù)碼凝膠處理系統(tǒng)天能科學(xué)儀器2、步驟和方法重組質(zhì)粒pCDNA3-hHCN4的目的序列插入于pcDNA3載體上，插入的位點為EcoRI和XbaI，首先從質(zhì)粒pCDNA3-hHCN4中用EcoRI和XbaI切下目的片段連接到Pucl9載體中，再用EcoRI和HindIII切下目的片段連接到pcDNA3.1(A)載體中，再用XbaI單酶雙切到pCDHl-MCSl-EFl-copGFP中。質(zhì)粒用XbaI或者EcoRI鑒定。(一)、將目的片段從pcDNA3-HCN4中切下，連接入Pucl9質(zhì)粒中1)對帶有目的片段的pcDNA3-HCN4和Pucl9用EcoRI和XbaI進(jìn)行順序雙酶切(由于EcoRI和XbaI沒有適合的雙酶切buffer,因此采用順序酶切)a)XbaI酶切體系如下XbaI(20U/ji1)lfilNEBuffer2(10X)3^ilpcDNA3-HCN4/Pucl9(SOOng/pl)2^ildH2024^1共計30^1反應(yīng)條件如下37°C、6小時；b)將單酶切產(chǎn)物進(jìn)行乙醇沉淀30ul酶切體系中加入3ul3M乙酸鈉(pH5.2)，再加入70ul無水乙醇，一20'C沉淀30分鐘；lOOOOrpm離心10分鐘，棄上清，沉淀進(jìn)行下一步酶切反應(yīng)；c)EcoRI酶切體系如下EcoRI(20U/nl)NEBufferEcoRI(10X)3jilpcDNA3-HCN4/Pucl9(500ng/jil)2^1dH2024jil共計30jil反應(yīng)條件為37°C、6小時。2)對酶切載體和目的基因片段進(jìn)行凝膠電泳后回收，由于紫外線會造成堿基突變，因此在該步驟中不進(jìn)行拍照，直接切膠回收，回收方法如下a)在紫外燈下，用干凈的手術(shù)刀將目的片斷條帶切下，放于干凈的1.5ml離心管中，盡量不要切到多余的凝膠；b)稱重，加三倍體積的BufferQG到離心管中，即每100mg凝膠加300ulBufferQG;c)將離心管放于5(TC水浴中，放置10分鐘，直至凝膠完全融解，期間每兩、三分鐘晃動離心管一次；d)觀察凝膠溶液的顏色，如果為橙色或紫色，則添加5ul3M的NaAC(pH5.2);e)加100ul，即一倍凝膠體積的異丙醇于凝膠溶液中，將凝膠混合液加入到QIAquickspincolumn中，將回收柱插于2ml廢液收集管中，13，000rpm離心一分鐘；f)棄收集管中廢液，將回收柱插回收集管中，柱中添加0.5mlBufferQG，13，000rpm離心一分鐘；g)棄收集管中廢液，將回收柱插回收集管中，柱中添加0.75mlBufferPE,放置2—5分鐘，13，000rpm離心一分鐘；h)棄收集管中廢液，將回收柱插回收集管中，13，000rpm離心一分鐘；i)將回收柱取下插入干凈的1.5ml離心管中，柱中加入50ulBufferEB(10mMTris-Cl，pH8.5)到柱子中心的膜上，放置2—5分鐘，13，000rpm離心一分鐘；若想獲得更多量的回收產(chǎn)物，可以重復(fù)該步驟一次；1.5ml離心管中則為回收產(chǎn)物。3)將回收的雙酶切的Pucl9和目的基因片段進(jìn)行連接反應(yīng)，根據(jù)Epicentre試劑盒說明書進(jìn)行如下操作a)連接體系如下:線性化Pucl9雙酶切目的基因10xbufferATPLigasedH202^1lul1.3^1共計lOfilb)反應(yīng)條件室溫連接8分鐘；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布Amp+LB平板，37'C過夜培養(yǎng)a)取一80'C保存的DH5a感受態(tài)細(xì)菌，冰浴放置5-10分鐘，使之冰中融化；b)將5nl連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)菌，用移液槍緩慢混勻，冰浴放置30分鐘；c)將混有連接產(chǎn)物的感受態(tài)細(xì)菌放入42'C水浴中，熱擊90秒，冰浴2分鐘；d)將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加入900ul的SOC培養(yǎng)基中，37°C、150rpm搖床培養(yǎng)1小時；e)3，000rpm離心2分鐘，棄上清，加入200ulLB培養(yǎng)基重懸細(xì)菌涂布AmpLB平板。其中根據(jù)BIOSCIENCES試劑盒說明書制備感受態(tài)細(xì)菌，過程如下a)取DH5a甘油菌種，在LB平板中劃線，37'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；b)挑取一個單克隆接種入0.5mlLB培養(yǎng)基中，240rpm，37C搖床培養(yǎng)過夜；c)將過夜培養(yǎng)的0.5ml菌液轉(zhuǎn)移到50mlSOB培養(yǎng)基中，240rpm，25°C搖床培養(yǎng)，直至OD600在0.4-0.6之間；d)將培養(yǎng)細(xì)菌的錐形瓶放于冰上冷卻IO分鐘；e)將菌液轉(zhuǎn)移到滅菌的50ml離心管中，2,500Xg，4'C離心6分鐘；f)棄上清，用5ml冰上預(yù)冷的1Xwashbuffer重懸沉淀，2，500Xg，4°C離心6分鐘；g)棄上清，用5ml預(yù)冷的1Xcompetentbuffer重懸沉淀；h)小量分裝，每管100ul，快速放入液氮中；i)一8(TC保存，備用。挑取單菌落，接種于5mlAmp+LB液體培養(yǎng)基中，37°C、250rpm搖床培養(yǎng)過夜；使用Axygen質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，根據(jù)Axygen試劑盒說明書質(zhì)粒抽提步驟如下a)過夜培養(yǎng)的5ml菌液用2ml做甘油菌保，剩余3ml分兩次于一個1.5ml離心管中12，000Xg離心1分鐘，徹底去除上清；b)加入250WBefferSl，振蕩器充分重懸細(xì)菌；c)加入250^1BefferS2，顛倒混勻4一6次；注意不能劇烈混合，否則會出現(xiàn)基因組DNA污染；d)加入250|alBefferS2五分鐘內(nèi)加入350nlSolutionIII,輕輕顛倒混勻6—8次；e)12，000Xg，離心10分鐘；將上清轉(zhuǎn)移到Miiiiprep柱中，Miniprep柱插于廢液收集管中，12，000Xg離心1分鐘；注意不要吸到沉淀，否則會出現(xiàn)基因組DNA和蛋白質(zhì)污染；f)棄收集管中的廢液，將Miniprep柱插于收集管中，加700WBufferW2到Miniprep柱中，12,000Xg離心1分鐘；重復(fù)該步驟一遍；g)棄收集管中的廢液，將Miniprep柱放入同一支收集管中，12，000Xg離心1分鐘徹底去除BufferW2;h)將Minipre柱放入新的干凈的1.5ml離心管中，力B50^1Eluent，室溫放置1分鐘后，12，000Xg離心1分鐘；離心管中的溶液即為所抽提的質(zhì)粒，抽提后質(zhì)粒濃度統(tǒng)一調(diào)整為500ng/ul。抽提的質(zhì)粒使用EcoRl單酶切鑒定目的片段是否插入Pucl9質(zhì)粒中，插入了目的片段的質(zhì)粒命名為Puc-19-HCN4:a)酶切體系如下EcoRI(20U/nl)NEBufferEcoRI(10X)3jdPucl9-HCN4(500ng/fil)2(ildH2024jil共計30jilb)反應(yīng)條件為37°C、6小時。使用酶切產(chǎn)物5nl上樣，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖l所示。(二)、將目的片段從Pucl9-HNC4中切下，連接入pcDNA3.1A質(zhì)粒中l(wèi))對帶有目的片段的Pucl9-HCN4和pcDNA3.1A用EcoRI和HindIII進(jìn)行雙酶切(由于EcoRI和HindIII沒有適合的雙酶切buffer,因此采用順序酶切)a)酶切體系如下HindIII(20U/nl)lfdNEBuffer2(10X)3^1Pucl9-HCN4/pCDNA3.1A(500ng/nl)2fddH2023fil共計30^1反應(yīng)條件如下37°C、6小時；b)將單酶切產(chǎn)物進(jìn)行乙醇沉淀30ul酶切體系中加入3ul3M乙酸鈉(pH5.2)，再加入70ul無水乙醇，一20'C沉淀30分鐘；lOOOOrpm離心10分鐘，棄上清，沉淀進(jìn)行下一步酶切反應(yīng)；c)EcoRI酶切體系如下EcoRI(20U/fd)lfilNEBufferEcoRI(10X)3filpcDNA3-HCN4/Pucl9(500ng/fil)2fildH2024fd共計30fil反應(yīng)條件為37°C、6小時；2)對酶切載體和目的基因片段進(jìn)行凝膠電泳后回收，由于紫外線會造成堿基突變，因此在該步驟中不進(jìn)行拍照，直接切膠回收，回收方法同步驟(一)所述；3)將回收的雙酶切的pCDNA3.1A和目的基因片段進(jìn)行連接反應(yīng)，根據(jù)Epicentre試劑盒說明書進(jìn)行如下操作a)連接體系如下線性化pCDNA3.1Aljil雙酶切目的基因5^110xbufferlfilATPlulLigase0.7(UdH201.3jilb)反應(yīng)條件室溫連接8分鐘；4)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布Amp+LB平板，37'C過夜培養(yǎng)；5)挑取單菌落，接種于5mlAmp+LB液體培養(yǎng)基中，37°C、250rpm搖床培養(yǎng)過夜；使用Axygen質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，方法同步驟(一)；6)抽提的質(zhì)粒使用XbaI單酶切鑒定目的片段是否插入pCDNA3.1A質(zhì)粒中，此時載體中目的片段兩端分別有一個Xbal酶切位點，前面一個是pCDNA3.1A自身帶有的，后面一個為從Pucl9質(zhì)粒中帶來的，因此使用XbaI單酶切，若為陽性克隆則能看到兩條電泳條帶，一條為目的片段3.6kb，另一條為pCDNA3.1質(zhì)粒5.5kb。插入了目的片段的質(zhì)粒命名為pCDNA3.1A誦HCN4:a)酶切體系如下XbaI(20U/nl)lfdNEBuffer2(10X)3^1pCDNA3.1A-HCN4(500ng/fi1)2fUdH2024jil共計30fdb)反應(yīng)條件如下37°C、6小時；使用酶切產(chǎn)物5ul上樣，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示。(三)、將目的片段從pcDNA3.1A-HNC4中切下，連接入pCDHl-MCSl-EFl-copGFP質(zhì)粒中l(wèi))對帶有目的片段的pcDNA3.1A-HNC4和pCDHl-MCSl-EFl-copGFP(以下簡寫為pCDHl-GFP)用XbaI進(jìn)行單酶切a)酶切體系如下XbaI(20U/ja1)1^1NEBuffer2(10X)3fi1pcDNA3.1A-HNC4/pCDHl-GFP(500ng/nl)2^1dH2024jd共計30jilb)反應(yīng)條件如下37°C、6小時；2)對酶切載體和目的基因片段進(jìn)行凝膠電泳后回收，由于紫外線會造成堿基突變，因此在該步驟中不進(jìn)行拍照，直接切膠回收，回收方法同步驟(一)所述；3)將回收的單酶切的pCDHl-GFP和目的基因片段進(jìn)行連接反應(yīng)，根據(jù)Epicentre試劑盒說明書進(jìn)行如下操作a)連接體系如下線性化pCDHl-GFP(O.lug/ul)lfil單酶切目的基因5pl10xbufferlfilATPlulLigase0.7(ddH201.3fd共計lOfilb)反應(yīng)條件室溫連接8分鐘；4)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布Amp+LB平板，37'C過夜培養(yǎng)；5)挑取單菌落，接種于5mlAmp+LB液體培養(yǎng)基中，37'C、250rpm搖床培養(yǎng)過夜；使用Axygen質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，方法同步驟(一)；6)抽提的質(zhì)粒使用Xbal單酶切鑒定目的片段是否插入pCDHl-GFP質(zhì)粒中，插入了目的片段的質(zhì)粒命名為pCDHl-GFP-HCN4:a)酶切體系如下XbaI(20U/jil)lulNEBuffer2(10X)3filpCDHl-GFP-HNC4(500ng/fU)2fddH2024jd共計30^1b)反應(yīng)條件如下37°C、6小時；使用酶切產(chǎn)物lOul上樣，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示;7)將A、E、G、I質(zhì)粒作為模板，使用巢式引物進(jìn)行PCR鑒定a)根據(jù)HNC4基因序列設(shè)計巢式引物序列為nestHCN4-F(4259)GACGGCTCCTACTTTGG驗nestHCN4-R(4691)b)PCR體系如下LABuffer(MgC12+)Taq(2.5U/ul)dNTP(25mM)Fprimer(10uM)Rprimer(10uM)pCDHl-GFP國HNC4dH20共計C)PCR反應(yīng)條件如下94。C94°C55。C72°C72。C4°CGGTGGGTGAGGGCTAT2.5ul0.25ul4ul0.25ul0.25ulO.lul17.65ul25ul3分鐘20秒20秒33循環(huán)40秒5分鐘+00取lOulPCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如4所示。(四)使用Qiagen小抽試劑盒抽提去內(nèi)毒素質(zhì)粒用于后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實1)吸取lOul陽性克隆的菌保接種于2—5mlAmp+LB培養(yǎng)基中，37°C、300rpm搖床培養(yǎng)8小時；2)將步驟l)中培養(yǎng)的菌液按1/500或1/1000接種到Amp+LB中，即3-6ul菌液接種于3mlAmp+LB中，37°C、300rpm搖床培養(yǎng)12—16小時；3)菌液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，4°C、6000Xg離心15分鐘；4)棄上清，力tl0.3ml含有RNaseA的BufferPI重懸細(xì)菌沉淀，振蕩、充分重懸；5)加入0.3mlBufferP2，顛倒混勻4一6次，不能振蕩混勻，以免出現(xiàn)基因組污染，室溫放置5分鐘；6)加入0.3ml預(yù)冷的BufferP3，顛倒混勻4一6次，冰上放置5分鐘；7)4°C、20，000Xg離心IO分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中；重復(fù)該步驟一次；8)將lmlBufferQBT力卩入QIAGEN-tip20中，Buffer靠重力作用流過QIAGEN誦tip20以平衡QIAGEN-tip20;9)將步驟7)中的上清加入到QIAGEN-tip20中，溶液靠重力作用流出，質(zhì)粒DNA則結(jié)合在QIAGEN-tip20的膜上；10)用2mlBufferQC洗QIAGEN-tip20兩次；11)用500ulBufferQF將質(zhì)粒從QIAGEN-tip20的膜上洗脫下來。12)12)取l一2ul用分光光度計測定質(zhì)粒濃度，用無菌水將質(zhì)粒濃度調(diào)整為0.5ng/ul，以備后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗用。二、使用慢病毒系統(tǒng)建立HCN4重組慢病毒載體及其轉(zhuǎn)染骨髓干細(xì)胞后的鑒定，1.主要試劑、儀器和耗材1)細(xì)胞原代培養(yǎng)細(xì)胞、293T(中科院細(xì)胞庫)2)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000(InvitrogenCat.#11668-019)3)穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN4(500ng/ul，第一部分質(zhì)粒構(gòu)建部分中構(gòu)建的攜帶目的基因的穿梭質(zhì)粒)4)慢病毒包裝系統(tǒng)pPACKHl-LentivectorPackagingKit(SBICat.#LV500A-1)5)細(xì)胞及組織總蛋白抽提試劑盒(KangChen，KC-415)6)RNA酶抑制劑(Promega)7)MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)8)5xRT緩沖液(250mMTris隱HCl，pH8.3,200mMKC1，40mMMgC12，5mMDTT)(Promega)9)2.5mMdNTP混合液(dATP，dGTP，dCTP和dTTP各2.5mM)(華美生物工程公司)10)Oligo(dT)18(上海生工生物工程有限公司)11)2.5mMdNTP混合液(dATP,dGTP,dCTP和dTTP各2.5mM)(華美生物工程公司)12)Taq聚合酶(Promega)13)100bpDNALadder(華美生物工程公司)14)10，000xSybergreen(MolecularProbes)15)兔抗HCN4抗體(ADI公司)16)生物安全柜上海凈化設(shè)備有限公司SW-II-A/B317)熒光倒置顯微鏡上海長方CFM-50018)C02培養(yǎng)箱LabotectE540019)濾膜Millex-HV0.45jimPVDFfilters(Millipore，Cat.#SLHVR25LS)20)勻漿器上海康華生化儀器21)低溫離心機(jī)上海安亭科學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠22)FeroTecGradienPCR基因擴(kuò)增儀杭州大和熱磁電子有限公司23)DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀上海琪特分析儀器有限公司24)H6-l微型電泳槽上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠25)Rotor隱Gene3000RealtimePCR儀Corbe"Research26)引物設(shè)計軟件Primer5.027)Rotor-gene6.0:CorbettResearch2、方法和步驟(一)、慢病毒包裝系統(tǒng)(pPACKHl-LentivectorPackagingKit)建立穩(wěn)定表達(dá)HCN4基因的骨髓干細(xì)胞(實驗過程參照SBI的LentivectorExpressionSystem的操作手冊進(jìn)行)，操作流程圖見圖ll。1)假病毒顆粒的包裝(包裝好的假病毒顆粒中含有帶有目的基因的穿梭質(zhì)粒)；a)轉(zhuǎn)染前2-3天，DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染前一天，接種293T細(xì)胞到新的10cm培養(yǎng)皿，接種量約為5x106，完全吹散細(xì)胞，充分混勻，使細(xì)胞均勻分布。轉(zhuǎn)染時，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿的50-70%;b)將2jig(濃度為500ng/jil)帶有目的基因的穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN4同10jig(濃度為500ng/ul)慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔锘旌?，將混合的質(zhì)粒稀釋到750fdopti-MEM培養(yǎng)基中，充分混勻，室溫孵育5分鐘；c)將60filLipofectamine2000TM轉(zhuǎn)染試劑稀釋到750^1Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕地混勻，室溫孵育5分鐘；d)將稀釋的Lipofectamine2000TM試劑逐滴加入到質(zhì)粒-opti-MEM混合液中，輕輕地上下顛倒混勻，室溫孵育20分鐘；e)在第4步孵育形成轉(zhuǎn)染混合物的同時，用10mlOpti-MEM洗293T細(xì)胞一次，然后加入8.5ml含2%血清不含抗生素的D-MEM培養(yǎng)基；f)將第4步中產(chǎn)生的質(zhì)粒-Lipofectamine2000TM混合物加入第5步處理后的培養(yǎng)皿中，輕輕地混勻使轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻分布在培養(yǎng)基中，37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；g)6小時后，用新鮮的含抗生素和2%血清的D-MEM培養(yǎng)基替換掉含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時；h)收集轉(zhuǎn)染后24和48小時的上清液；用含2%血清不含抗生素的D-MEM培養(yǎng)基替換掉上清液；i)注意觀察培養(yǎng)基的顏色，培養(yǎng)24小時后和48小時后，由于293T細(xì)胞的代謝活性，會引起培養(yǎng)基顏色變黃(呈酸性)；j)將含有假病毒顆粒的培養(yǎng)基3000rpm室溫離心5分鐘，去除細(xì)胞碎片，然后將上清用Millex-HV0.45nm的PVDF濾膜過濾；過濾后的病毒液直接感染目的細(xì)胞；注意步驟b)到步驟j)是對有感染性的假病毒顆粒進(jìn)行操作，因此需根據(jù)推薦的符合二級生物安全防護(hù)水平的安全指南進(jìn)行實驗。病毒液可以直接一80'C凍存無需添加冷凍保護(hù)劑，但反復(fù)凍融一次，病毒滴度降低20—30%。轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24小時后的拍攝熒光照片。2)慢病毒感染目的細(xì)胞建立穩(wěn)定表達(dá)AKT1的細(xì)胞a)感染前一天，將原代培養(yǎng)細(xì)胞接種于24孔板中的五個孔，每孔接種105;添力n0.5ml含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，37°C、5XC02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；b)細(xì)胞培養(yǎng)24小時后，進(jìn)行病毒感染實驗；實驗分五組進(jìn)行，先吸去24孔板中舊的培養(yǎng)基，然后i.第一個孔中加入lml含有10%FBS的DMEM;ii.第二個孔中加入0.25ml病毒液和0.75ml含有10%FBS的DMEM;iii.第三個孔中加入0.5ml病毒液和0.5ml含有10%FBS的DMEM;iv.第四個孔中力B入0.75ml病毒液和0.25ml含有10%FBS的DMEM;V.第五個孔中加入lml病毒液；最后各孔中均加入Polybrene，終濃度為12ug/ml;37'C、5XC02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；c)病毒感染12小時后，吸去舊的培養(yǎng)基，加入lml含有10XFBS的D-MEM培養(yǎng)基，37'C、5XC02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；d)病毒感染48小時后，目的細(xì)胞出現(xiàn)熒光，其中加入lml病毒液的實驗組細(xì)胞感染效率達(dá)到90%以上，細(xì)胞可以進(jìn)行傳代擴(kuò)大培養(yǎng)，用于各種細(xì)胞實驗，無需挑選單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)；拍照。將24孔板中的穩(wěn)定細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到足夠量時，收集細(xì)胞RNA和蛋白用于實時定量PCR鑒定和WesternBlot鑒定；其余細(xì)胞做在體實驗。(二)、原代細(xì)胞和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)兩周后行Westernblot鑒定蛋白的表達(dá)蛋引物白抽提方法1)從貼壁細(xì)胞培養(yǎng)瓶中小心傾去培養(yǎng)液。2)預(yù)冷的PBS清洗貼壁的細(xì)胞2次，小心傾去PBS。3)配置含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑(1ml抽提試劑中加入5nl蛋白酶抑制劑混合液，5filPMSF和5pl磷酸酶混合液)。4)細(xì)胞瓶中加入預(yù)冷的含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑(107個細(xì)胞中加入1ml抽提試劑；5x106個細(xì)胞中加入0.5ml抽提試劑)，輕輕搖動5分鐘。5)用一預(yù)冷的橡膠和塑料細(xì)胞刮將培養(yǎng)瓶壁上貼壁細(xì)胞刮下來，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸浮液到離心管中，冰浴下?lián)u動15分鐘進(jìn)行裂解。6)裂解液于預(yù)冷的離心機(jī)中14,000xg離心15分鐘。棄去沉淀，上清液立刻轉(zhuǎn)移入新的離心管中保存待用。使用上清液5ul上樣，凝膠蛋白電泳。(三)、原代細(xì)胞和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)兩周行real-timeRT-PCR實時熒光定量檢測1)RNA抽提TrizolRNA抽提及質(zhì)量檢測方法和步驟a)勻漿轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)兩周后，離心沉淀細(xì)胞。加入1mlTRIZOL試劑，使用勻漿器破碎細(xì)胞使其裂解。注意避免在加入TRIZOL試劑進(jìn)行裂解前清洗細(xì)胞，因為清洗會很可能導(dǎo)致mRNA的降解。b)兩相分離勻漿后樣品于1530。C孵育5分鐘，以便核酸蛋白復(fù)合體完全解離。每1ml的TRIZOL試劑勻漿的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15~30。C孵育2至(J3分鐘。4°C下12,000xg離心l5分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層核上層的無色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的體積大約使勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。c)RNA沉淀將水相轉(zhuǎn)移到新離心管中。水相與異丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入異丙醇的量為每個樣品勻漿時加入1mlTRIZOL試劑的此時加0.5ml的異丙醇?；靹蚝?5~30。C孵育10分鐘后，于4。C12,000xg離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。d)RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL試劑勻漿的樣品中加入至少1ml的75%乙醇，清洗RNA沉淀。振蕩后，4°C7,500xg離心5分鐘。e)重新溶解RNA沉淀去除乙醇溶液，空氣中干燥RNA沉淀5~10分鐘，切勿真空離心干燥。注意RNA沉淀不要完全干燥，否則將大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA樣品A260/280比值將小于1.6。2)RNA質(zhì)量檢測a)紫外吸收測定法取少量液體用TE稀釋(一般1:100稀釋)后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，可以測定RNA溶液濃度和純度。用來稀釋的TE不需要經(jīng)過無RNA酶處理，因為RNA的微量降解不會明顯影響分光光度計的讀值。測量前需先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。i)濃度測定A260下讀值為1表示40jigRNA/ml。樣品RNA濃度(fig/ml)計算公式為A260x稀釋倍數(shù)x40jig/ml。ii)ii)純度檢測RNA溶液的A260/A280的比值是一種RNA純度檢測方法，比值范圍1.8到2.1。b)變性瓊脂糖凝膠電泳i)制膠1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60°C，10ml的10xMOPS電泳緩沖液和18加1的37%甲醛溶液(12.3M)。10xMOPS電泳緩沖液濃度成分0.4MMOPS,pH7.00.1M乙酸鈉0.01MEDTA灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25pl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1xMOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。ii)準(zhǔn)備RNA樣品取3pgRNA,加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10/ml。加熱至70°C孵育15分鐘使樣品變性。iii)電泳上樣于膠孔中，5-6V/cm電壓下電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2-3cm03)以提取的RNA為模板合成cDNA:a)配制退火混合物RNA3jig0.5ug/ulOligo(dT)18ljil加無RNA酶的H20至總體積10pi混合液在7(TC水浴3分鐘，降到37'C放置10分鐘。b)RT反應(yīng)液5xRT緩沖液4pi2.5mMdNTP混合液4jilRNA酶抑制劑1piMMLV反轉(zhuǎn)錄酶1Jll混合后37'C恒溫1分鐘c)力t]10pl的RT反應(yīng)液到10pl退火混合物中，37。C水浴60分鐘，加熱到95。C維持5min。得RT終溶液即為cDNA溶液，置冰浴待用。4)合成的cDNA用于實時定量PCRa)制備用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的梯度稀釋DNA模板i)針對每一需要測量的基因和管家基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)dNTP(2.5mMeach)2.5^110xPCR緩沖液2.5jilMgC12溶液1.5plTaq聚合酶lunits10uM的PCR特異引物Flpl10uM的PCR特異引物R1^1cDNA1pl加水至總體積為25^1輕彈管底將溶液混合，40個PCR循環(huán)(94°C，20秒；退火溫度，20秒；72'C，30秒)；72。C延伸5分鐘。ii)PCR產(chǎn)物與100bpDNALadder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。iii)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行IO倍梯度稀釋設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1，分別稀釋為1x10-1，1x10-2，1x10-3，1x10-4，1x10-5，1x10-6，1x10-7這幾個梯度濃度的DNA。5)進(jìn)行RealtimePCR反應(yīng)a)幾個梯度稀釋的DNA模板以及所有cDNA樣品分別配置RealtimePCR反應(yīng)體系。體系配置如下dNTP(2.5mMeach)2.5^1lOxpCR緩沖液2.5MgC12溶液Taq聚合酶SybergreenI10uM的PCR特異引物F10uM的PCR特異引物RcDNAorDNA加水至總體積為1.5^illunits終濃度0.25x1pi25pi輕彈管底將溶液混合，5000rpm短暫離心。b)步驟1配置的PCR反應(yīng)溶液置于RealtimePCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。GAPDH:95°C,5min;35個PCR循環(huán)(95。C，10秒；58°C，15秒；72°C，20秒；85°C(收集熒光)，5秒)。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72'C緩慢加熱到99°C(每5秒升高l'C)HCN4:95°C，5min;35個PCR循環(huán)(95°C，10秒；58°C，15秒；72°C，20秒；85'C(收集熒光)，5秒)。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72'C緩慢加熱到99°C(每5秒升高TC)。表1實時定量PCR使用引物列表基因名雙向引物序列退火溫度(。C)產(chǎn)物長度(bp)GAPDHHCN4F5'AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC3'R5'TCCACCACCCTGTTGCTGTA3'F5'CCCGCCTCATTCGATATATTCAC3'R5CAGCTGGGTGTGTTGGTCTCAT3'5820358212三、結(jié)果1、將帶有目的基因的穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN4同慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔锘旌虾蟾腥?93T細(xì)胞后，培養(yǎng)24小時，可以發(fā)現(xiàn)大量的熒光出現(xiàn)(如圖5所示)。2.使用慢病毒包裝系統(tǒng)(pPACKHl-LentivectorPackagingKit)和帶有目的基因的穿梭質(zhì)粒pCDHl混合以Lipofectamine2000作為感染試劑感染豬的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，加入lml病毒液的實驗組細(xì)胞感染效率可以達(dá)到90%以上，病毒感染48小時后，目的細(xì)胞出現(xiàn)大量的熒光(如圖6所示)。3.提取蛋白后進(jìn)行Westernblot的蛋白鑒定結(jié)果如圖7和圖8所示，蛋白電泳灰度值如下表所示表2Westernblot蛋白電泳灰度值表<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>4.HCN4real-timePCR實時定量檢測中的RNA的濃度、純度測定結(jié)果讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，A260下讀值為1表示40^gRNA/ml。樣品RNA濃度(jig/ml)計算公式為A260x稀釋倍數(shù)x40pg/ml。表3RNA純度檢測結(jié)果表<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>RNA溶液的A260/A280的比值是一種RNA純度檢測方法，比值范圍1.8到2.1。我們的結(jié)果顯示OD260/OD280的比值在2左右，符合要求。但是即使比值超出這個范圍，RNA樣品也一樣可以用于一些普通實驗中如Northern雜交，RT-PCR和RNA酶保護(hù)實驗。RNA的電泳結(jié)果顯示28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小取決于用于抽提RNA的物種類型)，上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還能觀察到一個更小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成。在18S和28S核糖體帶之間一般可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行RealtimePCR反應(yīng)。根據(jù)繪制的梯度稀釋DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，各樣品目的基因和管家基因的濃度結(jié)果直接由機(jī)器生成。每個樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對定量(見附件圖2-6)此方法中量的表達(dá)是相對于某個參照物的量而言的，對于所用的標(biāo)準(zhǔn)品只要知道其相對稀釋度即可。在整個實驗中樣本的靶序列的量來自于標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終必須除以參照物(對照組)的量，即參照物(對照組)是1倍的樣本，其它的樣本為參照物量的n倍。實時定量PCR時各樣品加樣量均為1fU，然而由于受RNA濃度定量誤差和RNA逆轉(zhuǎn)錄效率誤差等的影響，每個樣品的1pl體積的cDNA其含量并不完全相同，為校正此差異，我們使用管家基因GAPDH(不同樣品間表達(dá)量基本恒定)作為內(nèi)參，以樣品待測基因得值除以此樣品內(nèi)參得值，最終得到的比值為樣品的待測基因相對含量。待測基因以內(nèi)參校正。結(jié)果顯示穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的RNA是原代細(xì)胞的120.88倍。表2-4內(nèi)參校正列表(Neg:原代細(xì)胞；W:穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>HCN4real-timeRT-PCR實時定量檢測結(jié)果如圖10所示。慢病毒具有既可以感染分裂細(xì)胞又可以感染非分裂細(xì)胞；其病毒基因組可以整合于宿主基因組中，長時間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因并具有較低的免疫原性等優(yōu)點，其可能是基因治療的最佳載體，本發(fā)明把帶有起搏基因HCN4的片段重組到慢病毒中，進(jìn)而再轉(zhuǎn)到干細(xì)胞中，以增加起搏細(xì)胞的起搏電流(If)來治療慢性心律失常。因此，構(gòu)建起搏通道基因亞型HCN重組慢病毒載體是研究HCN基因、起搏電流的特性以及生物起搏等的前提和基礎(chǔ)。權(quán)利要求1.一種起搏通道基因亞型HCN4重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，包括將帶有HCN4基因的穿梭質(zhì)粒與病毒系統(tǒng)一起建立HCN4重組病毒載體，其特征在于所述穿梭質(zhì)粒為pCDH1-GFP-HCN4，所述病毒為慢病毒。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的起搏通道基因亞型HCN4重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于所述穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN4的獲得包括以下步驟(1)將目的片段HCN4基因從pcDNA3-HCN4中切下，連接入Pucl9質(zhì)粒中，獲得Pucl9-HNC4質(zhì)粒；(2)將目的片段HCN4基因從Pucl9-HNC4中切下，連接入pcDNA3.1A質(zhì)粒中，獲得pcDNA3.1A-HNC4質(zhì)粒；(3)將目的片段HCN4基因從pcDNA3.1A-HNC4中切下，連接入pCDHl-MCSl-EFl-copGFP質(zhì)粒中，獲得穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN4。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的起搏通道基因亞型HCN4重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于所述構(gòu)建方法還包括將穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN4與慢病毒系統(tǒng)混合重組后的HCN4慢病毒載體包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，獲得病毒液；對病毒液進(jìn)行病毒滴度測定，并進(jìn)行濃縮和純化得到高質(zhì)量的病毒液。全文摘要本發(fā)明公開了一種起搏通道基因亞型HCN4重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，包括將帶有HCN4基因的穿梭質(zhì)粒與病毒系統(tǒng)一起建立HCN4重組病毒載體，所述穿梭質(zhì)粒為pCDH1-GFP-HCN4，所述病毒為慢病毒。本發(fā)明將帶有HCN4基因的穿梭質(zhì)粒pCDH1-GFP-HCN4與慢病毒一起建立HCN4重組病毒載體，慢病毒具有既可以感染分裂細(xì)胞又可以感染非分裂細(xì)胞；其病毒基因組可以整合于宿主基因組中，長時間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因并具有較低的免疫原性等優(yōu)點，其可能是基因治療的最佳載體，因此構(gòu)建起搏通道基因亞型HCN重組慢病毒載體可能成為慢性心律失常的細(xì)胞治療和基因治療的基礎(chǔ)。文檔編號C12N15/867GK101173301SQ20071019040公開日2008年5月7日申請日期2007年11月21日優(yōu)先權(quán)日2007年11月21日發(fā)明者周亞峰,李紅霞,楊向軍,蔣文平,韓蓮花申請人:蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院