專利名稱:利用海洋細(xì)菌光-暗耦聯(lián)制氫的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種利用海洋細(xì)菌光-暗耦聯(lián)制氫的方法。
背景技術(shù)：
生物制氫是利用某些微生物代謝過程來生產(chǎn)氫氣的一項(xiàng)生物工程技術(shù)，具有其他 方法所沒有的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)①工藝條件溫和，通常在常溫常壓下進(jìn)行；②不產(chǎn)生硫化物、煙塵 以及難降解的有機(jī)廢水；③所產(chǎn)生的氣體只包括氫氣、二氧化碳、水蒸氣，不需要脫硫、除 塵，氫氣分離純化工藝簡(jiǎn)單；④能利用可再生能源，并可進(jìn)行廢物利用，在生產(chǎn)氫能的同時(shí) 達(dá)到環(huán)境治理與廢物利用的目的，具有廣闊的應(yīng)用前景。
產(chǎn)氫微生物研究起步比較晚，目前國際上大量的研究是針對(duì)陸地淡水產(chǎn)氫菌株，
對(duì)于海洋產(chǎn)氫菌株的研究報(bào)道較少。對(duì)于海洋資源開發(fā)和利用普遍重視的今天，發(fā)展和利
用海洋資源進(jìn)行微生物制氫具有現(xiàn)實(shí)意義。
暗發(fā)酵細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氫理論化學(xué)方程式為
C6H1206+2H20 — 4H2+2C2H402 (乙酸)+2C02
光合細(xì)菌利用乙酸產(chǎn)氫的理論化學(xué)方程式為
2C2H402 (乙酸)+4H20 — 8H2+4C02
由上面兩個(gè)關(guān)系式可見光合細(xì)菌和暗發(fā)酵細(xì)菌聯(lián)合制氫理論上為
C6H1206+6H20 — 12H2+6C02
因此，光合細(xì)菌與發(fā)酵性細(xì)菌混合培養(yǎng)，就有可能實(shí)現(xiàn)有機(jī)物完全降解并持續(xù)產(chǎn)
氫，提高光能轉(zhuǎn)換效率和底物的利用效率，降低揮發(fā)酸對(duì)細(xì)菌的毒性，提高產(chǎn)氫量。
通過檢索，發(fā)現(xiàn)一篇與本專利申請(qǐng)相關(guān)的對(duì)比技術(shù)，其名稱為利用海水養(yǎng)殖場(chǎng)污
泥和污水培養(yǎng)海洋光合細(xì)菌光-暗發(fā)酵耦聯(lián)制氫的方法，公開號(hào)CN1011307S6。該方法首
先利用海水養(yǎng)殖中產(chǎn)生的富含有機(jī)質(zhì)的污水和污泥等作為放氫培養(yǎng)基進(jìn)行暗培養(yǎng)產(chǎn)氫，然
后進(jìn)行光培養(yǎng)產(chǎn)氫，最后將暗培養(yǎng)放氫后的培養(yǎng)基中加入光發(fā)酵細(xì)菌進(jìn)行耦聯(lián)產(chǎn)氫，以提
高氫氣的釋放量，從而恢復(fù)海洋暗發(fā)酵產(chǎn)氫菌的產(chǎn)氫活性。因此，該發(fā)明是利用暗發(fā)酵細(xì)菌
制氫，產(chǎn)氫結(jié)束后底物還沒有利用完，在把發(fā)酵細(xì)菌除去之后又把PH值調(diào)到光合細(xì)菌適合
生長的范圍然后再加入光合細(xì)菌，實(shí)際上就是說光合細(xì)菌可以利用發(fā)酵細(xì)菌產(chǎn)物制氫，兩
種菌是分開生長的，產(chǎn)氫效率較低，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值受到一定限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種利用海洋細(xì)菌光_暗耦聯(lián) 制氫的方法；該方法在暗發(fā)酵細(xì)菌菌液中加入光合細(xì)菌菌群，可充分分解有機(jī)物，提高產(chǎn)氫 效率。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的
—種利用海洋細(xì)菌光_暗耦聯(lián)制氫的方法，其步驟是
(l)菌株篩選[0016] 將潮間表層帶污泥及底層帶污泥分別加入到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到菌群，再進(jìn)一步 經(jīng)富集、分離純化、鏡檢，分別得到光合細(xì)菌和暗發(fā)酵細(xì)菌的純菌株； (2)耦聯(lián)制氫
將上述得到的光合細(xì)菌和暗發(fā)酵細(xì)菌的純菌株按比例同時(shí)加入LM培養(yǎng)基中，充 氮?dú)庵脫Q上層空氣，將菌液置于搖床中，振蕩培養(yǎng)制氫。
而且，所述光合細(xì)菌和暗發(fā)酵細(xì)菌純菌株的混合比例為1 : 1-30 : 1。
而且，所述將菌液置于搖床中振蕩培養(yǎng)的條件為溫度37t:、光強(qiáng)40001ux、轉(zhuǎn)速
150rpm。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是
1、本發(fā)明選用從潮間帶底泥中篩選到的菌種海洋暗發(fā)酵細(xì)菌與海洋光合細(xì)菌耦 聯(lián)制氫，將兩類細(xì)菌按光合細(xì)菌多于暗發(fā)酵細(xì)菌的不同比例同時(shí)接入到培養(yǎng)基中，二者協(xié) 同作用，可以極大地提高產(chǎn)氫效率，比單種細(xì)菌產(chǎn)氫效率提高10倍左右，且不用除菌和調(diào) pH值，在生物制氫和污水處理方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
2、本發(fā)明適用于高鹽度有機(jī)廢水和海洋養(yǎng)殖廢水的處理，在污水處理的同時(shí)得到 清潔能源——?dú)錃?，也可以作為陸地環(huán)境中各種不同鹽度有機(jī)廢水的處理與生物制氫的方 法。


圖1為本發(fā)明BH-18的系統(tǒng)進(jìn)化樹；
圖2為本發(fā)明LC83序列系統(tǒng)進(jìn)化樹；
圖3為本發(fā)明在有氧條件下NaCl濃度對(duì)P. agglomerans BH-18生長狀態(tài)的影響； 圖4為本發(fā)明在有氧條件下NaCl濃度對(duì)Marichromatium sp. LC83生長狀態(tài)的影 響；
圖5為本發(fā)明光合細(xì)菌和暗發(fā)酵細(xì)菌同時(shí)接入培養(yǎng)基的產(chǎn)氫量和葡萄糖利用率 柱狀圖；
圖6本發(fā)明在暗發(fā)酵細(xì)菌發(fā)酵8小時(shí)后接入光合細(xì)菌的產(chǎn)氫量和葡萄糖利用率柱 狀圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，
不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1 :
—種利用海洋細(xì)菌光_暗耦聯(lián)制氫的方法，其步驟是
從北海市紅樹林潮間帶取底層污泥，命名為BH，從青島第一海水浴場(chǎng)潮間帶取表 層污泥，命名為LC，采樣后密封置于4t:保存。取少量樣品BH接種于有100ml LM培養(yǎng)基的 250ml血清瓶中，用橡膠塞蓋緊，充氮?dú)?0s置換上層空氣，創(chuàng)造厭氧或微好氧環(huán)境，置于搖 床中37t:振蕩培養(yǎng)24h。將樣品LC接種于有100ml RCVBN培養(yǎng)基的250ml血清瓶中，充氬 氣60s置換上層空氣，創(chuàng)造厭氧或微好氧環(huán)境，置于30°C、2000 80001ux的光照培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)3到5天。分別取lml培養(yǎng)物加入到各自新鮮的100ml培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)。上述步驟重復(fù)3次，以達(dá)到富集產(chǎn)氫微生物的目的。(5)將富集的培養(yǎng)物稀釋為10—、10一2， 10—3， 10—4， 10—5， 10—6， 10—7， 10—8， 10—9和10—"的菌液，取合適的濃度在固體培養(yǎng)基中(暗發(fā)酵細(xì) 菌為LM，光合細(xì)菌為Molish)劃線，5min后再倒一層固體培養(yǎng)基或瓊脂，冷凝后再倒一層固 體石蠟，達(dá)到密閉效果，再放至兩種菌各自相應(yīng)的條件下培養(yǎng)。由此可以獲得由單一細(xì)菌生 長而來的菌落。(6)挑取形態(tài)和顏色單一的菌落至裝有液體培養(yǎng)基的螺口管中，進(jìn)行富集擴(kuò) 增，將螺口管倒置，觀察產(chǎn)氣高度，選取產(chǎn)氣量較大的試管進(jìn)行編號(hào)，進(jìn)行再一次的分離純 化。上述操作重復(fù)進(jìn)行，直至固體培養(yǎng)基上的菌落和普通光學(xué)顯微鏡下菌體細(xì)胞形態(tài)一致 為止。 一般采用"固體_液體"法培養(yǎng)細(xì)菌，反復(fù)操作3 5次即可。
利用分子生物學(xué)方法，測(cè)定了上述兩種細(xì)菌的16S rDNA序列并提交GenBank， 通過Blast進(jìn)行同源性分析，采用Clustal x軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化 樹(如圖1、圖2)分析表明，海洋暗發(fā)酵細(xì)菌屬于成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)， 命名為P. agglomerans BH-18 ;海洋光合細(xì)菌屬于Proteobacteria (變形菌門)， Gammaproteobacteria ( Y _變形菌纟岡)，Chromatiales (著色菌目)，Chromatiaceae (著色 菌禾斗)，Marichromatium屬，命名為Marichromatium sp. 1X83。
分別對(duì)兩種細(xì)菌進(jìn)行耐鹽實(shí)驗(yàn)，調(diào)整培養(yǎng)基中的NaCl的終濃度，使其濃度分別為 0%。、10%。、30%。、50%。、70%。，在30 37°C (光合細(xì)菌在光強(qiáng)5000Lux左右)、接種量在10% 的培養(yǎng)條件下，每隔一段時(shí)間測(cè)定其細(xì)胞的生長量。結(jié)果表明菌株P(guān). agglomerans BH-18 在鹽度為0 70%。的條件下都可生長(如圖3);菌株Marichromatium sp. LC83在鹽度為 10 70%。的條件下可以生長(如圖4)。
配制3份LM培養(yǎng)基(起始pH為9)各100ml，裝入有翻口橡膠塞的250ml血清瓶 中，112.6t:滅菌15min后，在無菌操作臺(tái)中對(duì)其中1瓶加入lml暗發(fā)酵細(xì)菌BH-18 (0D600 =1.6065)，1瓶加入lml光合細(xì)菌LC83 (0D660 = 1.6018)，1瓶加入lml暗發(fā)酵細(xì)菌 BH-18(0D600 = 1.6065)和lml光合細(xì)菌LC83 (0D660 = 1. 6018)，蓋好塞子，充氮?dú)庵脫Q 上層空氣。將菌液置于搖床中，在37t:、40001ux、轉(zhuǎn)速150rpm條件下振蕩培養(yǎng)，集氣采用 排水法，在產(chǎn)氣開始和結(jié)束時(shí)分別用5ml注射器取樣，分析菌液中葡萄糖含量，待產(chǎn)氣結(jié)束 后，將所收集的氣體用氣象色譜儀分析其氫含量。結(jié)果表明純光合細(xì)菌LC83產(chǎn)氫量為 3ml/dl，葡萄糖利用率為25.9% ;純暗發(fā)酵細(xì)菌BH-18產(chǎn)氫量為40ml/dl葡萄糖利用率為 76. 5% ;光/暗為1/1的產(chǎn)氫量為52ml/dl，葡萄糖利用率為99. 4% (如圖5)。分析表明，
光_暗耦聯(lián)后可提高產(chǎn)氫量，擴(kuò)大底物利用率。
實(shí)施例2 :
其他操作和實(shí)例1相同，區(qū)別為配制3份培養(yǎng)基，每瓶100ml培養(yǎng)基中分別加暗發(fā) 酵細(xì)菌BH-18(0De。。 = 1. 6065) lml和光合細(xì)菌LC83(0D66。 = 1. 6018) 10ml、20ml、30ml。結(jié) 果表明，光/暗為10/1 、20/1 、30/1的產(chǎn)氫量分別為84ml/dl、78ml/dl、 157ml/dl，葡萄糖利 用率分別為99. 3%、99. 2%、98. 7% (如圖5)。
實(shí)施例3 :
其他操作和實(shí)例1相同，區(qū)別為配制2份培養(yǎng)基，每瓶100ml培養(yǎng)基中加暗發(fā)酵細(xì) 菌BH-18(0D, = 1. 6065) lml，在與實(shí)例1相同條件下培養(yǎng)8小時(shí)后用注射器分別加入光合 細(xì)菌LC83(0D,二 1.6018)4ml和8ml。結(jié)果表明，光/暗為4/1、8/1的產(chǎn)氫量分別為96m1/ dl和125ml/dl，葡萄糖利用率分別為99. 24%和99. 21% (如圖6)。[0041] 本發(fā)明的工作機(jī)理
由于不同細(xì)菌利用有機(jī)物的高度特異性，其所能分解的有機(jī)物的成分相差很大。 一方面，暗發(fā)酵細(xì)菌具有很高的降解大分子有機(jī)物的能力，光合細(xì)菌分解大分子有機(jī)物的 能力不強(qiáng)，但是它們能分解發(fā)酵菌分解后剩下的小分子有機(jī)物，而采用兩者混合培養(yǎng)可以 充分利用有機(jī)質(zhì)，提高產(chǎn)氫量；另一方面，發(fā)酵菌在發(fā)酵產(chǎn)氫的過程中會(huì)放出大量的有機(jī)酸 等使培養(yǎng)環(huán)境中的PH下降，偏離了發(fā)酵菌的最適生長條件，從而使H2產(chǎn)量下降。光合細(xì)菌 可以分解這些小分子有機(jī)酸，使培養(yǎng)環(huán)境中的pH保持恒定。把這兩種微生物聯(lián)合培養(yǎng)有利 于提高底物的利用率和產(chǎn)氫量，同時(shí)可進(jìn)一步處理廢水，在生物制氫和污水處理方面有重 要意義。
權(quán)利要求
一種利用海洋細(xì)菌光-暗耦聯(lián)制氫的方法，其特征在于其步驟是(1)菌株篩選將潮間表層帶污泥及底層帶污泥分別加入到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到菌群，再進(jìn)一步經(jīng)富集、分離純化、鏡檢，分別得到光合細(xì)菌和暗發(fā)酵細(xì)菌的純菌株；(2)耦聯(lián)制氫將上述得到的光合細(xì)菌和暗發(fā)酵細(xì)菌的純菌株按比例同時(shí)加入LM培養(yǎng)基中，充氮?dú)庵脫Q上層空氣，將菌液置于搖床中，振蕩培養(yǎng)制氫。
2. 根據(jù)權(quán)利要求
1所述的利用海洋細(xì)菌光_暗耦聯(lián)制氫的方法，其特征在于所述光 合細(xì)菌和暗發(fā)酵細(xì)菌純菌株的混合比例為1 : 1-30 : 1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求
1所述的利用海洋細(xì)菌光_暗耦聯(lián)制氫的方法，其特征在于所述將菌液置于搖床中振蕩培養(yǎng)的條件為溫度37t:、光強(qiáng)40001ux、轉(zhuǎn)速150rpm。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種利用海洋細(xì)菌光-暗耦聯(lián)制氫的方法，其步驟是(1)將潮間表層帶污泥及底層帶污泥分別加入到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到菌群，再進(jìn)一步經(jīng)富集、分離純化、鏡檢，分別得到光合細(xì)菌和暗發(fā)酵細(xì)菌的純菌株；(2)將上述得到的光合細(xì)菌和暗發(fā)酵細(xì)菌的純菌株按比例同時(shí)加入LM培養(yǎng)基中，充氮?dú)庵脫Q上層空氣，將菌液置于搖床中，振蕩培養(yǎng)制氫。本發(fā)明選用從潮間帶底泥中篩選到的菌種海洋暗發(fā)酵細(xì)菌與海洋光合細(xì)菌，將兩類細(xì)菌按光合細(xì)菌多于暗發(fā)酵細(xì)菌的不同比例同時(shí)接入到培養(yǎng)基中，二者協(xié)同作用，可以極大地提高產(chǎn)氫效率，比單種細(xì)菌產(chǎn)氫效率提高10倍左右，且不用除菌和調(diào)pH值，在生物制氫和污水處理方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值，也可以作為陸地環(huán)境中各種不同鹽度有機(jī)廢水的處理與生物制氫。
文檔編號(hào)C12R1/01GKCN101717809SQ200910245106
公開日2010年6月2日 申請(qǐng)日期2009年12月25日
發(fā)明者才金玲, 朱大玲, 李延川, 潘光華, 王廣策, 高廣琦 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan