快速鑒定紅錐的pcr檢測方法及其引物對的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速鑒定紅錐的PCR檢測方法及其引物對，發(fā)明人開發(fā)了一對紅錐鑒定引物cc1和cc2。采用該引物對對紅錐總DNA進行PCR擴增,電泳檢查擴增結(jié)果，若得到陽性擴增，則供試品為紅錐，否則不是紅錐。由于聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)成熟，所以該法具有較高的準確性；而且整個檢測便捷、快速，實驗時間不超過6個小時。因此，應(yīng)用本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)高效、準確地鑒別紅錐。
【專利說明】快速鑒定紅錐的PCR檢測方法及其引物對
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于林業(yè)科學(xué)中分子標記鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種快速鑒定紅錐的PCR檢測方法及其引物對。
【背景技術(shù)】
[0002]紅維(Castanopsishystrix)為殼斗科(Fagaceae)栲屬(Castanopsis)常綠喬木，是華南地區(qū)重要的鄉(xiāng)土闊葉、優(yōu)質(zhì)珍貴用材樹種。它生長快、適應(yīng)廣、效益高，可用做建筑、造船、高檔家具等；萌芽力強，枝葉濃密，較耐蔭蔽，混生性能好，可純林種植，亦可混交造林，是針葉樹種混交造林的最理想的伴生樹種之一；紅錐對生境適應(yīng)能力強，在群落中位于喬木層，為優(yōu)勢種，對于維持群落穩(wěn)定具有重要作用，特別適宜人工營造用材林和水源涵養(yǎng)林。由于紅錐木材非常珍貴，近些年遭到了大量采伐，其天然林遭受了嚴重破壞。
[0003]紅維與其近緣種白椎(Castanopsiscarlesii Hayata)、越南白椎(Castanopsistonkinensis)之間很難從形態(tài)上區(qū)分開來。為有效開發(fā)利用該樹種，防止在選育、繁育和利用時與近緣種發(fā)生混淆，迫切需要一種快速鑒定紅錐的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種高效、準確的快速鑒定紅錐的PCR檢測方法及其引物對。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:快速鑒定紅錐的PCR檢測方法的引物對，包括引物ccl和引物cc2，它們分別具有序列表SEQ.1D.N0.1和SEQ.1D.N0.2的
堿基序列。
[0006]快速鑒 定紅錐的PCR檢測方法，采用引物ccl和引物cc2對紅錐總DNA進行PCR擴增，電泳檢查擴增結(jié)果；若用鑒定引物得到陽性擴增，則供試品為紅錐。
[0007]上述快速鑒定紅錐的PCR檢測方法，包括以下步驟:
[0008]<1>提取紅錐總DNA
[0009]摘取健康、干凈的葉片I~10片(要求葉片無病斑、無枯萎現(xiàn)象，幼嫩葉片效果更佳)，用液氮處理葉片后進行研磨，采用植物基因組DNA提取試劑盒進行總DNA的提取獲得基因組DNA模板，稀釋為50~80ng/ μ L，放置于冰箱_20°C保存?zhèn)溆茫?br> [0010]<2>PCR 擴增
[0011]反應(yīng)體系:25yL體系中含約 60ng 模板 DNA，1.25U Taq 酶，1.5mmol.L1MgCl2,0.2 Smmol.L 1ClNTPs,引物 ccl 和引物 cc2 各 0.15 μ mo I.L1。
[0012]擴增條件:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性 lmin，52°C復(fù)性 45s，72°C延伸 2min，35 ~39個循環(huán)；最后72°C延伸5min ；
[0013]<3>電泳檢查
[0014]PCR產(chǎn)物在含有GelRed的2%瓊脂糖凝膠中電泳，以IOObp Marker作為標準分子量對照，紫外自動成像儀照相。[0015]判斷標準:若該樣品為紅錐，則可得到長度為340bp的擴增條帶；若樣品不是紅錐，則檢測不到擴增條帶。
[0016]針對目前缺乏紅錐快速有效鑒定方法的問題，發(fā)明人開發(fā)了一對紅錐鑒定引物ccl和cc2。采用該引物對對紅錐總DNA進行PCR擴增，電泳檢查擴增結(jié)果，若得到陽性擴增，則供試品為紅錐，否則不是紅錐。由于聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)成熟，所以該法具有較高的準確性；而且整個檢測便捷、快速，實驗時間不超過6個小時。因此，應(yīng)用本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)高效、準確地鑒別紅錐。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是實施例1電泳檢查結(jié)果圖。
[0018]圖2是實施例2電泳檢查結(jié)果圖。
[0019]圖3是實施例3電泳檢查結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0020]以下實施例所用鑒定引物cc I (5’ -gacagacagacagacagttc-3’)和 cc2(5’-gacaga cagacagacaactg-3’)采用全自動DNA合成儀合成而得。引物為白色粉末結(jié)晶，采用純凈水將引物溶解至終濃度IOOymol.L—1，震蕩混勻后，放置于冰箱-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0021]實施例1
[0022]< I >提取樣品總DNA
[0023]摘取健康、干凈的葉片I片(疑似紅錐樣品，來源于廣西林科院樹木園)，用液氮處理葉片后進行研磨，采用植物基因組DNA提取試劑盒(天根生物)進行總DNA的提取獲得純度符合要求的基因組DNA模板，稀釋為50ng/ μ L，放置于冰箱_20°C保存?zhèn)溆茫?br> [0024]<2>PCR 擴增
[0025]反應(yīng)體系:25μ L 體系中含約 60ng 模板 DNA, 1.25U Taq 酶，1.5mmol.T1MgCl2,0.2 Smmol.L 1ClNTPs,引物 ccl 和引物 cc2 各 0.15 μ mo I.L1。
[0026]擴增條件:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性 lmin，52°C復(fù)性 45s，72°C延伸 2min，35 個循環(huán)；最后72°C延伸5min;
[0027]<3>電泳檢查
[0028]PCR產(chǎn)物在含有GelRed的2%瓊脂糖凝膠中電泳，以IOObp Marker (GeneRulerlOOladder, Fermentas UAB, Inc.)作為標準分子量對照，EPSON (Japan)紫外自動成像儀照相(見圖1)。
[0029]結(jié)論:擴增出一條電泳條帶,大小介于400bp~500bp之間,表明該樣品是紅錐。
[0030]實施例2
[0031 ] 〈 I >提取樣品總DNA
[0032]摘取健康、干凈的葉片5片(疑似紅錐樣品，來源廣西林科院樹木園)，用液氮處理葉片后進行研磨，采用植物基因組DNA提取試劑盒(天根生物)進行總DNA的提取獲得純度符合要求的基因組DNA模板，稀釋為65ng/ μ L，放置于冰箱_20°C保存?zhèn)溆茫?br> [0033]<2>PCR 擴增
[0034]反應(yīng)體系:25μ L 體系中含約 60ng 模板 DNA, 1.25U Taq 酶，1.5mmol.T1MgCl2,0.25mmol.L MNTPs,引物 ccl 和引物 cc2 各 0.15 μ mo I.L1。
[0035]擴增條件:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性 lmin，52°C復(fù)性 45s，72°C延伸 2min，37 個循環(huán)；最后72°C延伸5min;
[0036]<3>電泳檢查
[0037]PCR產(chǎn)物在含有GelRed的2%瓊脂糖凝膠中電泳，以IOObp Marker (GeneRulerlOOladder, Fermentas UAB, Inc.)作為標準分子量對照，EPSON (Japan)紫外自動成像儀照相(見圖2)。
[0038]結(jié)論:沒有擴增出電泳條帶，則該樣品不為紅錐。從葉片形態(tài)上觀察，葉片較紅錐葉片稍偏大，有可能為白椎。
[0039]實施例3
[0040]< I >提取樣品總DNA
[0041]摘取健康、干凈的葉片10片(疑似紅錐樣品，采集于海南尖峰嶺自然保護區(qū))，用液氮處理葉片后進行研磨，采用植物基因組DNA提取試劑盒(天根生物)進行總DNA的提取獲得純度符合要求的基因組DNA模板，稀釋為SOng/μ L，放置于冰箱_20°C保存?zhèn)溆茫?br> [0042]<2>PCR 擴增
[0043]反應(yīng)體系:25μ L 體系中含約 60ng 模板 DNA, 1.25U Taq 酶，1.5mmol.T1MgCl2,0.2 Smmol.L 1ClNTPs,引物 ccl 和引物 cc2 各 0.15 μ mo I.L1。
[0044]擴增條件:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性 lmin，52°C復(fù)性 45s，72°C延伸 2min，39 個循環(huán)；最后72°C延伸5min;`
[0045]<3>電泳檢查
[0046]PCR產(chǎn)物在含有GelRed的2%瓊脂糖凝膠中電泳，以IOObp Marker (GeneRulerlOOladder, Fermentas UAB, Inc.)作為標準分子量對照，EPSON (Japan)紫外自動成像儀照相(見圖3)。
[0047]結(jié)論:沒有擴增出電泳條帶，則該樣品不為紅錐。從葉片形態(tài)上觀察，葉片較紅錐葉片明顯偏大，有可能為越南白椎。
【權(quán)利要求】
1.一種快速鑒定紅錐的PCR檢測方法的引物對，其特征在于包括引物CCI和引物CC2，它們分別具有序列表SEQ.1D.N0.1和SEQ.1D.N0.2的喊基序列。
2.一種快速鑒定紅錐的PCR檢測方法，其特征在于采用引物ccl和引物cc2對紅錐總DNA進行PCR擴增，電泳檢查擴增結(jié)果。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速鑒定紅錐的PCR檢測方法，其特征在于包括以下步驟: <1>提取紅錐總DNA 摘取健康、干凈的葉片I~10片，用液氮處理葉片后進行研磨，采用植物基因組DNA提取試劑盒進行總DNA的提取獲得基因組DNA模板，稀釋為50~SOng/ μ L，放置于冰箱_20°C保存?zhèn)溆茫? <2>PCR擴增 反應(yīng)體系:25 μ L 體系中含 60ng 模板 DNA，1.25U Taq 酶，1.5mmol.T1MgCl2,`0.2 Smmol.L 1ClNTPs,引物 ccl 和引物 cc2 各 0.15 μ mo I.L1。 擴增條件:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性lmin，52°C復(fù)性45s，72°C延伸2min，35~39個循環(huán)；最后72°C延伸5min ； <3>電泳檢查 PCR產(chǎn)物在含有GelRed的2%瓊脂糖凝膠中電泳，以IOObp Marker作為標準分子量對照，紫外自動成像儀照相。
【文檔編號】C12Q1/68GK103757119SQ201410029308
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月22日
【發(fā)明者】劉海龍, 蔡玲, 朱積余, 韋穎文, 黃金使, 覃玉鳳, 曾永明 申請人:廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院