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分泌性免疫球蛋白復(fù)合物的制作方法

文檔序號(hào):467434閱讀:2533來(lái)源:國(guó)知局
分泌性免疫球蛋白復(fù)合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種以為非人分泌物來(lái)源的分泌性免疫球蛋白為基礎(chǔ)的免疫復(fù)合物制劑的生產(chǎn)方法,所述方法包括-提供工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)體系,能夠生產(chǎn)N-糖基化分泌成分,-通過(guò)此類體系生產(chǎn)分泌成分,所述分泌成分包括相對(duì)于每摩爾分泌成分的至少0.01mol的非核心巖藻糖,和-將所述分泌成分與具有天然糖基化模式的IgA或IgM免疫球蛋白的至少之一相結(jié)合,從而獲得免疫復(fù)合物。本發(fā)明提供包括氨基酸序列SEQ ID 1或其功能性活性變體的分離的重組分泌成分,所述分離的重組分泌成分具有路易斯型N糖基化模式和相對(duì)于每摩爾分泌成分的至少2mol非核心巖藻糖;還提供一種以源自除人分泌物以外來(lái)源的分泌性免疫球蛋白為基礎(chǔ)的免疫復(fù)合物制劑,其包括-分泌成分,所述分泌成分具有路易斯型N糖基化模式和相對(duì)于每摩爾分泌成分的至少0.01mol非核心巖藻糖,和-具有天然糖基化模式的IgA或IgM免疫球蛋白的至少之一。
【專利說(shuō)明】分泌性免疫球蛋白復(fù)合物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生產(chǎn)以不源自人乳的分泌性免疫球蛋白為基礎(chǔ)的免疫復(fù)合物制劑 (preparation)的方法、免疫復(fù)合物制劑和重組分泌成分。

【背景技術(shù)】
[0002] 分泌成分(Secretory Component, SC)為分泌性免疫球蛋白(SIgA和SIgM)的成 分,包括多聚免疫球蛋白受體(PlgR)的胞外部分。多聚IgA和IgM通過(guò)J鏈介導(dǎo)而在上皮 細(xì)胞的基底外側(cè)面上結(jié)合至多聚免疫球蛋白受體,并且經(jīng)胞轉(zhuǎn)(transcytosis)吸收至細(xì) 胞中。受體-免疫球蛋白復(fù)合物在分泌至上皮細(xì)胞腔表面上之前穿過(guò)細(xì)胞區(qū)室(cellular compartment),仍與受體附著。受體的蛋白水解作用發(fā)生并且二聚IgA分子或IgM,與分泌 成分一起,在整個(gè)腔內(nèi)自由擴(kuò)散。
[0003] 已記載了分泌成分在各種分泌體如唾液、眼淚、粘液和乳中產(chǎn)生??勺鳛榉置谛悦?疫球蛋白(SIg,即SIgA和SIgM)的一部分以及游離的分泌成分(fSC)而發(fā)現(xiàn)。
[0004] 人分泌成分(hSC)通過(guò)在胞轉(zhuǎn)過(guò)程中受體分子胞外部分的切割而衍生自多聚免 疫球蛋白受體。其具有約SOkDa的表觀分子量并由排列在五個(gè)V型免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域中的 約前585個(gè)氨基酸的plgR(多聚Ig受體)組成。其具有7個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)。這種 強(qiáng)烈的糖基化作用有助于大的表觀分子量。這些聚糖的組成包括二-和三觸角結(jié)構(gòu)、路易 斯型結(jié)構(gòu)以及半乳糖和唾液酸。這些聚糖構(gòu)成細(xì)菌、病毒、真菌和原生動(dòng)物結(jié)構(gòu)如黏附素和 毒素以及宿主組織上的黏蛋白和受體的結(jié)合表位。
[0005] 分泌成分的一項(xiàng)擬議的功能是保護(hù)多聚免疫球蛋白免受蛋白降解并結(jié)合至與 結(jié)構(gòu)相關(guān)的病原體和毒素如幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、腸致病性大腸桿菌 (enteropathogenic E.coli)、艱難梭菌(Clostridium difficile)毒素 A 和肺炎鏈球菌 (Streptococcus pneumoniae)膽堿結(jié)合蛋白A。SC上的聚糖已證實(shí)參與對(duì)粘膜病原體 的固有保護(hù)(Perrier 等人,THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 281 (20),PP. 14280-14287,2006)。作者報(bào)道了由轉(zhuǎn)染的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary cells, CHO))產(chǎn)生的重組人SC與由人乳純化的SC表現(xiàn)相同。與病原體抗原的相互作用由 存在于hSC上的聚糖介導(dǎo)并涉及半乳糖和唾液酸殘基。hSC被認(rèn)為是有助于保護(hù)身體上皮 表面的抗病原庫(kù)(antipathogenic arsenal)的微生物清除劑。
[0006] 發(fā)現(xiàn)由人乳純化的SC競(jìng)爭(zhēng)性抑制艱難梭菌毒素A結(jié)合至受體(Dallas等人, J. Med. Microbiol. 47:879-888(1998))。通過(guò)酶消化從SIgA和SC除去糖類顯示出艱難梭 菌毒素A與去糖基化SC的結(jié)合比與糖基化SC的結(jié)合少。
[0007] 人SC存在大范圍的聚糖結(jié)構(gòu),包括可能結(jié)合凝集素和細(xì)菌黏附素的所有不同的 路易斯和唾液酸化(sialyl)-路易斯表位。人們可發(fā)現(xiàn)半乳糖與GIcNAc連接成¢1-4和 3 1-3 ;巖藻糖與GlcNAc連接成a 1-3和a 1-4且與半乳糖連接成a 1-2,以及a 2-3-和 a 2-6-連接的唾液酸。來(lái)自人乳的SC的超過(guò)50%的聚糖顯示各種類型的非核心巖藻糖基 化(non-core fucosylation),最豐富的含巖藻糖的抗原為路易斯X。人SC中約30%的路 易斯型巖藻糖基化抗原被唾液酸化??傊?,來(lái)自人乳的SC顯示超過(guò)50種不同的糖型。
[0008] SC上聚糖的擬議功能為例如
[0009] ?分泌性免疫球蛋白在粘液中錨定的介導(dǎo),
[0010] ?分泌性免疫球蛋白/抗原復(fù)合物與特定受體(如DC-SIGN)結(jié)合的介導(dǎo),
[0011] ?作為結(jié)合至宿主細(xì)胞的病原體結(jié)構(gòu)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑("誘餌(decoy) ")的作用, 例如通過(guò)作為由病原體毒素、病毒和細(xì)菌表達(dá)的凝集素樣受體的誘餌而起作用,
[0012] ?分泌性免疫球蛋白和對(duì)抗蛋白酶的SC(SC against proteases)的保護(hù)。
[0013] 天然SC中發(fā)現(xiàn)的眾多聚糖結(jié)構(gòu)可反映眾多功能。然而,對(duì)于分泌性免疫球蛋白的 特定治療和預(yù)防用途,可有利地減少聚糖種群(population)在分泌性免疫球蛋白制備中 的復(fù)雜度。對(duì)特定聚糖結(jié)構(gòu)和修飾的偏向可增加分泌性免疫球蛋白制劑的效力和/或減少 分泌性免疫球蛋白制劑的潛在副反應(yīng)。
[0014] 人分泌成分已重組表達(dá)在各種基因工程生物體和細(xì)胞例如細(xì)菌(大腸桿菌)、昆 蟲細(xì)胞(Sf9細(xì)胞)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、非洲綠猴腎CV-I細(xì)胞、人骨肉瘤細(xì) 胞TK-143B、人HeLa細(xì)胞、倉(cāng)鼠崽腎細(xì)胞、人腺癌細(xì)胞HT29、小鼠成纖維細(xì)胞、馬-達(dá)二氏犬 腎細(xì)胞(Madin-Darby canine kidney cells))和植物(例如 US20080260822, EP799310, Michetti 等人,1991Adv Exp Med Biol, vol 310,pp 183-5 ;Suguro 等人,2011,Protein Expr Purif. Vol. 78, pp 143-8 ;Prinsloo 等人,2006Protein Expr Purif. vol 47, pp 179-85 ;0gura, 2005,J Oral Sci.vol 47,pp 15-20 ;Matsumoto 等人,2003Scand J Immunol. Vol 58,pp 471-6 ; Johansen 等人,1999Eur J Immunol.,Vol 29,pp 1701-8 ; Chintalacharuvu 和 Morrison 1999,Immunotechnology. Vol 4, pp 165-74 ;de Hoop 等 人,1995. J Cell Biol. Vol 130,pp 1447-59 ;Larrick 等人,2001Biomol Eng. Vol 18,pp 87-94 ;Berdoz 等人,1999, Proc Natl Acad Sci U S A. vol 96, pp 3029-34 ;Rindisbacher 等人,1995,181〇1〇^111¥〇1.270,口口14220-8)中。
[0015] 發(fā)現(xiàn)于重組SC的聚糖模式依賴于宿主物種,宿主有機(jī)體(host organism)、組織 來(lái)源,以及基因工程細(xì)胞的生理狀態(tài)。
[0016] 雖然大腸桿菌根本不能產(chǎn)生N-糖基化蛋白,但迄今為止用于表達(dá)重組SC的大多 數(shù)其它宿主不能產(chǎn)生路易斯X巖藻糖基化(Sf9細(xì)胞、植物細(xì)胞、HeLa、CHO細(xì)胞、CV-I細(xì) 胞、143B細(xì)胞、BHK細(xì)胞、小鼠成纖維細(xì)胞、MDCK細(xì)胞)。在所述條件下,HT-29不會(huì)有效 地在N-聚糖上產(chǎn)生路易斯抗原。在葡萄糖中培養(yǎng)的HT-29細(xì)胞具有未分化多能過(guò)渡細(xì) 胞(transit cells)的性質(zhì),非常不穩(wěn)定,然而,在分化非許可條件(HT-29G1C+)下生長(zhǎng)的 HT-29細(xì)胞中高甘露糖向復(fù)合物糖蛋白的轉(zhuǎn)化嚴(yán)重減少,而不管研究任何生長(zhǎng)階段。
[0017] 母乳中的糖類表位已知在物種間不同,其中人乳表達(dá)最復(fù)雜的一種。Gustafsson 等人(Glycoconjugate 22:109-118(2005))研究了在來(lái)自人、牛、山羊、綿羊、豬、馬、單峰 馬它(dromedary)和兔的個(gè)體乳樣品中的蛋白-結(jié)合糖類表位的表達(dá)。
[0018] 發(fā)現(xiàn)于SC的聚糖模式依賴于宿主物種、宿主有機(jī)體、組織來(lái)源和生物體的生理狀 態(tài)(如健康狀態(tài)、泌乳期)。
[0019] Xu 等人(World J. Gastroenterol. 10(14)2063-2066(2004))分析了從轉(zhuǎn)基因山 羊獲得的巖藻糖基化乳的作用。人ct卜2/4巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(fucosyl-transferase)基因 在山羊乳腺中瞬時(shí)表達(dá),從而產(chǎn)生"人源化"山羊乳。發(fā)現(xiàn)山羊乳樣品抑制細(xì)菌結(jié)合至路易 斯b抗原。
[0020] W095/24495A1記載了在表達(dá)人糖基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳中轉(zhuǎn)基因生產(chǎn) 寡糖和復(fù)合糖(glycoconjugates)。
[0021] Grabenhorst 等人(Glycoconjugate Journal 1999, 16 (2) : 81-97)描述了在經(jīng)常 使用的宿主細(xì)胞中重組糖蛋白的基因工程,例如CHO細(xì)胞用糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)染。
[0022] Porter P(Immunology 1973,24(1) 163-176)描述了來(lái)自母豬乳的豬分泌成分和 分泌性IgA的純化。
[0023] Gustafsson 等人(Glycoconjugate Journal 2005, 22 (3) 109-118)描述了人和動(dòng) 物乳蛋白的路易斯型N-糖基化。
[0024] plgR-pIg復(fù)合物穿過(guò)細(xì)胞胞轉(zhuǎn),并且在腔表面plgR在毗鄰細(xì)胞膜的42-氨基酸區(qū) 域(region)內(nèi)被蛋白酶切割,由此將SIg釋放至腔內(nèi)。
[0025] plgR的切割的胞外部分仍結(jié)合至plg,并在此命名為分泌成分(SC)。plgR還可轉(zhuǎn) 運(yùn)至粘膜內(nèi),即使Plg未結(jié)合于此,因此大多數(shù)外分泌液包含結(jié)合在SIg內(nèi)的SC,還包含游 離的SC。
[0026] 精確的切割位點(diǎn)仍舊是模糊不清的,例如人SC發(fā)現(xiàn)具有參差不齊的C-末端,從 Ala-550至Lys-559變化,其中Ser-552為主要的C-末端殘基。
[0027] 可能的是額外的蛋白水解可在plgR切割后發(fā)生。事實(shí)上,來(lái)自不同粘膜液的游離 的SC似乎具有稍微不同的分子量,這可能教導(dǎo)了蛋白水解的確在游離的SC從plgR釋放后 在體內(nèi)發(fā)生。
[0028] 來(lái)自初乳的游離的SC具有大約76. 5kDa的分子質(zhì)量,與之相比,結(jié)合至dlgA的SC 的分子質(zhì)量大約80kDa。已顯示該差異起源于多肽鏈長(zhǎng)度的差異。然而,關(guān)于乳源SC的C 末端結(jié)合至多聚免疫球蛋白還沒(méi)有明確的共識(shí)。
[0029] SIgAl和SIgA2中通常較大尺寸的SC與游離的SC相比可起因于前者中二聚IgA 的存在,在PlgR于胞轉(zhuǎn)后切割時(shí)二聚IgA可保護(hù)SC的C-末端連接子。而在游離的SC于 類似情況下切割時(shí)該由二聚IgA提供的保護(hù)將會(huì)缺失。
[0030] 人初乳和乳富含蛋白酶和蛋白酶抑制劑二者。抑制劑與蛋白酶之比限定了活性蛋 白酶是否存在。在出生后該比例隨時(shí)間顯著變化且似乎在不同個(gè)體間存在差異。由于游離 的SC的C-末端連接子肽對(duì)蛋白酶高度敏感,有可能對(duì)于初乳和乳的游離的SC來(lái)說(shuō)存在沒(méi) 有"正確"的C-末端的情況。此外,來(lái)自除乳腺以外的其它組織(例如消化道(gut)、支氣 管、鼻組織)的SC的C-末端可顯示不同的C-末端,或者是因?yàn)閬?lái)自plgR的不同酶切割, 或者是因?yàn)榇嬖诓煌鞍酌感藜簦╰rimming)游離的SC或pig-結(jié)合的SC。
[0031] 防護(hù)人在粘膜部位(眼、鼻、口、肺、耳、氣管(traches)、食管、胃道(gastric tract)、腸、泌尿生殖道和結(jié)腸)的感染的最重要的分子之一為分泌性IgA,其可經(jīng)由其四 個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)起作用,也可經(jīng)由聚糖介導(dǎo)的分泌成分的結(jié)合起作用。
[0032] 許多研究證實(shí)了分泌物中特定SIgA抗體的效價(jià)(titer)與抗感染性之間的強(qiáng)相 關(guān)。某些研究證實(shí)了防護(hù)由形成細(xì)菌病原體的被囊(capsule)造成的全身激發(fā)(system challenge)〇
[0033] 來(lái)自正常受試者的唾液和初乳包含多反應(yīng)性SIgA抗體,識(shí)別各種自身抗原和多 種細(xì)菌抗原。已表明,這些為B-I細(xì)胞的產(chǎn)物,構(gòu)成在種系中編碼的"天然抗體"所有組成 成分(repertoire)的一部分,并且缺乏記憶能力和親和性成熟。這些抗體可提供在常規(guī) B-2-細(xì)胞暴露于標(biāo)稱抗原(nominal antigen)后生成特定抗體之前的粘膜表面的保護(hù)。盡 管它們具有低的對(duì)抗原的固有親和力,但SIgA中四個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的存在增加了其功能 活性。的確有跡象教導(dǎo)了細(xì)菌黏附素已進(jìn)化(evolved),因?yàn)樗鼈兡軌虮苊獗贿@些自然發(fā)生 的多反應(yīng)性抗體所識(shí)別。
[0034] 在人類中,存在兩種獨(dú)特的IgA-亞類(IgAl和IgA2)。已記載了人IgA2的兩種或 三種異型(a -重鏈的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的不同組合)。循環(huán)(血漿)IgA的主要分子形式為單 體,與上皮中產(chǎn)生的二聚(多聚)PlgA相反,且轉(zhuǎn)運(yùn)至分泌物中成為SIgA。
[0035] 人IgAl和IgA2(包括異型)似乎具有很少的(若有的話)不同生物特性,但顯著 例外可見(jiàn)于IgA亞類之間對(duì)細(xì)菌蛋白酶的敏感性的差異。IgAl和IgA2的抗體特異性分布 也不同。
[0036] 成人用蛋白質(zhì)抗原的免疫主要產(chǎn)生IgAl,用多糖的免疫主要引起IgA2抗體應(yīng)答。 到達(dá)粘膜表面的免疫球蛋白同種型中,SIgA為最穩(wěn)定的之一,該穩(wěn)定性已很大程度上歸因 于掩飾了 Fc部分內(nèi)潛在的切割位點(diǎn)的SC。
[0037] 證實(shí)了 SIgA抗體對(duì)微生物表面的表面結(jié)構(gòu)的特異性抑制了對(duì)咽、腸、泌尿生殖道 和牙齦上皮細(xì)胞的附著。除特異性的抗體介導(dǎo)的附著抑制以外,人IgA,特別是SIgA,借助 其糖鏈結(jié)合至多種細(xì)菌物種和抗原。其顯著的實(shí)例見(jiàn)于IgA2的情況,其中IgA2可通過(guò)涉 及大腸桿菌與上皮細(xì)胞的I型(甘露糖依賴性)菌毛和I型菌毛依賴性粘合的機(jī)理粘合大 腸桿菌。
[0038] 外分泌中的IgM還與由通過(guò)plgR轉(zhuǎn)運(yùn)至分泌物產(chǎn)生的分泌成分(分泌性IgM, SIgM)相關(guān)。SIgM的濃度低于SIgA的濃度,或者是因?yàn)檎衬そM織中IgM-產(chǎn)生細(xì)胞較低的 比例,或者是因?yàn)镮gM由于plgR-依賴型轉(zhuǎn)運(yùn)的分子量限制而比plgA轉(zhuǎn)運(yùn)稍差。
[0039] 天然抗體,根據(jù)定義,在明顯缺乏抗原刺激下產(chǎn)生。它們由特定的B細(xì)胞亞單 位產(chǎn)生,且不廣泛地親和力成熟。已描述了 IgA、IgM和IgG類別的天然抗體。這些抗 體一般由生殖系基因編碼,其中具有很少(若有的話)突變,且在許多情況下具有與 PAMP (pathogen-associated molecular pattern,病原體相關(guān)分子模式)、腫瘤抗原和多種 自身抗原的廣泛反應(yīng)性。由于它們的低親和力和種系構(gòu)造,此類多反應(yīng)性抗體似乎不是真 正的自身抗體,當(dāng)然也不與抗原特異性、體細(xì)胞突變、高親和力病理自身抗體屬于相同的類 別。
[0040] 天然抗體被認(rèn)為是固有免疫系統(tǒng)的一部分。它們已擬議用于某些治療用途,例如 癌癥治療,或傳染性疾病。
[0041] 許多多反應(yīng)性抗體具有種系或近種系序列,且主要為IgM,但有些也為IgG和IgA。
[0042] 與抗原_抗體相互作用的典型"鎖鑰"剛性結(jié)構(gòu)假設(shè)相反,多反應(yīng)性抗體的抗原結(jié) 合口袋(antigen binding pocket),或許是由于它們的種系構(gòu)造,被認(rèn)為更加柔性,因而可 適應(yīng)不同抗原構(gòu)造。
[0043] 盡管某些報(bào)道已建議SIgA本質(zhì)上為多反應(yīng)性的,但其它發(fā)現(xiàn)指出限制的特異性 可為交叉反應(yīng)性。
[0044] W02009139624A1公開了通過(guò)分級(jí)非人乳生產(chǎn)富含分泌性IgA的組合物的方法。此 類組合物可特別用于治療和/或預(yù)防需要此類處理的受試者的粘膜表面例如胃腸道、泌尿 生殖道、呼吸道、鼻腔或口腔的感染和/或炎癥,治療和/或預(yù)防需要此類處理的受試者的 肥胖癥及相關(guān)疾病,或者治療和/或預(yù)防需要此類處理的受試者的食物過(guò)敏。
[0045] 公知的是,人乳包含大量的路易斯-糖基化的復(fù)合糖如糖蛋白(例如SIgA和SC), 并且普遍接受的是人乳的值之一為其對(duì)由抗體、聚糖、寡糖和其它活性物質(zhì)如溶菌酶和乳 鐵蛋白引起的感染的高保護(hù)性效價(jià)。雖然人乳分析揭示了 75%的巖藻糖基化分布,但在牛 乳分析中僅觀察到31 %的巖藻糖基化分布。在牛乳分析中僅檢測(cè)到核心巖藻糖基化。
[0046] 盡管具有特定糖基化的人分泌性免疫球蛋白已證實(shí)了關(guān)于結(jié)合至病原體結(jié)構(gòu)、黏 蛋白和受體的有利效果,但它們還不能以期望品質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)。對(duì)于倫理理由,人乳典型地 不視為適合的原料。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0047] 本發(fā)明的目的為提供改進(jìn)的以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)高品質(zhì)分泌性免疫球蛋白制劑的方 法。進(jìn)一步的目的為提供特別適用于粘膜應(yīng)用的改進(jìn)的SC和免疫復(fù)合物制劑。
[0048] 所述目的已被權(quán)利要求的主題解決。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明,提供有生產(chǎn)以為非人分泌物來(lái)源的分泌性免疫球蛋白為基礎(chǔ)的免疫 復(fù)合物制劑的方法,所述方法包括
[0050] -提供能夠生產(chǎn)N-糖基化分泌成分的工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)體系,
[0051] -通過(guò)此類體系生產(chǎn)分泌成分,所述分泌成分包括相對(duì)于每摩爾分泌成分的至少 0. Olmol非核心巖藻糖,和
[0052] -將所述分泌成分與具有天然糖基化模式的IgA或IgM免疫球蛋白的至少之一相 結(jié)合,從而獲得免疫復(fù)合物,特別是天然N-糖基化模式。此類免疫復(fù)合物制劑在本文中具 體理解為固有免疫復(fù)合物制劑,其將具體支持哺乳動(dòng)物的固有免疫系統(tǒng)。
[0053] 非核心巖藻糖具體提供路易斯表位。因此,根據(jù)本發(fā)明的免疫復(fù)合物在此指包括 相對(duì)于每摩爾分泌成分的至少〇. Olmol路易斯表位。然而,在大多數(shù)情況下,SC的非核心 巖藻糖基化以適當(dāng)?shù)姆治龃_定。
[0054] 優(yōu)選該生產(chǎn)體系能夠生產(chǎn)路易斯型N-糖基化蛋白,具體為具有末梢 (peripheral)或觸角例如外臂的分泌成分,巖藻糖基化通過(guò)適當(dāng)?shù)姆治鍪侄卫珉娪炯?術(shù)、色譜分析技術(shù)、質(zhì)譜分析技術(shù)、化學(xué)和酶技術(shù)或其組合來(lái)確定。
[0055] 具體地,本發(fā)明提供分泌成分,所述分泌成分源自哺乳動(dòng)物來(lái)源的氨基酸或核苷 酸序列,或其嵌合序列,所述哺乳動(dòng)物來(lái)源具體為人、牛、山羊、綿羊、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、豬、 駱駝、單峰駝、驢或馬。
[0056] 具體地,根據(jù)本發(fā)明的方法采用選自乳腺分泌物和重組細(xì)胞培養(yǎng)物的合并來(lái)源 (pooled sources)的生產(chǎn)體系。
[0057] 在具體的實(shí)施方案中,所述分泌成分源自物種例如人、牛、山羊、綿羊、非人靈長(zhǎng)類 動(dòng)物、豬、小鼠、大鼠、兔、狗、小袋鼠(walIaby)、負(fù)鼠、熊貓、魚、雞、鳥、青娃的氨基酸或核苷 酸序列,或其嵌合序列。優(yōu)選地,所述分泌成分源自哺乳動(dòng)物來(lái)源的氨基酸或核苷酸序列, 或其嵌合序列,所述哺乳動(dòng)物來(lái)源具體為人、牛、山羊、綿羊、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、豬、駱駝、單 峰駝、驢或馬。
[0058] 在優(yōu)選的方法中,分泌成分富集在生產(chǎn)體系的級(jí)分中,例如乳級(jí)分,任選地從所述 級(jí)分分離。具體地,本發(fā)明的分泌成分制劑從此類富集的級(jí)分中獲得。具體地所述分泌成 分富集在級(jí)分中作為免疫復(fù)合物。
[0059] 根據(jù)具體方法,所述分泌成分由選自由源自至少10個(gè)泌乳期雌性個(gè)體的乳、乳濃 縮物、乳粉、乳清、乳清濃縮物和乳清粉組成的組的合并來(lái)源獲得。
[0060] 根據(jù)本發(fā)明的免疫復(fù)合物制劑,如果選自分泌物的池(pool),例如乳、唾液、或粘 膜分泌物(mucosal excretions),具體包含具有變化的C-末端的SC的混合物。
[0061] 具體地所述個(gè)體為非轉(zhuǎn)基因的且為選自由山羊、豬、牛、綿羊、馬、驢、單峰駝和駱 駝組成的組的物種,其中優(yōu)選山羊、豬、牛和綿羊。
[0062] 優(yōu)選地所述個(gè)體選自能夠生產(chǎn)具有路易斯型N-糖基化的糖蛋白的種群。具體的 選擇可從種群或畜群針對(duì)表達(dá)天然N-糖基化蛋白,S卩非重組蛋白的能力而作出。此類個(gè)體 將產(chǎn)生"人樣" SC,但不是將包含糖基化模式中不必要改變的"人源化"乳。例如,選擇此類 個(gè)體用于生產(chǎn)天然N-糖基化蛋白來(lái)表達(dá)具有天然糖基化模式的免疫復(fù)合物,包括SC上的 路易斯表位,具體地在末梢?guī)r藻糖基化中具有非核心巖藻糖或路易斯表位,而不在免疫球 蛋白重鏈的N-糖基化位點(diǎn)上。
[0063] 天然糖基化免疫球蛋白僅具有核心巖藻糖基化的N-聚糖。這與來(lái)自表達(dá)異源糖 基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的免疫球蛋白相反,后者將產(chǎn)生包括過(guò)剩的非核心或末梢?guī)r藻糖基 化以及路易斯表位的免疫球蛋白制劑。
[0064] 在獲得來(lái)自人類或動(dòng)物的具有天然糖基化模式的根據(jù)本發(fā)明的免疫復(fù)合物制劑 的努力中,優(yōu)選此類制劑基于非重組蛋白,或者不從此類表達(dá)異源糖基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因動(dòng) 物中獲得。
[0065] 例如根據(jù)個(gè)體哺乳動(dòng)物或細(xì)胞生產(chǎn)具有路易斯型N-糖基化、特別是在SC上具有 非核心巖藻糖基化或路易斯型糖基化的糖蛋白的能力作出選擇。
[0066] 優(yōu)選地,非核心巖藻糖的相對(duì)含量為至少0? Olmol/mol SC,優(yōu)選至少0? 02mol/ mol SC,更優(yōu)選至少 0? 03、0. 04、0. 05、0. 06、0. 07、0. 08、0. 09 或 0? lmol/mol SC,更優(yōu)選至 少0.2、0.3、0.4或0.5111〇1/1]1〇13(],甚至更優(yōu)選至少11]1〇1/1]1〇13(],或甚至更高,例如至少 2mol/mol SC、至少 3mol/mol SC、至少 4mol/mol SC、至少 5mol/mol SC、至少 6mol/mol SC、 至少 7mol/mol SC、至少 8mol/mol SC、至少 9mol/mol SC 或至少 lOmol/mol SC。
[0067] 在具體情況中,N糖基化位點(diǎn)量的理論值為2 (魚)、3 (牛)、4 (馬、狗、大鼠)、5 (雞、 猩猩(orang-utan)、豬)、6(黑猩猩、青蛙)或7(人、小鼠、軟骨魚類)mol/mol SC。根據(jù)本 發(fā)明,具體優(yōu)選非核心巖藻糖的量或路易斯表位的量為至少1%,優(yōu)選至少2、3、4、5、6、7、 8、9或10 %的N-糖基化位點(diǎn)的理論值,更優(yōu)選至少20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 % 或90%,上至理論值。非核心巖藻糖的量可超過(guò)N-糖基化位點(diǎn)的理論值,例如,通過(guò)每個(gè) N-糖基化位點(diǎn)的多個(gè)巖藻糖基化,從而獲得比N-糖基化位點(diǎn)數(shù)多的基于摩爾的路易斯表 位。在具體的優(yōu)選情況中,非核心巖藻糖或路易斯表位的量為至少I. 1倍、優(yōu)選至少1. 2倍、 或至少1. 3倍、至少1. 4倍、至少1. 5倍、至少1. 6倍、至少1. 7倍、至少1. 8倍、至少1. 9倍 或至少2倍,在具體情況中,該量甚至更高,例如至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、 至少7倍、至少8倍或至少9倍,例如多至10倍的N-糖基化位點(diǎn)的理論量。
[0068] 而下限閾值,例如相對(duì)于每摩爾SC的至少0. Olmol非核心巖藻糖,反應(yīng)了高品 質(zhì)的SC制劑,特別是在?;蚍雌c動(dòng)物中,較高的閾值,例如至少0. 1或至少0. 5,甚至至少 I. Omol/mol,可應(yīng)用于從來(lái)源如馬、驢或豬獲得的高品質(zhì)SC制劑。
[0069] 非核心巖藻糖基化在制劑中的程度可通過(guò)選擇具有高非核心巖藻糖基化(相對(duì) 于每摩爾SC)的SC來(lái)增加。這可在選擇生產(chǎn)型宿主(例如篩選細(xì)胞系、微生物克隆或生物 體)的水平下進(jìn)行,或者可在下述個(gè)體供體的水平下進(jìn)行,選擇所述個(gè)體供體來(lái)為這些樣 品的隨后合并提供包含具有高摩爾非核心巖藻糖基化的SC的分泌物。巖藻糖基化可通過(guò) 本發(fā)明的SC制劑或免疫復(fù)合物的酶或化學(xué)巖藻糖基化來(lái)增加。
[0070] 根據(jù)具體實(shí)施方案,SC和/或免疫球蛋白由作為中間物提供的包括期望品質(zhì)的SC 和/或免疫球蛋白的合并來(lái)源獲得。此類中間物可選自合并干燥的乳或乳清粉,例如凍干 或噴霧干燥的,或者包含血漿免疫球蛋白的血漿池或合并的血漿級(jí)分。然后將中間物進(jìn)一 步加工以富集SC和/或免疫球蛋白級(jí)分,例如至少10倍、優(yōu)選至少20倍,或甚至更高。
[0071] 根據(jù)本發(fā)明的富含SC和/或SIgA的具體制劑具體包括至少20% SC和/或SIgA, 或者至少30%、至少40%或至少50% (w/w總蛋白)。
[0072] 盡管SIgA或SIgM免疫復(fù)合物優(yōu)選不完全由重組來(lái)源例如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或基因工程 細(xì)胞獲得,特別是對(duì)于免疫復(fù)合物的IgA或IgM成分,來(lái)源優(yōu)選非重組體,根據(jù)具體實(shí)施方 案,分泌成分可由重組宿主細(xì)胞獲得,例如由表達(dá)自身或異源N-糖基轉(zhuǎn)移酶和特別是巖藻 糖基轉(zhuǎn)移酶的宿主細(xì)胞獲得,優(yōu)選表達(dá)自身或異源功能性a-l,x-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的重組 生產(chǎn)型宿主細(xì)胞系,其中X為2、3或4,優(yōu)選選自由人細(xì)胞系、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、鳥類細(xì)胞系、 細(xì)菌、植物、酵母、昆蟲、真菌、苔蘚和古菌(archaea)組成的組。
[0073] 根據(jù)具體方面,本發(fā)明提供一種分離的重組分泌成分,所述分泌成分包括氨基酸 序列SEQ ID 1,或其功能性活性變體,該分泌成分具有路易斯型N糖基化模式和相對(duì)于每 摩爾分泌成分的至少2mol非核心巖藻糖。具體地,重組SC包括人SC序列,或人SC來(lái)源的 序列。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案,重組SC為人SC,或其功能性活性變體。
[0074] 具體地,本發(fā)明的重組分泌成分包括唾液酸,優(yōu)選相對(duì)于每摩爾分泌成分的至少 2mol唾液酸。更具體地,重組SC包括相對(duì)于每摩爾分泌成分的至少2mol唾液酸化路易斯 Xo
[0075] 可選地,本發(fā)明的重組分泌成分為非唾液酸化的,優(yōu)選包括相對(duì)于每摩爾分泌成 分小于0. Imol唾液酸。
[0076] 重組SC可通過(guò)將plgR完整基因如人plgR引入宿主細(xì)胞,隨后表達(dá)跨膜蛋白 PlgR,接著將胞外部分-SC切割并釋放至培養(yǎng)上清液中來(lái)生產(chǎn)??蛇x的表達(dá)為SC的核苷酸 序列的轉(zhuǎn)錄,即僅胞外結(jié)構(gòu)域,例如編碼氨基酸序列SEQ ID 1。在所有情況下,重組SC的表 達(dá)允許生產(chǎn)條件的精確選擇,確保終產(chǎn)物的均一 C-末端。
[0077] 還允許根據(jù)需要選擇翻譯終止位點(diǎn)。優(yōu)選要表達(dá)的SC基因上的終止密碼子位于 編碼最后的胞外免疫球蛋白-樣結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域5)和跨膜區(qū)之間。然而,本發(fā)明的重組SC 可甚至更短,只要其能夠結(jié)合多聚免疫球蛋白并包含所需水平的非核心巖藻糖即可。
[0078] SEQ ID 1中前18個(gè)氨基酸包括信號(hào)肽,其可被不同信號(hào)肽所取代,取決于所使用 的宿主細(xì)胞或有機(jī)體以及所需的分泌效率。對(duì)于通過(guò)化學(xué)合成生產(chǎn)或細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)SC,不需 要信號(hào)肽(例如對(duì)于大腸桿菌內(nèi)含體中非糖基化形式的生產(chǎn))。蛋白質(zhì)還可修飾成在SEQ ID 1的C-末端包含額外的氨基酸。
[0079] 該蛋白質(zhì)可在核酸中的需要位置處通過(guò)終止密碼子來(lái)終止,該位置分別在氨基酸 G545的密碼子之后,優(yōu)選位于K566和E607之間(包括這些位點(diǎn))的任意氨基酸位點(diǎn),更 優(yōu)選在R603和E607之間(包括這些位點(diǎn)),或者在E607之后。最優(yōu)選SC在R603之后終 止。編號(hào)指的是SEQ ID 1。
[0080] 優(yōu)選地,本發(fā)明的SC制劑為均一的,其中至少80%、至少90%或至少95%,多至 100 %的SC分子具有相同的C-末端。
[0081] 重組SC的聚糖模式依賴于宿主物種、宿主有機(jī)體、組織來(lái)源和基因工程細(xì)胞的生 理狀態(tài)。
[0082] 優(yōu)選宿主細(xì)胞選自由人細(xì)胞如PerC. 6、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、倉(cāng)鼠崽腎細(xì)胞、鼠類細(xì) 胞、鳥類細(xì)胞系、細(xì)菌細(xì)胞、酵母真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞組成的組。重組SC可獲得 期望的非核心巖藻糖基化或路易斯型N-糖基化。優(yōu)選選擇或修飾宿主細(xì)胞以表達(dá)需要的 糖基轉(zhuǎn)移酶,從而產(chǎn)生非核心N-糖基化巖藻糖基化。非核心巖藻糖基化可例如通過(guò)酶或化 學(xué)或化學(xué)酶技術(shù)在表達(dá)重組SC之后引入或增加。
[0083] 在本發(fā)明的制劑中非核心巖藻糖基化的程度可通過(guò)選擇具有高非核心巖藻糖基 化(相對(duì)于每摩爾SC)的SC來(lái)增加。這可在生產(chǎn)型宿主的選擇水平下操作(這樣的篩選 用于細(xì)胞系、微生物克隆或轉(zhuǎn)基因有機(jī)體),其還可在個(gè)體供體被選擇來(lái)為這些樣品的隨后 合并提供包含具有高摩爾非核心巖藻糖基化的SC的分泌物的水平下操作。巖藻糖基化可 通過(guò)本發(fā)明的SC制劑或固有免疫復(fù)合物的酶或化學(xué)巖藻糖基化引入或增加。
[0084] 優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明使用的SC上的路易斯X表位的相對(duì)含量為至少O.Olmol/mol SC, 優(yōu)選至少 〇? 02mol/mol SC,更優(yōu)選至少 0? 03、0. 04、0. 05、0. 06、0. 07、0. 08、0. 09 或 0? lmol/ mol SC,更優(yōu)選至少0. 2、0. 3、0. 4或0. 5mol/mol SC,甚至更優(yōu)選至少lmol/mol SC,或甚至 更高,例如至少 2mol/mol SC、3mol/mol SC、4mol/mol SC、5mol/mol SC、6mol/mol SC、7mol/ mol SC、8mol/mol SC、9mol/mol SC,或至少 lOmol/mol SC。
[0085] 具體優(yōu)選的分離的重組SC,例如在重組SC制劑中,具有路易斯型N糖基化模式和 相對(duì)于每摩爾分泌成分的至少2mol非核心巖藻糖。
[0086] 具體地,其包括相對(duì)于每摩爾SC的至少2mol路易斯X表位,在某些情況中為至少 6mol/mol〇
[0087] 具體地,其包括唾液酸,優(yōu)選相對(duì)于每摩爾分泌成分的至少2mol唾液酸。具體地, 其包括相對(duì)于每摩爾分泌成分的至少2mol唾液酸化路易斯X。
[0088] 可選地,重組SC具體為非唾液酸化的,優(yōu)選包括相對(duì)于每摩爾分泌成分小于 0. Imol唾液酸。
[0089] 根據(jù)具體方面,提供一種免疫復(fù)合物制劑,所述免疫復(fù)合物制劑包括本發(fā)明的重 組分泌成分,和IgA或IgM免疫球蛋白的至少之一,優(yōu)選人免疫球蛋白。具體地,所述免疫 球蛋白為血漿免疫球蛋白,例如,源自人血漿或血漿級(jí)分。
[0090] 根據(jù)本發(fā)明,進(jìn)一步提供一種免疫復(fù)合物制劑,其以分泌性免疫球蛋白為基礎(chǔ),源 自除人分泌物以外的其它來(lái)源,所述免疫復(fù)合物制劑包括
[0091] -分泌成分,其具有非核心巖藻糖基化模式或路易斯型N糖基化模式和相對(duì)于每 摩爾分泌成分至少0. Olmol路易斯表位,和
[0092] -具有天然糖基化模式的IgA或IgM免疫球蛋白的至少之一。
[0093] 根據(jù)本發(fā)明的制劑具體包括多聚免疫球蛋白,例如,二聚或五聚或其它多聚免疫 球蛋白,例如二聚SIgA或五聚SIgM。優(yōu)選地,免疫球蛋白由動(dòng)物乳,初乳,乳或初乳級(jí)分或 濃縮物中任一種,以及血漿或其級(jí)分獲得。
[0094] 具體地,根據(jù)本發(fā)明的制劑包括多反應(yīng)性免疫球蛋白,優(yōu)選包括種系抗體的天然 免疫球蛋白。
[0095] 根據(jù)具體實(shí)施方案,進(jìn)一步提供一種制劑品(formulation),所述制劑品以液劑、 乳劑或懸浮劑的形式或以優(yōu)選噴霧干燥或冷凍干燥的干燥形式,包括本發(fā)明的分離或純化 (重組)的分泌成分或本發(fā)明的免疫復(fù)合物制劑。
[0096] 根據(jù)本發(fā)明的制劑品具體可以用以下形式提供:天然制劑品如其中免疫復(fù)合物以 天然背景提供的乳制品(dairy product),例如乳,或奶制品(milk product)如奶酪、酸奶、 乳清、乳清濃縮物,或者以包括分離的或純化的SC或免疫復(fù)合物的合成制劑品。具體地,根 據(jù)本發(fā)明的制劑品可以液劑、糖漿劑(syrup)、錠劑、片劑的形式提供,例如泡騰片劑、噴霧 齊II、吸入器制劑品(inhalator formulation)、粉劑、速溶粉、顆粒劑、栓劑、膠囊劑、霜?jiǎng)⒑?齊U、凝膠劑、滴劑、懸浮劑、乳劑或包括乳制品和口香糖等的食品。
[0097] 優(yōu)選該制劑品為用于粘膜使用的制劑品、特別是用于口服用途的制劑品。
[0098] 根據(jù)另外的具體實(shí)施方案,本發(fā)明提供本發(fā)明的分離或純化(重組)的分泌成分 或本發(fā)明的免疫復(fù)合物制劑或本發(fā)明的制劑品,其用于治療或預(yù)防免疫球蛋白缺陷如選擇 性IgA缺陷、選擇性IgM缺陷或CVID,特別是粘膜免疫球蛋白缺陷,優(yōu)選以用于粘膜應(yīng)用 (mucosal application)的制劑品,并優(yōu)選口、支氣管、鼻、陰道、胃內(nèi)或直腸使用。
[0099] 因此,本發(fā)明進(jìn)一步提供各治療或預(yù)防粘膜免疫球蛋白缺陷的方法,通過(guò)向需要 其的受試者投與有效量的本發(fā)明的化合物(compound)或組合物。
[0100] 受試者-特別是人受試者-可能需要治療瞬時(shí)、后天和慢性的免疫缺陷,例如處 于粘膜免疫球蛋白缺陷的風(fēng)險(xiǎn)或遭受粘膜免疫球蛋白缺陷,因而符合此類治療的條件,從 而例如標(biāo)準(zhǔn)化和/或提升例如如在粘膜樣品中確定的或在血液中間接確定的SIgA和/或 SIgM在粘膜中的水平。
[0101] 具體治療適應(yīng)癥為,例如,諸如鼻-咽道、泌尿生殖道、眼和胃道等的傳染病,例如 在近端小腸的細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)性尿路感染或慢性支氣管肺的感染。
[0102] 優(yōu)選用途為預(yù)防由包括微生物的物質(zhì)或有機(jī)體、抗原或致病劑(disease causing agents)如毒素等的病原體引起的疾病或紊亂。
[0103] 具體地,治療處于感染、過(guò)敏風(fēng)險(xiǎn)或遭受感染、過(guò)敏的受試者,例如處于過(guò)敏癥狀 和自身免疫病的風(fēng)險(xiǎn)或遭受過(guò)敏癥狀和自身免疫病的受試者。具體地,受試者遭受IgA和 /或IgM缺陷,包括選擇性IgA和/或IgM缺陷、SIgA缺陷和/或SIgM缺陷,具體為組合的 分泌性IgA/IgM缺陷。
[0104] 根據(jù)進(jìn)一步具體的方面,受試者用口服制劑治療,例如提供一次劑量的IOmg至 IOg SIgA和/或SIgM,例如其中SIgA或SIgM的含量為每投與單位IOmg至IOg的制劑,例 如作為主要的免疫球蛋白,或者SIgA和SIgM的組合總量為IOmg至10g。
[0105] 根據(jù)本發(fā)明的制劑品可特別提供為用于食品用途和/或用于治療用途。具體 地,該制劑品可提供為膳食增補(bǔ)劑(dietary supplement)、營(yíng)養(yǎng)管理食物(nutritional management food)、食物添加劑或醫(yī)藥食物。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0106] 圖1不出人分泌成分的氨基酸序列。
[0107] 圖2示出人分泌成分的核酸序列,包括5'和3'端的克隆位點(diǎn)。
[0108] 圖3示出a 1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT2)的氨基酸序列。
[0109] 圖4示出a 1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT2)的基因,帶有各克隆位點(diǎn)(下劃線)。 [0110] 圖5示出巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3的蛋白序列。
[0111] 圖6示出巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3的基因,帶有各克隆位點(diǎn)(下劃線,斜體)。
[0112] 圖7示出P 1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I的氨基酸序列。
[0113] 圖8示出¢1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I的基因,帶有各克隆位點(diǎn)(下劃線,斜體)。
[0114] 圖9示出¢1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶V的氨基酸序列。
[0115] 圖10示出M,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶V的基因,帶有各克隆位點(diǎn)(下劃線,斜體)。
[0116] 圖11示出¢1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I的氨基酸序列。
[0117] 圖12示出@ 1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶II的基因,帶有各克隆位點(diǎn)(下劃線,斜體)。
[0118] 圖13示出嵌合抗-硝基苯基IgA重鏈的蛋白序列(小寫字母=前導(dǎo)肽,下劃線= 鼠類VH)。
[0119] 圖14示出嵌合抗-硝基苯基IgA重鏈構(gòu)建體的DNA序列,包括HindIII和XbaI 限制性位點(diǎn)(下劃線)。
[0120] 圖15示出用于檢測(cè)非核心巖藻糖基化(路易斯-糖基化)分泌性免疫球蛋白的 快速測(cè)定流程。
[0121] 圖16示出,在用分泌性免疫球蛋白的制劑溫育時(shí)艱難梭菌毒素A的細(xì)胞毒性的減 少。以與毒素等摩爾的量試驗(yàn)兩種SIgA制劑,其中每種山羊個(gè)體具有不同的非核心巖藻糖 基化。作為陽(yáng)性對(duì)照,使用等摩爾量和高10倍的量的人SIgA。作為陰性對(duì)照,使用牛血清 白蛋白(BSA)。
[0122] 圖17示出由動(dòng)物個(gè)體的乳獲得的SIgA制劑的篩選結(jié)果。在ELISA分析中,SIgA 的非核心巖藻糖基化通過(guò)結(jié)合至凝集素DC-SIGN的路易斯-特異性糖基化來(lái)確定。作為陽(yáng) 性對(duì)照,使用來(lái)自人乳的SIgA。作為陰性對(duì)照,使用來(lái)自商用羊乳的SIgA (合并的,不從動(dòng) 物個(gè)體篩選乳)。

【具體實(shí)施方式】
[0123] 本文使用的關(guān)于分泌成分(SC)或免疫復(fù)合物制劑的術(shù)語(yǔ)"人樣"或"人源化"應(yīng) 指人SC,例如重組人SC,或源自其它物種,但不源自人分泌物,例如人乳。具體工程化或選 擇人源化SC以獲得具有包括非核心巖藻糖或路易斯表位的N-糖基化模式的SC制劑。具 體地,"人樣"或"人源化" SC或免疫復(fù)合物優(yōu)選包括人樣或人源化SC,該人樣或人源化SC 或者由哺乳動(dòng)物乳腺的非人分泌物獲得并選擇具有路易斯表位的高度糖基化,該人樣或人 源化SC或者基于具有包括期望的路易斯表位的巖藻糖基化模式的人來(lái)源的序列或人源化 序列作為重組SC而獲得。人源化SC具體包括末梢、觸角或外臂巖藻糖基化(統(tǒng)稱為術(shù)語(yǔ) "非核心巖藻糖基化"),其證實(shí)賦予抗病原體作用和特異性受體結(jié)合性質(zhì)(例如,結(jié)合至樹 突細(xì)胞上的DC-SIGN)。
[0124] 如本文所述的"人源化"SC或免疫復(fù)合物不同于由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物獲得的"人源化"乳, 本質(zhì)在于其具有SC上選定的高水平路易斯表位,并且還在其它糖蛋白如免疫球蛋白上具 有天然N-糖基化模式,從而避免過(guò)剩的巖藻糖基化,具體地為過(guò)量的末梢?guī)r藻糖基化。因 此,免疫復(fù)合物中的免疫球蛋白具有天然糖基化模式,例如僅具有核心糖基化N聚糖的天 然N-糖基化模式。
[0125] 本文使用的關(guān)于免疫球蛋白、特別是IgA和/或IgM的糖基化模式的術(shù)語(yǔ)"天然" 應(yīng)意指由哺乳動(dòng)物的B細(xì)胞產(chǎn)生的糖基化,其具體特征在于無(wú)非核心巖藻糖基化,且具體 無(wú)路易斯表位的糖基化。路易斯表位典型地不由天然或未修飾的哺乳動(dòng)物B細(xì)胞產(chǎn)生。
[0126] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"非核心巖藻糖基化"或"路易斯表位"應(yīng)指特別是在非核心位置 具有巖藻糖基化的聚糖觸角(glycan antennae),包括末梢、觸角或外臂巖藻糖基化。其具 體指可被特定免疫球蛋白或抗體識(shí)別的路易斯抗原或H型抗原的表位。路易斯表位可以路 易斯血型抗原存在,包括路易斯X (LeX)、路易斯y (LeY)、路易斯b (LeB)和路易斯a (LeA)抗 原。術(shù)語(yǔ)"路易斯表位"還應(yīng)指H型I和H型II抗原,以及血抗原A和B。路易斯抗原可進(jìn) 一步例如被唾液酸修飾,從而形成例如唾液酸化的路易斯表位。路易斯抗原可為唾液酸化 的和/或硫酸化的。優(yōu)選的路易斯表位起源于LeX和唾液酸化的LeX抗原。
[0127] 提及關(guān)于如本文制備的SC的特定"非核心巖藻糖基化"應(yīng)指SC糖蛋白制劑,例如 分離的重組SC,或從合并來(lái)源分離,如乳或乳級(jí)分。因此,其應(yīng)用于包括單個(gè)SC分子的制 齊IJ,各自具有特定的糖基化模式,例如具有與之附著的一個(gè)以上的外觸角(或非核心)巖藻 糖殘基。SC糖基化因而由本文所述的制劑所測(cè)定。
[0128] 出于說(shuō)明和非限制目的,重組SC可在本文所述的基因工程化(修飾)的CHO細(xì)胞 中表達(dá),并且大多數(shù)SC分子個(gè)體可在SC的特定N-糖基化位點(diǎn)上具有非核心巖藻糖殘基。 此類"非核心巖藻糖基化"可以多種方式表征。在各情況中提及的是,與在缺乏根據(jù)本發(fā) 明的修飾的細(xì)胞系中制備的SC糖蛋白分子種群相比,具有非核心巖藻糖殘基的SC糖蛋白 分子種群的數(shù)量相對(duì)高(或增加)。
[0129] 分泌成分的特定非核心巖藻糖基化還可通過(guò)酶和/或化學(xué)添加巖藻糖至在添加 前顯示低或非核心藻糖基化的位點(diǎn)來(lái)產(chǎn)生。
[0130] 另一種表征根據(jù)本發(fā)明的SC糖蛋白制劑的方式為通過(guò)所產(chǎn)生的分離的分泌成分 中非核心巖藻糖基化與總糖基化之比。根據(jù)本發(fā)明的重組分泌成分具有約1:1至1: 5、1:5 至1:10、1:10至1:30、1:30至1:100的非核心巖藻糖基化N糖基化:總N-糖基化之比。
[0131] 另一種表征分離的重組分泌成分的方式為由非核心巖藻糖殘基(巖藻糖基化血 型結(jié)構(gòu))形成的表位與SC糖蛋白的聚糖成分的相對(duì)量。
[0132] 如本文使用的關(guān)于IgA和IgM的術(shù)語(yǔ)"天然糖基化模式"應(yīng)指在IgA或IgM的 重鏈中發(fā)現(xiàn)的N-糖基化模式,該模式實(shí)質(zhì)上不含有路易斯表位,但僅含有核心巖藻糖 基化(若有的話)。雖然糖蛋白的天然糖基化模式在物種之間不同,但在物種內(nèi)的種群 (population)內(nèi)存在糖基化性質(zhì)的典型范圍,例如糖類位點(diǎn)的理論值和位置。動(dòng)物如牛、山 羊和綿羊的分泌性免疫球蛋白一般在物種內(nèi)在理論糖基化位點(diǎn)方面具有類似的糖基化模 式。
[0133] 還發(fā)現(xiàn)糖基化模式中的實(shí)際糖基化位點(diǎn)的百分比在0至100%的范圍內(nèi),主要取 決于如種屬(race)、年齡、家族、進(jìn)食、泌乳期、健康狀況、生理狀況和乳加工等參數(shù)。
[0134] 本文使用的關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的SC的術(shù)語(yǔ)"非核心巖藻糖基化模式"或"路易斯型 N-糖基化模式"應(yīng)指包括N-連接的巖藻糖和在非核心位置如末梢、觸角或外臂位置的路易 斯表位的糖基化模式。糖基化期間,形成N-連接或O-連接糖蛋白。N-連接糖蛋白構(gòu)成主 要的細(xì)胞表面蛋白和分泌蛋白。路易斯血型結(jié)構(gòu)通過(guò)觸角聚糖的特定巖藻糖基化而形成。 例如,路易斯X和路易斯a結(jié)構(gòu)分別為(Gal- 0 1-4) (Fuc- a 1-3) GlcNac和(Gal- 0 1-3) (Fuc-a 1-4) GlcNac。這些結(jié)構(gòu)可進(jìn)一步被唾液酸化(NeuAca2, 3_),從而形成相應(yīng)的唾液酸 化結(jié)構(gòu)。感興趣的其它路易斯血型結(jié)構(gòu)為路易斯y和路易斯b結(jié)構(gòu),分別為(Fuc-a 1-2) Gal-P 1-4 (Fuc-a 1-3) GlcNAc 和(Fuc-a 1-2) Gal-P-1-3 (Fuc-a 1-4) GIcNAc。另外,路易 斯表位來(lái)自H型I和H型II抗原(分別為(Fuc-a l-2)Gal-0 l_3GlcNac和(Fuc-a 1-2) Gal-P l_4GlcNac),以及血抗原 A 和 B(分別為(GalNAc-a l-3)Fuc_a l-2GaiP l_3GlcNAc 和(Gal-a l-3)Fuc_a l-2GaiP l_3GlcNAc)。對(duì)于ABO和路易斯血型結(jié)構(gòu)以及它們合成中 涉及的酶的結(jié)構(gòu)描述,參見(jiàn) Ma 等人,2006, Glycobiology vol. 16, no. 12pp 158R-184R。
[0135] SC的示例性非核心巖藻糖基化或路易斯型N-糖基化模式如下所述:
[0136] N-聚糖(N-連接寡糖、N-(Asn)-連接寡糖)為共價(jià)鍵和至多肽鏈的天冬酰胺殘基 的糖鏈,一般涉及N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)殘基和一致的肽序列:Asn-X-Ser/Thr。N-聚糖 享有共同的戊糖核心區(qū)并且通??煞殖扇齻€(gè)主要類別:甘露寡糖(或高_(dá)甘露糖)型、復(fù)合 型和雜合型。
[0137] 在脊椎動(dòng)物N-聚糖中,主要的核心修飾為在與鄰近核心中的天冬氨酸的N-乙酰 葡糖胺連接的a 1-6鍵中添加巖藻糖(=核心巖藻糖基化)。
[0138] 大多數(shù)復(fù)合和雜合N-聚糖具有通過(guò)添加¢-連接的半乳糖殘基至起始N-乙酰 葡糖胺從而產(chǎn)生遍在的結(jié)構(gòu)單元(building block)Gal@l-4GlcNAc而延長(zhǎng)的分支,稱作 2N-乙酰乳糖胺型或"LacNAc"序列。觸角可進(jìn)一步通過(guò)順序添加例如N-乙酰葡糖胺和半 乳糖殘基來(lái)延長(zhǎng)。
[0139] 最重要的"加帽"或"綴飾"基序涉及在支鏈上的唾液酸、巖藻糖、半乳糖、N-乙酰 半乳糖胺和硫酸鹽。所有這些巖藻糖-殘基在本文中稱作非核心巖藻糖-殘基:
[0140] 路易斯血型和相關(guān)抗原為承載a 1-2、a 1-3、a 1-4巖藻糖殘基或其組合的一組 聚糖。1型和2型血型抗原上的A、B和H決定簇-血型決定簇顯示a 1-2連接的巖藻糖。
[0141] 下列具體結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是SC上的"非核心巖藻糖基化":承載a 1-2、a 1-3、a 1-4 巖澡糖殘基或其組合的聚糖,路易斯a,路易斯b,路易斯x,路易斯y,1型和2型血型抗原上 的A、B和H決定簇-血型決定簇,及其唾液酸化和/或硫酸化形式。
[0142] 糖蛋白的路易斯表位的最大或理論數(shù)可等于或超過(guò)其糖基化位點(diǎn)數(shù),由于每 N-糖基化位點(diǎn)可存在多個(gè)路易斯表位,例如通過(guò)結(jié)構(gòu)的支化、延長(zhǎng)和重復(fù)。例如,人SC具有 7個(gè)糖基化位點(diǎn),因而,超過(guò)7個(gè)路易斯表位是可能的。由于路易斯表位可包括一個(gè)或多個(gè) 非核心巖藻糖,所以糖蛋白中非核心巖藻糖數(shù)可超過(guò)路易斯表位數(shù)。
[0143] 在具體優(yōu)選的情況中,非核心巖藻糖數(shù)或路易斯表位數(shù)為N-糖基化位點(diǎn)的理論 量的至少I. 1倍、優(yōu)選至少1. 2倍、或至少1. 3倍、至少1. 4倍、至少1. 5倍、至少1. 6倍、至 少1. 7倍、至少1. 8倍、至少1. 9倍、或至少2倍,在具體情況中,該量甚至更高,例如為N-糖 基化位點(diǎn)的理論量的至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍或至少 9倍,例如多至10倍。
[0144] 路易斯型N-糖基化可被賦予相應(yīng)的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,用于在合成通路中將巖藻 糖單元(fucose unit)從鳥苷-5'-二磷酸巖藻糖中轉(zhuǎn)移至糖受體的特定輕基。異源性巖 藻糖基轉(zhuǎn)移酶可由重組有機(jī)體表達(dá),從而表達(dá)巖藻糖基化的糖蛋白。
[0145] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"免疫復(fù)合物"應(yīng)指包括通過(guò)非共價(jià)鍵或共價(jià)鍵鍵合至分泌成分 的至少一個(gè)免疫球蛋白分子的蛋白復(fù)合物。非共價(jià)締合(associations)包括例如靜電或 疏水相互作用。在根據(jù)本發(fā)明的免疫復(fù)合物中,提供可共價(jià)鍵合至另外的免疫球蛋白的至 少一種IgA和/或至少一種IgM分子,從而形成多聚免疫球蛋白。事實(shí)上,此類多聚發(fā)生在 多聚抗體的整個(gè)J鏈,或者通過(guò)其它非共價(jià)相互作用發(fā)生。
[0146] 術(shù)語(yǔ)"工業(yè)規(guī)模"應(yīng)指來(lái)自天然原料或重組表達(dá)體系、包括細(xì)胞培養(yǎng)物的免疫復(fù)合 物的大規(guī)模生產(chǎn)。如本文所述的工業(yè)規(guī)模表達(dá)體系優(yōu)選具有經(jīng)證明的每升至少IOmg免疫 復(fù)合物的生產(chǎn)力,優(yōu)選IOOmg每升,優(yōu)選體積為至少100升,更優(yōu)選至少1000升,例如通過(guò) 合并來(lái)源。
[0147] 關(guān)于免疫復(fù)合物的術(shù)語(yǔ)"固有"應(yīng)指調(diào)節(jié)或刺激固有免疫應(yīng)答或在包括哺乳動(dòng)物 的動(dòng)物中,在其中的人受試者或患者中起作用的免疫復(fù)合物。雖然根據(jù)本發(fā)明的固有免疫 復(fù)合物可以相對(duì)非特異性的方式支持對(duì)病原體的免疫防御,但其也可特異性識(shí)別特定的或 溶解的抗原物質(zhì)的表位。
[0148] 本文使用的關(guān)于蛋白質(zhì)如根據(jù)本發(fā)明的SC或免疫復(fù)合物的術(shù)語(yǔ)"分離的"或"純 化的"是指由動(dòng)物體液或分泌物的,由此天然來(lái)源的或細(xì)胞培養(yǎng)物的,如細(xì)胞培養(yǎng)上清液或 者組織或細(xì)胞提取物的復(fù)雜混合物(complex mixture)獲得的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)典型地 為至少50 %純,優(yōu)選至少60 %純,更優(yōu)選至少70 %純,甚至更優(yōu)選至少80 %純,最優(yōu)選至少 90 %純,甚至最優(yōu)選至少95 %純,純度通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定。
[0149] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"分泌成分"或"SC"應(yīng)指可由包括人的動(dòng)物乳腺分泌的分泌成 分,或其變體,包括功能性變體,所述SC為例如從免疫球蛋白分離的糖蛋白,或者如通過(guò)J 鏈(或其變體)介導(dǎo)與免疫球蛋白復(fù)合例如形成分泌型免疫復(fù)合物(secretory immune complex),或者特異性結(jié)合至聚免疫球蛋白受體(plgR)的免疫球蛋白的其它結(jié)構(gòu)。SC可由 天然原料如初乳或乳獲得,不然可合成或通過(guò)重組表達(dá)技術(shù)生產(chǎn)。
[0150] 本文使用的SC如本文所述是特異性非核心巖藻糖基化的。另外,糖基化模式可以 包括或者可以不包括唾液酸化表位。
[0151] 具體地,SC作為唾液酸化的或無(wú)唾液酸化(asialylated)的蛋白制劑而提供。優(yōu) 選根據(jù)本發(fā)明提供的唾液酸化的和無(wú)唾液酸化(asialyl)-聚糖之間的比例為在高度唾液 酸化的制劑中優(yōu)選至少3:1、優(yōu)選至少4:1、或至少5:1、或至少6:1,或至少7:1。包括非唾 液酸化(無(wú)唾液酸化)蛋白質(zhì)的低唾液酸化的制劑(本文還理解為無(wú)唾液酸化制劑)中, 該比例小于1:3,優(yōu)選小于1:4,或小于1:5,或小于1:6,或小于1:7。優(yōu)選地,以此類制劑提 供的SC包含僅無(wú)唾液酸化聚糖或唾液酸化聚糖。
[0152] 優(yōu)選重組SC上唾液酸化-路易斯X表位的相對(duì)含量為至少0.02m〇l/m 〇l SC,更 優(yōu)選至少 0. 03、0. 04、0. 05、0. 06、0. 07、0. 08、0. 09 或 0. lmol/mol SC,更優(yōu)選至少 0. 2、0. 3、 0. 4或0. 5mol/mol SC,甚至更優(yōu)選至少lmol/mol SC,或甚至更高,例如至少2mol/mol SC、 3mol/mol SC、4mol/mol SC、5mol/mol SC、6mol/mol SC、7mol/mol SC、8mol/mol SC、9mol/ mol SC,或至少lOmol/mol SC。具體優(yōu)選的SC制劑包括相對(duì)于每摩爾SC的至少2mol唾液 酸化-路易斯X表位,在某些情況下為至少6mol/mol。
[0153] 本發(fā)明的SC和免疫復(fù)合物具有更加均一的糖基化的優(yōu)勢(shì),可改善粘膜作用,例如 均一的糖基化是由于較少的不同糖型,而無(wú)論是否具有高度非核心巖藻糖基化,例如小于 20個(gè)不同的SC糖型,或小于10個(gè)不同SC糖型,或甚至小于5個(gè)不同SC糖型。
[0154] 雖然分泌性免疫球蛋白的主要功能似乎為促進(jìn)抗原和病原體的排除,但有跡象表 明,分泌的抗體的級(jí)分實(shí)際上"逆行"運(yùn)輸回粘膜。
[0155] 有跡象表明,SIgA在與樹突細(xì)胞(DC)的細(xì)胞表面上的DC-SIGN締合后被內(nèi)吞?;?于這些結(jié)果,提出了 DC-SIGN可能充當(dāng)在識(shí)別和內(nèi)化SIgA和可能的SIgA-抗原復(fù)合物中涉 及的粘膜DC的受體。
[0156] 眾所周知的是,分泌性免疫球蛋白與DC-SIGN的結(jié)合由分泌成分的聚糖介導(dǎo)。 DC-SIGN識(shí)別一系列寡糖配體,包括甘露糖、含復(fù)合高甘露糖的復(fù)合糖和無(wú)唾液酸化的路易 斯血型抗原。
[0157] 為了增強(qiáng)免疫復(fù)合物與樹突細(xì)胞經(jīng)DC-SIGN的結(jié)合,有利的是使用低唾液酸化級(jí) 別而不是高非核心巖藻糖基化的SC用于分泌性免疫球蛋白制劑。此類最低限度的唾液酸 化或甚至無(wú)唾液酸化的SC可用于生產(chǎn)與有機(jī)體應(yīng)免疫耐受(tolerized)的抗原(例如,膳 食抗原、過(guò)敏原)結(jié)合的單克隆或多克隆多聚免疫球蛋白制劑。
[0158] 另一方面,可有利地提供不經(jīng)DC-SIGN結(jié)合至樹突細(xì)胞的分泌性免疫球蛋白制 齊U,或者在結(jié)合DC-SIGN上具有較低效力。這可通過(guò)利用高唾液酸化的非核心巖藻糖基化 SC用于制備本發(fā)明的固有免疫復(fù)合物的制劑來(lái)完成。此類制劑可用于增強(qiáng)分泌性免疫球蛋 白對(duì)某些病毒、毒素和其它病原體結(jié)構(gòu)的誘餌效應(yīng)。
[0159] 唾液酸化路易斯X為在粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上組成型表達(dá)(constitutively expressed)的決定簇并介導(dǎo)這些細(xì)胞的炎性外滲。
[0160] 本發(fā)明免疫復(fù)合物上唾液酸化路易斯X的有無(wú)可通過(guò)干涉或避免妨礙炎性狀況 來(lái)增加利用本發(fā)明免疫復(fù)合物的治療效力或降低副作用。
[0161] 制劑中的唾液酸化程度可通過(guò)分別選擇SC的高或低摩爾唾液酸化(相對(duì)于每摩 爾SC)來(lái)增加或降低。這可在生產(chǎn)型宿主(例如細(xì)胞系、微生物克隆或有機(jī)體)的選擇水平 下進(jìn)行,其可在個(gè)體供體的水平上進(jìn)行,選擇所述個(gè)體供體來(lái)為這些樣品的隨后合并提供 包含各自具有高或低摩爾唾液酸化的SC的分泌物。唾液酸化可通過(guò)本發(fā)明的SC制劑或固 有免疫復(fù)合物的酶或化學(xué)唾液酸化以及去唾液酸化(desialylation)分別來(lái)增加或降低。
[0162] 對(duì)于糖蛋白樣品的唾液酸的絕對(duì)定量(摩爾唾液酸/摩爾糖蛋白),可應(yīng)用 基于質(zhì)譜的糖分析(glycoanalysis)步驟??蛇x地,可使用如歐洲藥典(European Pharmacopoeia)對(duì)于紅細(xì)胞生成素的專著1316中所述的比色法。該方法基于 Svennerholmj 1957, Biochim Biophys Acta. Vol 24,pp 604-11。
[0163] 因此,限定量的SC的純制劑用間苯二酚和鹽酸在KKTC下處理,將形成的藍(lán)色復(fù) 合物用丁醇/乙酸丁酯分離,接著在580nm下光度測(cè)量。光度讀數(shù)通過(guò)用唾液酸生成的校 準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)化成質(zhì)量。
[0164] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"分泌性免疫球蛋白"應(yīng)指可由包括人的動(dòng)物乳腺分泌的免疫球 蛋白,例如通過(guò)PlgR或其變體(包括功能性變體)介導(dǎo)。分泌性免疫球蛋白可由天然原料 如初乳或乳獲得,特別是作為SIgA和/或SIgM,不然可合成生產(chǎn),或通過(guò)重組表達(dá)技術(shù)生 產(chǎn),或通過(guò)來(lái)自天然原料如血楽的多聚免疫球蛋白與重組SC的組合來(lái)生產(chǎn),或通過(guò)重組表 達(dá)技術(shù)生產(chǎn)的多聚免疫球蛋白與來(lái)自天然原料如乳或其它體液的SC的組合來(lái)生產(chǎn)。
[0165] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"重組"是指通過(guò)基因工程或基因重組技術(shù)采用重組表達(dá)體系 如宿主有機(jī)體(例如原核生物或真核生物)在控制的反應(yīng)器體系(contained reactor system)如微生物發(fā)酵或細(xì)胞培養(yǎng)中生產(chǎn)的蛋白質(zhì)(包括多肽),例如采用如酵母、真菌、細(xì) 菌或古菌等的生產(chǎn)型宿主細(xì)胞系或菌株,來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或相應(yīng)組 織等的細(xì)胞系。
[0166] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"表達(dá)體系"或"生產(chǎn)體系"應(yīng)指能夠產(chǎn)生期望品質(zhì)和數(shù)量的蛋白 質(zhì)和免疫復(fù)合物的有機(jī)體如細(xì)胞培養(yǎng)物或較高等的真核生物有機(jī)體如選定的泌乳動(dòng)物,然 而不包括人。優(yōu)選的體系采用用于真核宿主的表達(dá)載體。
[0167] 本文使用的〃表達(dá)載體〃或"載體"定義為在適當(dāng)?shù)乃拗饔袡C(jī)體中克隆重組核苷 酸序列即重組基因的轉(zhuǎn)錄及其mRNA的翻譯所必須的DNA序列。此類表達(dá)載體可包括宿主 細(xì)胞中自主復(fù)制用原點(diǎn)、選擇性標(biāo)記物(如必需氨基酸合成基因或賦予對(duì)抗生素如博來(lái)霉 素(zeocin)、卡那霉素、G418或潮霉素的抗性的基因)、若干限制性酶切位點(diǎn)、適當(dāng)?shù)膯?dòng) 子序列和翻譯終止子,這些組件可操作地連接在一起。
[0168] 術(shù)語(yǔ)"真核宿主"應(yīng)指可培養(yǎng)表達(dá)蛋白質(zhì)的任何真核細(xì)胞、組織或有機(jī)體。具體地, 真核宿主為真核宿主細(xì)胞系。很好理解的是,該術(shù)語(yǔ)不包括人類。表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的SC的 優(yōu)選宿主為真核宿主。
[0169] 術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"或"宿主細(xì)胞系"是指用于表達(dá)重組基因來(lái)生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明使用 的重組蛋白的微生物或細(xì)胞系。優(yōu)選的宿主細(xì)胞選自由哺乳動(dòng)物、鳥類、昆蟲或植物細(xì)胞、 酵母、絲狀真菌或細(xì)菌組成的組。為了生產(chǎn)本發(fā)明的分泌成分,優(yōu)選使用能夠生產(chǎn)具有非核 心巖藻糖基化或路易斯型N-糖基化的糖蛋白的宿主細(xì)胞。已增殖的培養(yǎng)的宿主細(xì)胞宿主 細(xì)胞克隆通常理解為宿主細(xì)胞系。生產(chǎn)型宿主細(xì)胞系通常理解為生物反應(yīng)器中培養(yǎng)即用型 細(xì)胞系,從而獲得工業(yè)規(guī)模的產(chǎn)物。
[0170] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"多聚免疫球蛋白"應(yīng)指至少2、3、4、5或甚至多至10的更高數(shù)量 的免疫球蛋白分子的締合。多聚免疫球蛋白由此被認(rèn)為是至少二聚免疫球蛋白,例如二聚 IgA、三聚、四聚(quatromeric)、五聚(pentameric),例如SIgM,六聚免疫球蛋白,或甚至更 高的聚合物或聚集體。多聚免疫球蛋白可包括通過(guò)共價(jià)鍵或其它相互作用如具有或沒(méi)有J 鏈的靜電、疏水、離子相互作用或親和結(jié)合等彼此相連的免疫球蛋白分子。
[0171] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"多反應(yīng)性免疫球蛋白"應(yīng)指具有至少兩個(gè)特異性的免疫球蛋白, 意指其識(shí)別至少兩個(gè)不同的表位,也稱為交叉反應(yīng)性。典型地,固有免疫系統(tǒng)的多反應(yīng)性免 疫球蛋白將具有至少3、4、5以上相關(guān)(例如關(guān)于生理相關(guān)或藥理活性)特異性來(lái)結(jié)合表位 和抗原,最常見(jiàn)的具有低等或中等親和力。
[0172] 術(shù)語(yǔ)"食物(food) "或"食品(food product) "應(yīng)包括適用于或意欲被動(dòng)物攝取的 任何化合物、制劑、混合物或組合物。這包括為營(yíng)養(yǎng)、保健或食物增補(bǔ)劑(food supplement) 的任何化合物,可被理解為食品的營(yíng)養(yǎng)或功能增補(bǔ)劑的營(yíng)養(yǎng)食物(dietary food)或增補(bǔ)劑 或醫(yī)藥食物,可用作膳食(diet)。典型地,功能性食物幫助防止、或預(yù)防和/或治療與包括 毒素的病原體相關(guān)的病況,或治療身體的生理不平衡。術(shù)語(yǔ)還應(yīng)包括飼料或飼料類產(chǎn)品,可 用作飼養(yǎng)非人動(dòng)物的膳食。食物可為有機(jī)或合成來(lái)源,在包括乳制品的天然或天然樣組合 物或者基于物質(zhì)的人工混合物(已在混合物前適當(dāng)純化)的合成組合物中配制。根據(jù)本發(fā) 明的食品典型地以食品級(jí)品質(zhì)提供。品質(zhì)級(jí)為動(dòng)物可接受的食物的品質(zhì)特性。這包括外部 因素如外觀(大小、形狀、顏色、光澤度和一致性)、質(zhì)地和風(fēng)味。品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)還提供可接受的 最大量的污染物。除了成分品質(zhì)以外,還存在對(duì)滅活或消除病原體的衛(wèi)生要求。重要的是 確保食物加工環(huán)境盡可能清潔,從而為消費(fèi)者生產(chǎn)最安全可能的食物。
[0173] 本文使用的蛋白質(zhì)如分泌成分或免疫球蛋白的術(shù)語(yǔ)"變體"或"功能活性變體"意 指由親本序列通過(guò)在序列內(nèi)或在序列的一個(gè)或兩個(gè)末端插入、缺失或取代一個(gè)或多個(gè)氨基 酸或核苷酸而修飾所獲得的序列,所述修飾不影響(特別是損害)該序列的活性。在優(yōu)選 的實(shí)施方案中,變體為功能性活性變體,其a)為氨基酸或核苷酸序列的生物學(xué)活性片段, 該功能性活性片段包括至少50 %的氨基酸或核苷酸序列的序列,優(yōu)選至少60%,優(yōu)選至少 70 %,更優(yōu)選至少80 %,仍更優(yōu)選至少90 %,甚至更優(yōu)選至少95 %,最優(yōu)選至少97 %、98 % 或99% ;b)源自氨基酸或核苷酸序列,其中至少一個(gè)氨基酸取代、添加和/或缺失,其中功 能性活性變體具有與氨基酸或核苷酸序列同一或者與a)中限定的功能性活性片段同一的 序列,該同一至少50 %,優(yōu)選至少60 %,優(yōu)選至少70 %,優(yōu)選至少80 %,仍更優(yōu)選至少90 %, 甚至更優(yōu)選至少95%,最優(yōu)選至少97%、98%或99% ;和/或c)由氨基酸或核苷酸序列以 及與該氨基酸或核苷酸序列異源的額外的至少一個(gè)氨基酸或核苷酸組成,優(yōu)選其中功能性 活性變體源自在各種基因和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的任何序列的任何自然發(fā)生的變體或與 之同一。此類功能性活性變體具體優(yōu)選包括優(yōu)選的本文所述的糖基化模式,具體為SC的路 易斯型N-糖基化模式和非核心巖藻糖基化。進(jìn)一步優(yōu)選的功能性活性變體的特征在于,它 們能夠結(jié)合多聚免疫球蛋白如IgA二聚體或IgM五聚體形成分泌型免疫復(fù)合物的能力。
[0174] 大多數(shù)SC序列描述為完整的聚免疫球蛋白受體(plgR),出于本發(fā)明的目的,僅這 些序列的胞外部分是相關(guān)的,例如:人SC的序列提供為SEQ ID 1,或包括在下述中或?qū)嵸|(zhì) 上與下述同一的序列:
[0175] UniProtKB :基因座 PIGR_B0VIN,登錄號(hào) P81265(牛 plgR)
[0176] UniProtKB :基因座 PIGR_HUMAN,登錄號(hào) P01833(人 plgR)
[0177] UniProtKB :基因座 PIGR_RAT,登錄號(hào) P15083(大鼠 plgR)
[0178] UniProtKB :基因座 PIGR_M0USE,登錄號(hào) 070570 (小鼠 plgR)
[0179] UniProtKB :基因座 PIGR_RABIT,登錄號(hào) P01832(兔 plgR)
[0180] NCBI REFSEQ :登錄號(hào) NM_174143. 1 (牛 plgR)
[0181] embl 登錄號(hào) X81371. I(TpIgR)
[0182] GenBank GenBank:DAA2148〇. 1(牛 plgR)
[0183] GenBank:AAI49033. 1 (牛 plgR)
[0184] NCBI REFSEQ:登錄號(hào) XM_537133. 2(牛 plgR)
[0185] NCBI 參考序列 NP_002635. 2 (人 plgR)
[0186] NCBI 參考序列 NP_035212. 2(小鼠 plgR)
[0187] NCBI 參考序列 NP_036855. 1 (大鼠 plgR)
[0188] GenBank:AAK69593. 1 (小袋鼠 plgR)
[0189] NCBI 參考序列 NP_001125098. 1 (猩猩 plgR)
[0190] GenBank:EAW93516. 1 (人 plgR)
[0191] GenBank:EAW93515. 1 (人 plgR)
[0192] NCBI 參考序列 NP_999324. I (豬 plgR)
[0193] GenBank:BAJ20784. 1 (人 plgR)
[0194] NCBI 參考序列 XP_001083307. 2 (獼猴(macacca)pIgR)
[0195] NCBI 參考序列 XP_002760783. 1 (狨(Callithrix) plgR)
[0196] GenBank:AAD41688. 1 (負(fù)鼠 plgR)
[0197] GenBank:EDM09843. 1 (大鼠 plgR)
[0198] GenBank: AAI10495. 1 (人 plgR)
[0199] GenBank: AAI10496. 1 (人 plgR)
[0200] NCBI 參考序列 XP_514153. 2 (黑猩猩 plgR)
[0201] GenBank:AAC53585. 1 (小鼠 plgR)
[0202] GenBank:AAQ14493. 1 (雞 plgR)
[0203] NCBI 參考序列 NP_001038109. 1 (雞 plgR)
[0204] GenBank:AAP69598. 1 (雞 plgR)
[0205] GenBank:AAW71994. 1 (雞 plgR)
[0206] GenBank:AAH13556. 1 (小鼠 plgR)
[0207] GenBank:EDL39729. 1 (小鼠 plgR)
[0208] GenBank:CAA76272. 1 (小鼠 plgR)
[0209] GenBank: BAA24431 ? 1 (小鼠 p I gR)
[0210] NCBI 參考序列 NP_001164516. 1 (兔 plgR)
[0211] NCBI 參考序列 XP_001492348. 2(馬 plgR)
[0212] GenBank:AAC41620. 1 (牛 plgR)
[0213] GenBank:AAB23176. 1 (人 plgR)
[0214] GenBank: AAB20203. 1 (人 plgR)
[0215] GenBank:ABK62772. 1 (爪蟾(xenopus)plgR)
[0216] 關(guān)于本文鑒定的多肽序列的〃氨基酸序列同一性的百分比(%)〃定義為候選序列 中的氨基酸殘基與特定多肽序列中的氨基酸殘基的同一性的百分比,在比對(duì)序列并根據(jù)需 要引入空隙以實(shí)現(xiàn)最大序列同一性百分比,且不考慮任何保守置換作為序列同一性的一部 分之后得到。本領(lǐng)域技術(shù)人員可決定用于測(cè)量比對(duì)的適當(dāng)參數(shù),包括實(shí)現(xiàn)覆蓋要比較的序 列全長(zhǎng)的最大比對(duì)所需的任何算法。
[0217] 功能性活性變體可通過(guò)氨基酸或核苷酸序列中的序列改變來(lái)獲得,其中當(dāng)用于本 發(fā)明的組合時(shí),序列改變保持未改變的氨基酸或核苷酸序列的功能。此類序列改變可包括, 但不限于,(保守)置換、添加、刪除、突變和插入。
[0218] 功能性活性SC變體可通過(guò)交換來(lái)自不同物種的SC之間的結(jié)構(gòu)域來(lái)獲得,或者通 過(guò)刪除或添加結(jié)構(gòu)域來(lái)獲得。改變結(jié)構(gòu)域的天然順序(如,1-2-3-4-5,哺乳動(dòng)物SC)也可 導(dǎo)致功能性活性變體(如1-4-3-2-5)。
[0219] 在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中,如上所述的多肽或核苷酸序列可通過(guò)各種化學(xué)技術(shù) 修飾,從而產(chǎn)生具有實(shí)質(zhì)上相同活性的衍生物(如上所述的片段和變體)作為修飾的多肽 或核苷酸序列,且任選地具有其它期望的性質(zhì),如反應(yīng)性、N-糖基化位點(diǎn)和穩(wěn)定性(體內(nèi)或 體外穩(wěn)定性)。期望的性質(zhì)為例如熱穩(wěn)定性和/或胃腸穩(wěn)定性增加,通過(guò)蛋白質(zhì)的PH穩(wěn)定 性和/或蛋白酶(如胰腺的)穩(wěn)定性來(lái)測(cè)量。免疫球蛋白的糖基化模式可影響多個(gè)方面的 SC治療效果,例如穩(wěn)定性、對(duì)蛋白水解攻擊和熱失活的抗性、免疫原性、半衰期、生物活性和 穩(wěn)定性,或結(jié)合多聚免疫球蛋白的能力。
[0220] 本發(fā)明SC的變體可具有改變的氨基酸序列,從而引入額外的糖基化位點(diǎn)。本發(fā)明 的優(yōu)選實(shí)施方案為添加N-糖基化位點(diǎn)。這可通過(guò)基因工程技術(shù)以及化學(xué)和酶手段來(lái)實(shí)現(xiàn)。 將序列基序(Sequence motif)Asn-Xaa-Thr-Xaa (Seq. ID No. 15)或Asn-Xaa-Ser-Xaa(Seq. ID. No. 16)(其中Xaa為除脯氨酸以外的任意氨基酸)引入SC的各種位點(diǎn)中可使得選擇功 能性活性變體具有改進(jìn)的特性(如穩(wěn)定性、結(jié)合至病原體結(jié)構(gòu)、結(jié)合至pig)??墒沟萌嗽?SC具有超過(guò)7個(gè)糖基化位點(diǎn)。
[0221] 多肽或核苷酸序列的變體在本發(fā)明的背景下是功能活性的,如果本發(fā)明組合物包 括變體(但不是原始的)在內(nèi)的活性總計(jì)達(dá)到包括無(wú)序列改變的氨基酸或核苷酸序列(即 原始多肽或核苷酸序列)的根據(jù)本發(fā)明使用的免疫球蛋白或SC活性的至少50%、優(yōu)選至 少60%、更優(yōu)選至少70%、仍更優(yōu)選至少80%、尤其至少90%、特別至少95%、最優(yōu)選至少 99%。
[0222] 功能性活性變體可通過(guò)如上所述改變序列而獲得,并且其特征在于具有與由來(lái)自 該變體所來(lái)源的相應(yīng)序列顯示出的類似的或與人SC類似的生物學(xué)活性,包括修飾對(duì)病原 體的免疫應(yīng)答、結(jié)合至病原體結(jié)構(gòu)和其它分子的能力。
[0223] 但是,術(shù)語(yǔ)"功能性活性變體"包括自然發(fā)生的等位基因變體,以及突變體或其它 任何非自然發(fā)生變體。如本領(lǐng)域已知的,等位基因變體為(多)肽的候補(bǔ)形式,其特征為具 有置換、刪除或添加實(shí)質(zhì)上不改變多肽的生物學(xué)功能的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
[0224] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中,源自如上所述的氨基酸或核苷酸序列的通過(guò)氨基酸交換、 刪除或插入產(chǎn)生的功能性活性變體還可保留或更優(yōu)選改進(jìn)活性。
[0225] 保守置換為在氨基酸家族內(nèi)發(fā)生的那些,涉及它們的側(cè)鏈和化學(xué)性質(zhì)。此類家族 的實(shí)例為具有堿性側(cè)鏈、具有酸性側(cè)鏈、具有非極性脂族側(cè)鏈、具有非極性芳族側(cè)鏈、具有 未帶電的極性側(cè)鏈、具有小側(cè)鏈、具有大側(cè)鏈等的氨基酸。
[0226] 術(shù)語(yǔ)"粘膜免疫球蛋白缺陷"應(yīng)指存在于粘膜樣品中的免疫球蛋白的濃度在正常 或參考范圍之下。這具體指SIgA或者SIgM、或者SIgA和SIgM二者的組合的含量。
[0227] 術(shù)語(yǔ)"分泌性IgA缺陷"或"SIgA缺陷"為分泌性IgA中的缺陷。術(shù)語(yǔ)"分泌性IgM 缺陷"或"SIgM缺陷"為分泌性IgM中的缺陷。
[0228] 這些分泌性免疫球蛋白缺陷可由遺傳傾向、化學(xué)引起,或由粘膜相關(guān)淋巴組織 (mucosa-associated lymphoid tissue, MALT)中SIg生產(chǎn)例如被應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)失調(diào)、損傷或 手術(shù)局部干擾所引起。
[0229] MALT被理解為在人類(男性)中,例如
[0230] ? GALT(腸相關(guān)淋巴組織。淋巴集結(jié)(Peyer's patches)為在小腸內(nèi)襯(lining) 中發(fā)現(xiàn)GALT的成分。)
[0231] ? BALT (支氣管相關(guān)淋巴組織)
[0232] ? NALT (鼻相關(guān)淋巴組織)
[0233] ? LALT (喉相關(guān)淋巴組織)
[0234] ? SALT (皮膚相關(guān)淋巴組織)
[0235] ? VALT (血管相關(guān)淋巴組織)
[0236] ? EALT(由結(jié)膜[CALT]和淚管(Lacrimal Duct) [LDALT]相關(guān)的淋巴組織組成的 眼相關(guān)淋巴組織)
[0237] SIgA缺陷可與SIgM缺陷相關(guān)。
[0238] 分泌性IgA和/或分泌性IgM缺陷的檢測(cè)通過(guò)借助標(biāo)準(zhǔn)免疫分析技術(shù)或借助分子 生物學(xué)技術(shù)測(cè)量分泌物如唾液、宮頸粘液、鼻粘液、胃液、汗、尿或糞便中的SIgA和/或SIgM 來(lái)進(jìn)行。分泌物中的SIgA和/或SIgM的免疫檢測(cè)可通過(guò)ELISA、RIA,通過(guò)基于熒光的免 疫分析、時(shí)間分辨突光分析法(time-resolved fIuorometry)、沉淀試驗(yàn)、池度法、基于表面 等離子體共振的試驗(yàn)和類似的含有或不含有標(biāo)記的體系進(jìn)行。重要的要求是檢測(cè)結(jié)合至免 疫球蛋白分子的分泌成分,從而能夠?qū)IgA和/或SIgM與IgA和/或IgM相區(qū)別。
[0239] SIg缺陷的分子生物學(xué)檢測(cè)可通過(guò)分析J鏈和/或plgR在各組織和細(xì)胞中的表 達(dá)來(lái)進(jìn)行,既可為與這些分子特異的抗體的蛋白水平,或可為與這些分子的基因特異的探 針的基因水平。RNA和DNA均可研究。檢測(cè)方法可基于具有或不具有模板擴(kuò)增(例如PCR) 或信號(hào)擴(kuò)增的雜交來(lái)試驗(yàn)。
[0240] 粘膜SIgA缺陷可為一般性分泌性IgA缺陷的強(qiáng)指示劑。粘膜SIgM缺陷可為一般 性分泌性IgM缺陷的強(qiáng)指示劑。組合的粘膜SIgA/SIgM缺陷為組合的一般性分泌性IgA和 IgM缺陷的強(qiáng)指示劑。
[0241] 如果粘膜SIg的水平與參考值(其為正常值或相同類型的健康受試者的值)相比 小于50%,具體小于40%、30%、20%或10%,則特別指示SIg缺陷。
[0242] 不同個(gè)體中分泌性免疫球蛋白的水平存在相當(dāng)大的變化。個(gè)體免疫狀況的精密測(cè) 量可首先建立在良好的健康和低度至中度生理活性期間數(shù)天至數(shù)周的時(shí)期內(nèi)個(gè)體的常規(guī) SIgA和/或SIgM值的基線?;€還可隨個(gè)體年齡變化。然而該方法對(duì)于患有慢性分泌免 疫缺陷的個(gè)體不可行。因此,也可考慮正常種群的參考值。
[0243] 對(duì)于人類,正常唾液SIgA水平為ll_65mg/dL,正常唾液SIgM水平為lmg/dL。正 常SIg值典型地在健康受試者樣品中確定。降低的唾液免疫球蛋白可存在于患有復(fù)發(fā)性上 呼吸道感染(選擇性IgA和/或IgM缺陷)的兒童中,偶爾存在于食物過(guò)敏的個(gè)體中。
[0244] 如果SIgA濃度小于100毫克SIgA每升或SIgA流速(flow rate)小于50毫克 SIgA每分鐘或SIgA與白蛋白之比小于4,則典型地指示如通過(guò)免疫測(cè)定確定的人唾液樣品 中的 SIgA 缺陷(如 Dwyer 等人,在 Aviation, Space, and Environmental Medicine 中提出 的,2010, 81卷,582頁(yè)之后的內(nèi)容(ff))。如果SIgA濃度小于10毫克每IOOg糞便,則典 型地指示通過(guò)免疫測(cè)定確定的人糞便中的SIgA缺陷。
[0245] 如果SIgA濃度低于50mg SIgA每毫升,則典型地指示如通過(guò)免疫測(cè)定確定的人眼 淚中的SIgA缺陷。
[0246] 如果鼻分泌物中SIgM濃度小于50mg每升和/或唾液中SIgM濃度小于lmg/dL,則 典型地指示如通過(guò)免疫測(cè)定確定的人鼻分泌物或唾液中的SIgM缺陷。
[0247] 需要在僅至少一個(gè)粘膜相關(guān)淋巴組織的區(qū)室中發(fā)現(xiàn)SIg的降低水平,從而定量 SIg缺陷。
[0248] SIgA缺陷偶爾可在其中還確定SIgMa缺陷的樣品中確定。因此,包括SIgA和SIgM 二者的本發(fā)明的制劑優(yōu)選用于處于SIgA和SIgM缺陷的風(fēng)險(xiǎn)的受試者。
[0249] 關(guān)于免疫球蛋白缺陷的術(shù)語(yǔ)"粘膜"是指如在粘膜樣品,例如從受試者的唾液、胃 液、宮頸粘液、鼻粘液、腸道灌洗液(gut lavage)、胃液、支氣管灌洗液、尿、淚和糞便中獲取 的樣品中確定的免疫球蛋白的水平。
[0250] 關(guān)于用于治療受試者的制劑或相應(yīng)的制劑品的投與或施涂或者其它粘膜用途的 術(shù)語(yǔ)"粘膜"是指經(jīng)粘膜途徑的投與,包括全身或局部投與,其中活性成分通過(guò)與粘膜表面 接觸而獲取。這包括口、鼻、陰道、直腸、和支氣管投與,和制劑品如液劑、糖漿劑、錠劑、片 齊IJ,例如泡騰片劑、噴霧劑、吸入器制劑品、粉劑、速溶粉、顆粒劑、栓劑、膠囊劑、霜?jiǎng)⒑齽?凝膠劑、滴劑、懸浮劑、乳劑、或包括乳制品和口香糖等的食品。
[0251] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"受試者"是指任何動(dòng)物,其在本文中優(yōu)選包括哺乳動(dòng)物,特別是 人,預(yù)期對(duì)其的診斷、篩選、監(jiān)控或治療。受試者可處于某種病況的風(fēng)險(xiǎn),例如,患有病況的 患者,或者對(duì)其來(lái)說(shuō)病況有待決定或病況的風(fēng)險(xiǎn)有待決定。本文使用的術(shù)語(yǔ)"患者"總是包 括健康受試者。在某些實(shí)施方案中,本文公開的方法可包括選擇需要SIg增補(bǔ)治療的受試 者,例如具有證實(shí)的SIg缺陷的受試者,并根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步治療該受試者。
[0252] 術(shù)語(yǔ)"處于……(某些病況如SIg缺陷或粘膜免疫球蛋白缺陷)的風(fēng)險(xiǎn)",是指受 試者例如通過(guò)某種傾向而潛在發(fā)展此類病況,或已經(jīng)在包括先天或后天狀態(tài)的各種階段遭 受此類病況,特別是與其它誘發(fā)病況或其它狀況相關(guān)的暫時(shí)性疾病或并發(fā)癥作為此類免疫 球蛋白缺陷的結(jié)果。
[0253] 風(fēng)險(xiǎn)確定和診斷粘膜Ig缺陷在還未診斷出Ig缺陷的受試者中特別重要。因而該 風(fēng)險(xiǎn)確定包括能夠預(yù)防性治療的早期診斷。
[0254] 具體地,本發(fā)明的制劑用于具有商風(fēng)險(xiǎn)的患者,例如無(wú)癥狀的粘I旲Ig缺陷的商可 能性(例如,4歲以下的兒童,手術(shù)前后不久,大量物理應(yīng)激如高效運(yùn)動(dòng)或工作前后、或者具 有病原體感染風(fēng)險(xiǎn)增加的旅行)。
[0255] 根據(jù)本發(fā)明的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和特別是粘膜Ig缺陷治療特別指示口、喉、鼻和耳、眼和 食道、胃和結(jié)腸道的傳染病。
[0256] 進(jìn)一步優(yōu)選的用途為由包括微生物物質(zhì)或有機(jī)體等的病原體、抗原或致病劑如毒 素引起的病況的預(yù)防。例如,住院患者可能需要增補(bǔ)他們的免疫系統(tǒng)來(lái)減少醫(yī)源性感染 (hospital-acquired infection)的風(fēng)險(xiǎn)。接受根據(jù)本發(fā)明的食物增補(bǔ)劑的初生人類或動(dòng) 物如果不能從母親或各自的乳母獲得足夠的母乳也可具有較高的存活機(jī)會(huì)。此外,動(dòng)物和 人中腸致病性疾病的風(fēng)險(xiǎn)可通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的食品減少。具體地,受試者遭受SIg缺陷時(shí), 病原體可減少劇毒作用,即致病劑的劑量激發(fā)時(shí)的病況,否則不會(huì)引起此類病況。根據(jù)本發(fā) 明的制劑因而具體提供預(yù)防處于SIg缺陷的風(fēng)險(xiǎn)或遭受SIg缺陷的受試者中的此類巨毒作 用。
[0257] 因此,本發(fā)明是指生產(chǎn)如上所述的免疫復(fù)合物制劑的新方法,其具有很大的優(yōu)勢(shì) 來(lái)足夠通過(guò)工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的量提供穩(wěn)定的高品質(zhì)制劑。提供具有改進(jìn)品質(zhì)的新的重組SC 和免疫復(fù)合物制劑。
[0258] 從而,可提供固有免疫復(fù)合物,其具體用作食品,恢復(fù)和維持生理平衡或出于包括 治療和預(yù)防性用途在內(nèi)的醫(yī)療目的的健康產(chǎn)品。
[0259] 結(jié)果證明,非核心巖藻糖,具體為路易斯聚糖,還作為有機(jī)體的固有免疫的一部分 而起到重要作用。詳細(xì)研究說(shuō)明了病原體結(jié)構(gòu)如表面抗原、毒素或受體與宿主的聚糖結(jié)構(gòu) 之間的相互作用。
[0260] 特別地,路易斯糖基化可與附著于宿主細(xì)胞的幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)相互作用。超過(guò)80%的幽門螺桿菌(H.pylori)菌株表達(dá)II型路易斯抗原(LeX 和/或LeY),其中一半表達(dá)兩種抗原。較小比例的幽門螺桿菌菌株表達(dá)I型路易斯血型抗 原(LeA和/或LeB),極少數(shù)表達(dá)唾液酸化-LeX。
[0261] 類似地,唾液酸化-LeX在與感染心內(nèi)膜炎相關(guān)的某些口腔細(xì)菌如化膿鏈球菌 (Streptococcus pyogenes)、牙銀卩卜啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、伴放線菌放 線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)和侵蝕艾肯菌(Eikenella corrodens) 的細(xì)胞表面上表達(dá)。
[0262] 諾如病毒(Noroviruses)是例如急性腸胃炎的誘發(fā)劑(causative agents)。它 們結(jié)合至宿主細(xì)胞上的組織-血型抗原(HBGAs),即ABH抗原和路易斯抗原,其中1型和 2型糖類核心結(jié)構(gòu)構(gòu)成抗原性不同的變體。人諾如病毒識(shí)別唾液酸化路易斯X擬糖蛋白 (neoglycoprotein)〇
[0263] 艱難梭菌毒素A和腸致病性大腸桿菌的親密素接合至SC的半乳糖基和/或唾液 酸殘基。已顯示粘膜樹突細(xì)胞上的DC-SIGN充當(dāng)推定的SIgA受體,并且樹突細(xì)胞能夠因而 與粘膜表面的免疫監(jiān)督中的M細(xì)胞合作。
[0264] 本發(fā)明說(shuō)明了以下發(fā)現(xiàn):SC的人樣糖基化可發(fā)現(xiàn)于非人物種的選定的個(gè)體中,且 此類人樣SC優(yōu)選用于與具有用于穩(wěn)定人樣SC并保護(hù)分泌性免疫球蛋白天然功能的天然糖 基化模式的天然免疫球蛋白組合。結(jié)果證明,在相同物種內(nèi)SC的糖基化模式廣泛變化,因 而,典型用于制備奶制品的大供體池不會(huì)在分離的SC上包含顯著水平的具有路易斯-表位 的N-糖基化。此類常見(jiàn)的大規(guī)模池不會(huì)用作出于本發(fā)明目的的原料。然而,在某些個(gè)體中, SC可具有人樣的高水平路易斯表位。那些個(gè)體將具有資格制備可用作大規(guī)模制造根據(jù)本 發(fā)明的免疫復(fù)合物的原料的大型生產(chǎn)池??蛇x地,相應(yīng)的人樣SC可通過(guò)重組生產(chǎn)方法來(lái)生 產(chǎn)。由原料獲得的SC接著與IgA或IgM結(jié)合,IgA或IgM具體包括具有天然糖基化模式的 多聚免疫球蛋白分子,特別是包括被非核心巖藻糖基化的免疫球蛋白鏈的那些。多聚免疫 球蛋白可源自天然原料如乳或血漿或者重組生產(chǎn)??蛇x地,包括SC和免疫球蛋白的本發(fā)明 免疫復(fù)合物可從大型生產(chǎn)池直接分離純化,例如選擇該免疫復(fù)合物的內(nèi)容物(content)為 非核心巖藻糖或路易斯表位。因此,可制備包括穩(wěn)定化的SC達(dá)到提供貯存穩(wěn)定產(chǎn)物的程度 的免疫復(fù)合物制劑,或具有提高的體內(nèi)穩(wěn)定性而導(dǎo)致粘膜和/或半衰期增加的免疫復(fù)合物 制劑。
[0265] 糖基化變化可在生產(chǎn)SC的細(xì)胞或有機(jī)體的不同生理狀態(tài)如感染、炎癥因子的 存在、食物和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)、應(yīng)激等下發(fā)生?;旌衔镏刑腔兓牧硪粊?lái)源可為不同的遺 傳背景以及產(chǎn)生SC的個(gè)體有機(jī)體或細(xì)胞的組成(例如物種、種屬、血型、PlgR基因型和 單倍型等)。適合確定糖基化模式的分析方法例如由Deshpande等人描述(J. Proteome Res.2010, 9, 1063-1075)。
[0266] 人乳包含路易斯表位,并且來(lái)自豬、馬和其它物種的乳報(bào)道稱包含具有路易 斯-抗原的糖蛋白。哺乳動(dòng)物a 1,2-和a 1,3/4-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶包括在A、B和H路易斯 血型抗原以及路易斯-血型-相關(guān)的糖類抗原(即,LeX、LeY、LeA、LeB、唾液酸化-LeX和 唾液酸化-LeA)合成的最后的步驟中。但是,不能在工業(yè)規(guī)模上提供非核心巖藻糖基化的 或路易斯糖基化的具有免疫球蛋白的SC或SC免疫復(fù)合物。
[0267] 出乎意料地可鑒定個(gè)體表達(dá)體系,例如細(xì)胞克隆或動(dòng)物、重組有機(jī)體或微生物,所 述個(gè)體表達(dá)體系產(chǎn)生比SC糖型(游離或結(jié)合至免疫球蛋白)的不均勻混合物中的平均值 明顯更多的非核心路易斯-巖藻糖基化SC與核心-巖藻糖基化SC。個(gè)體克隆或動(dòng)物之間 的差異可意想不到的高。
[0268] 出乎意料的發(fā)現(xiàn)是,非核心巖藻糖基化起到將重組SC結(jié)合至艱難梭菌毒素A的作 用。這與 Perrier 等人(2006J Biol. Chem. vol. 281 (20),pp. 14280-14287)得出巖藻糖殘 基不涉及在締合中的結(jié)論形成對(duì)照。
[0269] 另一出乎意料的發(fā)現(xiàn)是某些糖基化基序的水平可與SC中和某些病原體抗原的效 價(jià)相關(guān)。
[0270] 更出乎意料的發(fā)現(xiàn)是結(jié)合至受體DC-SIGN的水平在個(gè)體乳樣品之間強(qiáng)烈變化,并 且SC與DC-SIGN的結(jié)合受路易斯聚糖的影響,而無(wú)論復(fù)合的含高甘露糖的聚糖存在與否。
[0271] 為了提供人樣SC,非人乳可用作改進(jìn)的SC的來(lái)源。分析從個(gè)體動(dòng)物的乳樣品中分 離的SC或免疫復(fù)合物的非核心巖藻糖或路易斯-表位的摩爾含量。動(dòng)物可或不可對(duì)某些 人或獸(veterinary)病原體免疫來(lái)提供超免疫乳。
[0272] 動(dòng)物可通過(guò)遺傳手段如pig-受體表達(dá)的試驗(yàn)、plgR單倍型的試驗(yàn)和/或特定巖 藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因如FUT3、4、5、6、7、9、10、11和/或其它糖基轉(zhuǎn)移酶(如P -3-半乳糖基 轉(zhuǎn)移酶或¢-4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶)來(lái)預(yù)篩產(chǎn)生更多SIgA或更多特定糖基化的可能性,并且 可出于此目的來(lái)飼養(yǎng)種群。
[0273] 接著鑒定這些動(dòng)物并選擇適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)產(chǎn)物。
[0274] 如上所述包括核心巖藻糖基化的或路易斯_巖藻糖基化的SC的表達(dá)產(chǎn)物接著優(yōu) 選合并,且用作根據(jù)本發(fā)明的免疫復(fù)合物的制劑的來(lái)源。
[0275] 實(shí)際上,根據(jù)本發(fā)明使用的來(lái)自除人母乳以外的來(lái)源的人樣SC與對(duì)多種病原體 具有廣譜中和活性的人天然SC相比具有類似的或甚至改進(jìn)的性質(zhì)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"病原 體"總是包括微生物有機(jī)體和毒素,還包括細(xì)菌、真菌、病毒和原生動(dòng)物細(xì)胞和產(chǎn)物,特別是 人或獸(veterinarian)病原體。
[0276] 優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的制劑包括高滴定度的免疫球蛋白相關(guān)混合物,維持它們的固有 功能,包括口服后的粘膜通過(guò)(mucosal passage)。
[0277] 根據(jù)本發(fā)明的免疫復(fù)合物制劑由于在SC的N-糖基化模式中的標(biāo)準(zhǔn)化大量非核心 巖藻糖或路易斯表位而具有高效價(jià)的優(yōu)勢(shì)。從而可顯著增加抗病原作用,包括抗微生物或 抗毒素作用。
[0278] 主要的選擇標(biāo)準(zhǔn)涉及已證實(shí)賦予期望的免疫力的路易斯表位的類型和數(shù)量。優(yōu) 選的路易斯表位為L(zhǎng)eB表位,其顯著增加超過(guò)天然原料中的平均流行性(prevalence)。還 優(yōu)選在SC上發(fā)生路易斯X或唾液酸化路易斯X表位。優(yōu)選的乳源產(chǎn)物的相對(duì)增加為至少 ELISA信號(hào)的增加,該信號(hào)超過(guò)來(lái)自未選擇個(gè)體的合并來(lái)源(其中池大小源自至少100個(gè)個(gè) 體)的信號(hào)的以非選擇樣品的標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)的2倍。典型地,源自特別是反芻動(dòng)物如牛、綿羊或 山羊的至少100個(gè)個(gè)體的乳腺產(chǎn)物的池具有明顯低于0. Olmol非核心巖藻糖或路易斯表位 /molSC的平均值,通常低于0. 005m〇l/m〇l,在大多數(shù)情況中,甚至是由標(biāo)準(zhǔn)ELISA技術(shù)確定 的不可檢測(cè)的路易斯-抗原。
[0279] 然而,本發(fā)明提供優(yōu)選選擇的個(gè)體、個(gè)體樣品或者乳腺分泌物、培養(yǎng)上清液或細(xì) 胞提取物的池,根據(jù)它們的關(guān)于非核心巖藻糖或路易斯表位的品質(zhì)來(lái)選擇,其量為至少 0. Olmol/mol SC,具體為非核心巖藻糖或路易斯表位的理論值的至少1%、優(yōu)選至少5%或 至少10%。甚至更優(yōu)選的選擇根據(jù)較高的非核心巖藻糖或路易斯糖基化水平來(lái)進(jìn)行,例如 至少 0? Olmol/mol SC,優(yōu)選至少 0? 02mol/mol SC,更優(yōu)選至少 0? 03、0. 04、0. 05、0. 06、0. 07、 0? 08、0. 09 或 0? lmol/mol SC,更優(yōu)選至少 0? 2、0. 3、0. 4 或 0? 5mol/mol SC,甚至更優(yōu)選至少 1111〇1/1]1〇13(],或甚至更高,例如至少21]1〇1/1]1〇13(],至少31]1〇1/1]1〇13(],4至少1]1〇1/1]1〇13〇, 或至少 5mol/mol SC,至少 6mol/mol SC,至少 7mol/mol SC,至少 8mol/mol SC,至少 9mol/ mol SC,或至少lOmol/mol SC。在具體情況中,N-糖基化位點(diǎn)的理論數(shù)總計(jì)為2(天然牛 SC)、3(天然馬SC)和7(天然人SC)mol/mol。根據(jù)本發(fā)明,特別優(yōu)選根據(jù)路易斯表位的量 進(jìn)行選擇,該量為至少1%。優(yōu)選糖基化位點(diǎn)理論數(shù)的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10%,更優(yōu) 選至少20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或90 %,上至糖基化位點(diǎn)的理論數(shù)。
[0280] 非核心巖藻糖的量可超過(guò)N-糖基化位點(diǎn)的理論數(shù),例如通過(guò)每個(gè)N-糖基化位點(diǎn) 多個(gè)巖藻糖基化,從而獲得基于摩爾的比N-糖基化位點(diǎn)的數(shù)量多的路易斯表位,例如至少 1. 1倍、優(yōu)選至少1. 2倍、或至少1. 3倍、至少1. 4倍、至少1. 5倍、至少1. 6倍、至少1. 7倍、 至少1. 8倍、至少1. 9倍、或至少2倍,在具體情況中,該量甚至更高,例如至少3倍、至少4 倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍或至少9倍,例如多至N-糖基化位點(diǎn)的理論量 的10倍。
[0281] 選擇可基于確定來(lái)自個(gè)體的樣品或來(lái)自選擇池的樣品(即合并樣品)來(lái)進(jìn)行,其 中所述池源自10個(gè)以上的個(gè)體。已根據(jù)選擇標(biāo)準(zhǔn)證實(shí)為非核心巖藻糖或路易斯-陽(yáng)性的材 料可接著合并來(lái)提供作為根據(jù)本發(fā)明的免疫復(fù)合物制劑的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)用的原料的生產(chǎn) 池。具有經(jīng)證明的高品質(zhì)糖基化譜的生產(chǎn)池具有優(yōu)選大小為至少10,更優(yōu)選至少50、100、 500、L 000 或 2. 000 個(gè)供給,或優(yōu)選至少 10、50、100、500、1000、2000、10, OOOor 20, 000 升。 作為品質(zhì)控制措施,相關(guān)的糖基化的存在通常通過(guò)過(guò)程中控制(in-process controls)和 /或終產(chǎn)物控制來(lái)證實(shí)。終產(chǎn)物典型地根據(jù)期望的糖基化模式標(biāo)準(zhǔn)化。
[0282] 用于確定SC和/或SIgA或SIgM上的非核心巖藻糖的示例性試驗(yàn)體系記 載于下述實(shí)施例部分。高度選擇性的確定方法是指通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)RP-ESI-MSMS(也稱為 RP-HPLC-ESI-MSMS,反相-高效液相色譜-電噴射離子化-串聯(lián)質(zhì)譜法)的聚糖分析。非 核心巖藻糖或路易斯-型巖藻糖基化的水平或程度可基于下列原則來(lái)試驗(yàn):
[0283] 聚糖譜和由此的附著至給定糖基化位點(diǎn)的寡糖的特定組合物的量可通過(guò)源 自 SC 的糖膚的質(zhì)譜法來(lái)確定(Stadlmann 2008, Proteomics 8, 2858-2871 ;Wuhrer 2007, Proteomics 7,4070-4081)。在巖藻糖殘基附著至具有多個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)的SC 上的聚糖的觸角(路易斯糖基化)的特定情況中,可應(yīng)用下列策略。
[0284] 在SDS-PAGE上分離SIgA-制劑,并洗脫SC-帶段(band)。SC被S-烷基化并用胰 蛋白酶或其它適當(dāng)?shù)牡鞍酌赶悠妨硗庥媚軌蚓唧w將a-1,6-鍵的巖藻糖殘基移至 最內(nèi)的GIcNAc殘基(核心-巖藻糖基化)的巖藻糖苷酶進(jìn)行處理。此類酶的實(shí)例為來(lái)自 牛腎的巖藻糖苷酶。
[0285] 接著,肽和糖肽的所得混合物優(yōu)選在通過(guò)例如反相色譜的色譜分離后通過(guò)質(zhì)譜分 析。在適當(dāng)選擇蛋白酶、色譜柱和溶劑梯度下,各糖基化位點(diǎn)由峰表示。Asn-連接的糖基化 的潛在位點(diǎn)可從蛋白質(zhì)的氨基酸序列推斷出。
[0286] 由于在大部分反相柱上,例如在Waters BioBasic C18柱上的保留僅依賴于肽部 分,該峰覆蓋給定肽的所有糖型和由此的糖基化位點(diǎn)。
[0287] 可通過(guò)幾種手段鑒定給定位點(diǎn)的糖肽:
[0288] 1.)由于通常觀察的異質(zhì)性,它們形成差別在于質(zhì)量的一系列峰,例如己糖 (162, 05Da)、唾液酸(291. 09Da)、N-乙酰基己糖胺(203. 08Da)或巖藻糖殘基(146. 06Da)。
[0289] 2. ) ESI-或MLDI-MS的MSMS碎片可揭示聚糖序列和潛在肽的質(zhì)量。
[0290] 3.)通過(guò)肽的酶去除:N-糖苷酶(F或A)將產(chǎn)生包含Glu (谷氨酸)代替Gln (谷 氨酰胺)殘基的去糖基化肽,結(jié)果產(chǎn)生IDa的質(zhì)量差。該去糖基化肽的質(zhì)量必須滿足第1.) 點(diǎn)和第2.)點(diǎn)中獲得的或使用的假設(shè)。
[0291] 一旦鑒定了糖基化峰,對(duì)應(yīng)于特定糖肽物質(zhì)的峰"體積",即峰值面積由可考慮 通常發(fā)生在兩個(gè)以上的電荷態(tài)中的一個(gè)分析物的適當(dāng)方法測(cè)量。峰體積可直接翻譯成 糖型離子化的摩爾比例,因而糖肽的檢測(cè)由肽部分控制(Stadlmann, 2008, Proteomics 8, 2858-2871)。
[0292] 由發(fā)生在特定位點(diǎn)上的糖型列表計(jì)算巖藻糖基化聚糖的摩爾分?jǐn)?shù)。加入不同位點(diǎn) 的結(jié)果來(lái)達(dá)到其中特定結(jié)構(gòu)性質(zhì)發(fā)生在特定SC樣品上的摩爾比例。核心-巖藻糖除去的 完整性可例如通過(guò)分析由多孔石墨碳上的色譜伴有MS檢測(cè)的釋放的N-聚糖來(lái)證實(shí)(Pabst 2007, Anal. Chem. 79, 5051-5057)。
[0293] 對(duì)于篩選大量個(gè)體來(lái)源或制劑,可使用簡(jiǎn)單快速的試驗(yàn),例如側(cè)流(lateral flow)測(cè)定。另外,或可選地,使用ELISA測(cè)定,采用路易斯-型糖基化特異性配體,如對(duì)抗 各種路易斯表位(如,抗-路易斯a、抗-路易斯b、抗-路易斯X、抗-路易斯y、抗-唾液酸 化路易斯X)的抗體或可選的支架連接子(scaffold binders)、人凝集素DC-SIGN、抓獲樹 突細(xì)胞_特異性胞間粘附分子-3的非整聯(lián)蛋白(也稱作CD209(分化抗原簇209))??墒?用的粘結(jié)路易斯表位的其它凝集素的實(shí)例為同工凝集素A、橙黃網(wǎng)孢盤菌凝集素(Aleuria aurantia agglutinin)、血栓調(diào)節(jié)素(thrombomodulin)、Iangerin(朗格素,朗格漢斯細(xì)胞 產(chǎn)生的特異性凝集素)、清除劑受體(scavanger receptor) C-型凝集素、E-選擇素、唾液酸 結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素(siglecs)、SIGN-受體和人輪狀病毒的病毒蛋白8 (VP8)。
[0294] 作為陽(yáng)性對(duì)照,典型的使用人材料。作為陰性對(duì)照,使用非-巖藻糖基化蛋白,例 如來(lái)自合并的商購(gòu)(即非選擇的、非人的)來(lái)源的BSA或任何分泌性免疫球蛋白制劑,所述 來(lái)源在任何情況下包括相對(duì)于每摩爾SC小于0. Olmol非核心巖藻糖的平均值。將SC和/ 或分泌性免疫球蛋白制劑中非核心巖藻糖或路易斯表位的確定結(jié)果典型地與具有預(yù)定量 的相對(duì)于每摩爾SC或者SIgA或SIgM的非核心巖藻糖如0. Olmol/mol (+/-20% )的參考相 比較。因此,結(jié)果可為半定量的,且是指"高于"或"小于"參考量??蛇x地,定量確定將是 可能的,例如通過(guò)利用一系列包括不同水平的非核心巖藻糖基化或路易斯表位的參考進(jìn)行 適當(dāng)?shù)男U?。?biāo)準(zhǔn)效價(jià)測(cè)試是指艱難梭菌毒素A、螺桿菌(Helicobacter)、大腸桿菌毒素、 彎曲桿菌(Campylobacter)、志賀氏桿菌(Shigella)、輪狀病毒、諾如病毒的至少之一的中 和活性或粘結(jié)試驗(yàn),或與脂多糖、脂磷壁酸、肽聚糖、鑰孔戚血藍(lán)蛋白、DC-SIGN、同工凝集素 A、橙黃網(wǎng)孢盤菌凝集素、血栓調(diào)節(jié)素、朗格素、清除劑受體C-型凝集素、E-選擇素、唾液酸 結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素、SIGN-受體的競(jìng)爭(zhēng)、粘結(jié)抑制或其它相互作用。
[0295] 優(yōu)選供體表達(dá)體系由泌乳期的非人雌性個(gè)體構(gòu)成,以獲得來(lái)自供體的乳或乳級(jí)分 的分泌成分和任選的免疫復(fù)合物制劑。示例性原料為例如分別以富集形式含有游離的分泌 成分、多聚免疫球蛋白和免疫復(fù)合物的乳清或干燥乳清。優(yōu)選的原料可為免疫球蛋白中富 集的至少2倍、3倍、4倍或5倍。
[0296] SC或免疫復(fù)合物可由純化形式的此類原料獲得,從而制備根據(jù)本發(fā)明的免疫復(fù)合 物。
[0297] 可選地用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的免疫復(fù)合物的表達(dá)體系還可為重組表達(dá)體系,其中 所有物種和分類群的重組宿主細(xì)胞,例如重組真核宿主。
[0298] 因此,氨基酸序列,如SEQ ID 1或其任意功能性活性變體序列,或編碼SC的核苷 酸序列可用于制備重組宿主。所述序列優(yōu)選編碼哺乳動(dòng)物來(lái)源如人、牛、山羊、綿羊的SC或 非人SC序列的人源化變形(versions),或嵌合體的,總是包括功能性變體。相應(yīng)的序列信 息提供于圖中,或可酌情來(lái)源于公開的數(shù)據(jù)庫(kù)。
[0299] 重組SC迄今為止已在不能向分泌成分的聚糖添加路易斯-型巖藻糖基化的宿主 中生產(chǎn)。常用的純化的重組SC用宿主為CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、小鼠J558L細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和 煙草植物。
[0300] 重組SC可通過(guò)將plgR的完整基因如人plgR引入宿主細(xì)胞,隨后表達(dá)跨膜蛋白 PlgR,接著將胞外部分SC切割并釋放至培養(yǎng)上清液中來(lái)生產(chǎn)??蛇x的表達(dá)為SC的核苷酸 序列的轉(zhuǎn)錄,即僅胞外結(jié)構(gòu)域,例如編碼SEQ ID 1的氨基酸序列。在所有情況中,重組SC 的表達(dá)允許生產(chǎn)條件的精確選擇,確保終產(chǎn)物的均一 C-末端。
[0301] 還允許根據(jù)需要選擇翻譯終止位點(diǎn)。優(yōu)選要表達(dá)的SC基因上的終止密碼子位于 編碼最后的胞外免疫球蛋白-樣結(jié)構(gòu)域(即人SC中的結(jié)構(gòu)域5)和跨膜區(qū)之間。然而,本 發(fā)明的重組SC可甚至更短,例如包括小于5個(gè)完整結(jié)構(gòu)域,或小于4個(gè)結(jié)構(gòu)域,或小于3個(gè) 結(jié)構(gòu)域,或小于2個(gè)結(jié)構(gòu)域,例如至少第一結(jié)構(gòu)域,只要其能夠結(jié)合并包含所需水平的非核 心巖藻糖即可。
[0302] SEQ ID 1中前18個(gè)氨基酸包括信號(hào)肽,其可被不同信號(hào)肽所取代,取決于所使用 的宿主細(xì)胞或有機(jī)體以及所需的分泌效率。對(duì)于通過(guò)化學(xué)合成生產(chǎn)或細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)SC,不需 要信號(hào)肽(例如對(duì)于大腸桿菌內(nèi)含體中非糖基化形式的生產(chǎn))。蛋白質(zhì)還可修飾成在SEQ ID 1的C-末端包含額外的氨基酸。
[0303] 該蛋白質(zhì)可在核酸中的需要位置處通過(guò)終止密碼子來(lái)終止,該位置分別在氨基酸 G545之后,優(yōu)選位于K566和E607之間(包括這些位點(diǎn))的任意氨基酸位點(diǎn),更優(yōu)選在R603 和E607之間(包括這些位點(diǎn)),或者在E607之后。最優(yōu)選SC在R603之后終止。編號(hào)指的 是 SEQ ID 1。
[0304] 優(yōu)選地,本發(fā)明的SC制劑為均一的,其中至少80%、至少90%或至少95%,多至 100 %的SC分子具有相同的C-末端。
[0305] 重組SC的聚糖模式依賴于宿主物種、宿主有機(jī)體、組織來(lái)源和基因工程細(xì)胞的生 理狀態(tài)。
[0306] 優(yōu)選宿主細(xì)胞選自由人細(xì)胞如PerC. 6、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、倉(cāng)鼠崽腎細(xì)胞、鼠類細(xì) 胞、鳥類細(xì)胞系、細(xì)菌細(xì)胞、酵母真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞組成的組。從而,重組SC可 獲得期望的非核心巖藻糖基化或路易斯型N-糖基化。
[0307] 在本發(fā)明的制劑中非核心巖藻糖基化的程度可通過(guò)選擇具有高非核心巖藻糖基 化(相對(duì)于每摩爾SC)的SC來(lái)增加。這可在生產(chǎn)型宿主的選擇水平下操作(這樣的篩選 用于細(xì)胞系、微生物克隆或有機(jī)體),其還可在個(gè)體供體被選擇為提供包含具有高摩爾非核 心巖藻糖基化的SC的分泌物用于這些樣品的隨后合并的水平下操作。巖藻糖基化可通過(guò) 本發(fā)明的SC制劑或固有免疫復(fù)合物的酶或化學(xué)巖藻糖基化增加。
[0308] 正常組織顯示在某些部位(例如結(jié)腸、睪丸)和在某些發(fā)育階段(胎兒抗原)期間 的路易斯表位的表達(dá)。因此,來(lái)自某些部位的某些細(xì)胞系,例如結(jié)腸癌細(xì)胞系表達(dá)路易斯抗 原。Caco-2細(xì)胞在分化期間僅表達(dá)H型1血型抗原和少量LeB。已開發(fā)各種細(xì)胞系(HT-29、 AGS、Kato III、HuTu-80和HEp-2)以及原代胃細(xì)胞用于路易斯抗原表達(dá)。然而,它們中的多 數(shù)難以培養(yǎng)且會(huì)由于它們固有的遺傳不穩(wěn)定性而不適于作為生產(chǎn)相應(yīng)的路易斯-型N-糖 基化的生產(chǎn)型宿主。
[0309] 植物N-聚糖為寡甘露糖型(Man>5GlcNAc2)、少甘露糖(paucimannosidic)型和 復(fù)合型的形式。不僅已在單子葉植物和雙子葉植物中檢測(cè)位于N-聚糖的觸角的LeA部分, 而且還在小立碗蘚(Physcomitrella patens)(雌雄同株苔蘚)和各種苔蘚類物種中檢測(cè)。 LeA在所有植物組織(花、葉、根和籽苗)中表達(dá),起作用的a l,4-FucT活性在幼嫩組織(葉 和根)中占主導(dǎo)。然而,在植物中表達(dá)的SIgA迄今還未顯示任何路易斯-型糖基化。
[0310] 在能夠產(chǎn)生具有路易斯表位的N-糖基化蛋白質(zhì)的同一宿主中多聚免疫球蛋白 (例如二聚IgA或五聚IgM)與SC的共表達(dá)導(dǎo)致非原生的路易斯糖基化重鏈,因而不優(yōu)選。
[0311] 因此,具體優(yōu)選使用的表達(dá)體系能夠以期望的方式,本質(zhì)上即以遺傳方式,或者通 過(guò)借助相應(yīng)的遺傳修飾如借助重組技術(shù)的后天的或瞬時(shí)能力使糖蛋白糖基化,從而提供相 應(yīng)的糖基化模式。示例性表達(dá)體系例如通過(guò)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶2和3以及3 1,3-半乳糖基 轉(zhuǎn)移酶I、II和V的伴隨表達(dá)而具有增強(qiáng)的生產(chǎn)路易斯-巖藻糖基化N-糖蛋白的能力。
[0312] 工程化為生產(chǎn)非核心巖藻糖基化或路易斯_糖基化寡糖和復(fù)合糖的宿主為例如 生產(chǎn)細(xì)胞系,以表達(dá)各種糖基轉(zhuǎn)移酶如巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,從而生產(chǎn)具有血型相關(guān)抗原的寡 糖、糖蛋白或糖脂。
[0313] 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已記載產(chǎn)生血型相關(guān)的糖基化(如W01995024495A1或Xu等人,參見(jiàn) 上述)。然而,現(xiàn)有技術(shù)的轉(zhuǎn)基因有機(jī)體會(huì)提供伴隨的路易斯-巖藻糖基化IgA或IgM,將 具有過(guò)量的非核心巖藻糖基化和非-天然糖基化模式。因此,免疫復(fù)合物制劑具體地不源 自此類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳。
[0314] 工程化CHO細(xì)胞已記載產(chǎn)生路易斯型巖藻糖基化(L6fling等人, 2008, Glycobiology vol.l8no. 7pp. 494-501)。另外,已描述了具有產(chǎn)生路易斯型巖藻糖 基化N-聚糖的能力的CHO細(xì)胞的功能獲得性突變體(North等人,2010, J Biol Chem. vol 285pp. 5759-5775)。然而,此類宿主細(xì)胞中完整SIgA的表達(dá)將產(chǎn)生具有非天然糖基化的路 易斯-巖藻糖基化免疫球蛋白鏈。此類細(xì)胞可因而在根據(jù)本發(fā)明的適當(dāng)糖基化選擇后 僅用于生產(chǎn)人樣SC。適當(dāng)重組宿主細(xì)胞克隆的選擇如上述乳樣品篩選所記載的進(jìn)行。優(yōu)選 工程化、篩選和選擇比由[ifling等人和North等人記載的更不同的路易斯-型糖基化和更 遺傳穩(wěn)定的突變體。源自此類宿主細(xì)胞的重組SC接著用于制備具有來(lái)自任何來(lái)源的非-路 易斯-巖藻糖基化(即天然糖基化)免疫球蛋白的根據(jù)本發(fā)明的免疫復(fù)合物。
[0315] 具體地,優(yōu)選采用表達(dá)路易斯-糖基化SC的產(chǎn)量為至少lmg/L培養(yǎng)基、優(yōu)選至少 10mg/L、優(yōu)選至少100mg/L、最優(yōu)選至少lg/L的條件在小試驗(yàn)(pilot)或工業(yè)規(guī)模的生物反 應(yīng)器中培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞系。
[0316] 優(yōu)選通過(guò)下列試驗(yàn)測(cè)試根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞的表達(dá)能力或產(chǎn)量:ELISA、活性測(cè) 定、HPLC或示出根據(jù)本發(fā)明的SC或免疫復(fù)合物的量和品質(zhì)的其它適合試驗(yàn)。不僅選擇宿主 細(xì)胞的表達(dá)水平,而且還選擇宿主細(xì)胞的SC的糖基化模式,其能夠提供:例如路易斯a、路 易斯b、路易斯X和路易斯y的至少之一,或其唾液酸化形式發(fā)現(xiàn)于重組SC中。優(yōu)選地,路 易斯X和/或唾液酸化-路易斯X存在于樣品中。更優(yōu)選地,SC上的超過(guò)一種路易斯-抗 原存在于樣品中。
[0317] 優(yōu)選的發(fā)酵技術(shù)為批式、分批補(bǔ)料式(fed batch)或連續(xù)培養(yǎng)如灌注培養(yǎng)。
[0318] 優(yōu)選生產(chǎn)型細(xì)胞系在含有適當(dāng)碳源的礦物質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng),從而進(jìn)一步顯著簡(jiǎn)化 分離過(guò)程。優(yōu)選的礦物質(zhì)培養(yǎng)基的實(shí)例為以下培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基含有可利用的碳源(如葡 萄糖、甘油或甲醇)、含有大量元素(鉀、鎂、鈣、銨、氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽)和微量元素 (銅、碘、錳、鑰、鈷、鋅和鐵鹽,和硼酸)的鹽,和任選的例如為了補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)缺陷型的維生素 或氨基酸。
[0319] 轉(zhuǎn)化細(xì)胞在適于造成SC表達(dá)的條件下培養(yǎng),SC可由細(xì)胞或培養(yǎng)基純化,取決于表 達(dá)體系的性質(zhì)。如技術(shù)人員將會(huì)理解的,培養(yǎng)條件將根據(jù)包括宿主細(xì)胞類型和采用的特定 表達(dá)載體在內(nèi)的因素而變化。
[0320] 如果SC從細(xì)胞分泌,其可使用最新水平的技術(shù)從培養(yǎng)基分離純化。重組表達(dá)產(chǎn)物 的分泌通常由于包括促進(jìn)純化過(guò)程的原因而是有利的,這是由于產(chǎn)物典型地從培養(yǎng)上清液 回收,而不是從蛋白質(zhì)復(fù)合混合物中回收,結(jié)果當(dāng)細(xì)胞破壞時(shí)釋放胞內(nèi)蛋白。
[0321] 培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化株細(xì)胞還可聲波或機(jī)械、酶或化學(xué)破裂,從而獲得包含期望的SC的細(xì) 胞提取物,由此分離純化SC。
[0322] 除了基因工程技術(shù)以外,還可通過(guò)路易斯-糖基化寡糖與SC的化學(xué)配合、酶添加 巖藻糖而在體外SC上產(chǎn)生路易斯抗原、或者借助路易斯-糖基化特異性配體結(jié)合(如與路 易斯抗原特異性結(jié)合的抗體或可選的支架,特異性凝集素如DC-SIGN、血栓調(diào)節(jié)素、來(lái)自翅 莢百脈根(Lotus tetragonolobus)的同工凝集素A和橙黃網(wǎng)孢盤菌凝集素、特定的唾液酸 結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素、選擇素)由合并來(lái)源富集SC或分泌性免疫球蛋白來(lái)提供人樣 SC0
[0323] 用于獲得根據(jù)本發(fā)明的SC或免疫復(fù)合物的分離純化方法可利用溶解度的差異例 如鹽析和溶劑沉淀,分子量的差異例如超濾和凝膠電泳,電荷的差異如離子交換色譜,或可 利用特定的親和力例如親和色譜,或可利用疏水性的差異如反相高效液相色譜,或利用等 電點(diǎn)的差異如等電點(diǎn)聚焦。具體的純化步驟優(yōu)選用于分離單獨(dú)或與免疫球蛋白復(fù)合的任意 SC多肽,為超濾技術(shù),分子截?cái)嘣贗OOkDa至500kDa之間,和沉淀技術(shù)例如用鹽如硫酸銨或 有機(jī)溶劑沉淀。
[0324] 分離純化的SC可通過(guò)常規(guī)方法如免疫印跡或其活性的測(cè)定,例如通過(guò)其結(jié)合二 聚IgA或J鏈的能力或者通過(guò)檢測(cè)特定抗SC的抗血清來(lái)鑒定分析。
[0325] 純化的化合物的結(jié)構(gòu)可由氨基酸分析、氨基末端分析、一級(jí)結(jié)構(gòu)分析和糖分析等 來(lái)定義。優(yōu)選SC化合物可大量地且在特定情況下高純度地獲得,由此滿足用作根據(jù)本發(fā)明 的免疫復(fù)合物的一部分的必要的要求,從而用作藥物組合物中的活性成分。
[0326] 根據(jù)本發(fā)明的免疫復(fù)合物制劑優(yōu)選用作食品,例如為需要其的受試者提供特定的 飲食,所述受試者為例如處于由病原體引起的病況的風(fēng)險(xiǎn)或遭受由病原體引起的病況。
[0327] 進(jìn)一步優(yōu)選的用途為預(yù)防由包括微生物物質(zhì)或有機(jī)體的病原體、抗原或致病劑如 毒素引起的疾病或紊亂。例如,住院患者可需要增補(bǔ)它們的免疫系統(tǒng)來(lái)減少醫(yī)源性感染的 風(fēng)險(xiǎn)。接受根據(jù)本發(fā)明的食物增補(bǔ)劑的初生人類或動(dòng)物如果不能從母親或各自的乳母獲得 足夠的初乳也可具有較高的存活機(jī)會(huì)。此外,動(dòng)物和人中腸致病性疾病的風(fēng)險(xiǎn)可通過(guò)此類 食品減少。
[0328] 根據(jù)本發(fā)明的制劑可用于治療口、喉、鼻和耳、眼和食道、胃和結(jié)腸道的傳染病。
[0329] 適當(dāng)?shù)?,根?jù)本發(fā)明的制劑可提供為制劑品,其任選地提供進(jìn)一步的營(yíng)養(yǎng)素如蛋 白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)和其它生理活性物質(zhì)。
[0330] 根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的示例性制劑包括奶制的乳(dairy milk)和為乳制品副產(chǎn)物的 乳清粉。基于根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)品的乳清另外包括例如血清白蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白、乳鐵 蛋白、乳過(guò)氧化物酶、寡糖、肽、乳糖和礦物質(zhì)。在某些情況中優(yōu)選由超免疫成人的乳或乳清 獲得產(chǎn)物,以使根據(jù)本發(fā)明的制劑包含與疾病有機(jī)體、病原體或疾病相關(guān)抗原的特定基團(tuán) 反應(yīng)的水平些許增加的免疫球蛋白。
[0331] 本發(fā)明具體包括通過(guò)具有天然糖基化模式即在N-聚糖上沒(méi)有路易斯-表位的IgA 或IgM分子穩(wěn)定化路易斯-糖基化功能性人樣SC。
[0332] 穩(wěn)定化免疫復(fù)合物可具有增加的熱穩(wěn)定性和/或胃腸穩(wěn)定性,如通過(guò)pH穩(wěn)定性和 /或蛋白質(zhì)的蛋白酶穩(wěn)定性所測(cè)量的,導(dǎo)致體內(nèi)半衰期增加的恢復(fù)或延長(zhǎng)。穩(wěn)定化作用對(duì)于 粘膜恢復(fù)特別重要。在投與根據(jù)本發(fā)明的制劑時(shí),免疫復(fù)合物的免疫活性可在粘膜中通過(guò) 免疫技術(shù)如ELISA確定。免疫球蛋白在粘膜中增加的水平表明增加的恢復(fù)。
[0333] 根據(jù)本發(fā)明的制劑可進(jìn)一步包括游離的未結(jié)合的SC以及與免疫球蛋白復(fù)合的 SC,這甚至能夠增強(qiáng)其功能性質(zhì)。
[0334] 本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案為根據(jù)本發(fā)明的SC附著至天然抗體,從而提供蛋白水解 穩(wěn)定的、多價(jià)且多特異性的分子,所述分子能夠中和各種病原體抗原。
[0335] 進(jìn)一步優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的免疫復(fù)合物制劑包含5至100% w/w的分泌性免疫球蛋 白(即,與SC復(fù)合的聚免疫球蛋白)。更特別地,該制劑可包含20至70% w/w的分泌性免 疫球蛋白。
[0336] 根據(jù)本發(fā)明的制劑還可優(yōu)選包含其它成分如糖類。糖類優(yōu)選源于乳清蛋白濃縮物 并以0至95% w/w之間的濃度存在于制劑中。更優(yōu)選地,糖類在30至90% w/w之間存在。 糖類提供現(xiàn)成的能源。
[0337] 葡萄糖也優(yōu)選用作糖類添加劑,其可包括在制劑中輔助預(yù)防粉末的聚集并提供另 一形式的糖類。
[0338] 另外優(yōu)選的添加劑為乳清蛋白,其可進(jìn)一步穩(wěn)定化免疫球蛋白制劑、出于營(yíng)養(yǎng)目 的的氨基酸、寡糖,和增強(qiáng)制劑的生理值的物質(zhì)。
[0339] 還可優(yōu)選在根據(jù)本發(fā)明的制劑品中包括抗微生物物質(zhì),例如抗生素,抗病毒 齊II,抗真菌劑,抗寄生蟲劑(antiparasitics),或包括有機(jī)酸、植物精油、陽(yáng)離子、膠體銀 (collodial silver)或季銨鹽等的殺微生物物質(zhì)。
[0340] 特別優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的制劑品提供為液劑、乳劑、懸浮劑、漿液劑(slurry)或以 干燥形式如粉劑或顆粒劑。
[0341] 具體地,優(yōu)選的制劑品制造為可在使用前即刻配制成液劑的粉劑或顆粒劑。
[0342] 進(jìn)一步優(yōu)選的投與形式為可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法生產(chǎn)的片劑、錠劑、膠囊劑、糊劑、顆粒 齊IJ、霜?jiǎng)┑?。片劑?yōu)選包含輔助添加劑如填料、粘結(jié)劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑或風(fēng)味劑等。顆粒劑 可使用異麥芽糖生產(chǎn)。用于人類的根據(jù)本發(fā)明的制劑品可提供Img至IOg免疫復(fù)合物的每 日劑量。
[0343] 此外,優(yōu)選提供配制為在粘膜部位起作用的制劑,例如在粘膜部位(鼻、口、眼、食 道、喉、肺、耳、胃道、腸和結(jié)腸)例如局部而不是全身作用。根據(jù)本發(fā)明的制劑典型地提供 用于口服或粘膜用途,包括口、鼻、支氣管、陰道、直腸使用,例如從而抑制對(duì)咽、腸、泌尿生 殖道和牙齦上皮細(xì)胞的粘附。該制劑可以適用于局部應(yīng)用的形式如以霜?jiǎng)?、噴霧劑或滴劑 提供用于特定的醫(yī)療指不。
[0344] 根據(jù)本發(fā)明的免疫復(fù)合物制劑可具體用于治療和/或預(yù)防感染和/或炎癥和/或 過(guò)敏癥狀和/或自身免疫病的癥狀和/或粘膜表面的免疫球蛋白缺陷,例如胃腸道、泌尿生 殖道、呼吸道、鼻腔、眼或口腔,特別是在術(shù)后或住院治療期間進(jìn)行。
[0345] 參考下列實(shí)施例,前述說(shuō)明將更完整地理解。然而,這些實(shí)施例僅為實(shí)施本發(fā)明的 一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的代表性方法,不應(yīng)當(dāng)作限定本發(fā)明的范圍。
[0346] 實(shí)施例
[0347] 實(shí)施例1:
[0348] Ii各眉^其斤_ SIgA白勺學(xué)I1矛口學(xué)丨"青^^品白勺¢$1?
[0349] 樣品制劑(乳,乳清)
[0350] 新鮮取樣101111來(lái)自山羊、綿羊和牛的乳并在40,000\8,41:下離心30111111。用軟 膏刀(spatula)除去脂肪層;剩余的液體轉(zhuǎn)移至新的離心管中并在40, OOOXg下再次離心 30min〇
[0351] 將液體層(乳清)等分并于_20°C保存或直接用于篩選。
[0352] 陽(yáng)件對(duì)照樣品
[0353] 作為陽(yáng)性對(duì)照,如上所述制備人乳。
[0354] 陰件對(duì)照樣品
[0355] 作為陰性對(duì)照,對(duì)于牛乳,使用全脂奶(Vollmilch) (3. 5 %脂肪, Niederosterreichische Molkerei,Austria)。
[0356] 對(duì)于山羊乳的陰性對(duì)照,使用 " Ja Natiirlich" Ziegenmilch, Sennerei Zillertal,Austria。
[0357] 篩詵 ELISA
[0358] 篩選在標(biāo)準(zhǔn)ELISA模式下進(jìn)行:對(duì)于山羊乳樣品的篩選,在100微升每孔下以I 微克每 ml 包被緩沖液(coating buffer) (3. 03g Na2C03,6. Og NaHCO3 于 IOOOml 蒸饋水 中,pH 9. 6)的濃度用多克隆兔抗山羊IgA(AbD Serotec no. AAI44)包被ELISA板(Nunc Maxi-Sorp Immuno Plate)。對(duì)于牛乳樣品或綿羊乳樣品的篩選,抗-牛IgA (Genataur no. RA-10A,Belgium)或抗-綿羊 IgA (LSBio no. LS-C57110, USA)分別包被至板。對(duì)于陽(yáng)性 對(duì)照樣品,抗-人-IgA抗體包被至各孔?ethyl Laboratories no.A80-103A,USA)。用蓋 子封閉板并在4°C下溫育過(guò)夜。
[0359] 在下一步驟之前,除去包被液并通過(guò)用200 ill TPBS (I. 16g Na2HPO4, 0. Ig KCl, 0? Ig K3PO4, 4. Og NaCl 在 500ml 蒸餾水中,0? 05% (v/v)Tween20, pH 7. 4)填充孔來(lái)洗 漆板三次。通過(guò)在水槽上輕彈(flicking)板來(lái)除去溶液或洗漆廢水(washes)。剩余的液 滴通過(guò)在紙巾上輕拍板來(lái)除去??蛇x地,洗滌可用ELISA洗滌器進(jìn)行。
[0360] 將板用 Superblock 封閉緩沖液(blocking buffer) (Thermo no 37515) 150 微升 /孔填充并室溫溫育2小時(shí)。
[0361] 再次如上所述洗滌板。
[0362] 乳清樣品在樣品TPBS (1:2和1:10)中稀釋。將針對(duì)各稀釋度(1:2和1:10)的16 個(gè)陰性對(duì)照加至各板。將針對(duì)各稀釋度4個(gè)陽(yáng)性對(duì)照樣品加至板。100微升的各稀釋液加 入洗滌板的孔中并室溫溫育2小時(shí)。
[0363] 洗滌后,將100微升的抗-路易斯X-抗體(LSBio no. LS-C75829)、抗-唾液酸 化-路易斯 a-抗體(LSBio no. LS-C33820)、抗-路易斯 a-抗體(LSBio no. LS-C50512)、 抗-唾液酸化-路易斯b-抗體(GeneTex no. GTX72378, USAl:300)、抗-路易斯b抗體 (LSBio no.LS-C46049)和抗-路易斯 y-抗體(LSBio no.LS-C71674,USA,l:50)的混合物 在TPBS中的稀釋液加入至各樣品孔以及陰性和陽(yáng)性對(duì)照樣品孔。
[0364] 將板再次室溫溫育2小時(shí),隨后洗滌。
[0365] 接著,添加 100 微升每孔的雞抗鼠-IgG-HRP(Thermo, no. SA1-72029, 1:500, TPBS 中)并室溫溫育2小時(shí)。隨后,將板用TPBS洗滌三次。
[0366] 然后用基質(zhì)緩沖液(substrate buffer) (TMB 基質(zhì)試劑盒;Vector Laboratories no SK-4400, USA)進(jìn)行另外的洗漆步驟。之后,添加顯色底物(chromogenic substrate) (Vector Laboratories SK-4400)。短暫溫育后(測(cè)量,陽(yáng)性對(duì)照在OD 650>1.0下,陰性對(duì) 照0D〈0. 2)添加50微升的IN硫酸,并在酶標(biāo)儀(microplate reader)中在0D450下讀取 板,如在標(biāo)準(zhǔn)ELSA技術(shù)中的利用TMB作為底物由0D600補(bǔ)償。
[0367] 評(píng)價(jià):
[0368] 各稀釋度的16個(gè)陰性對(duì)照的OD值用于計(jì)算負(fù)信號(hào)(negative signal)的平均值 和標(biāo)準(zhǔn)差。
[0369] 如果乳清樣品顯示至少一個(gè)稀釋度具有的吸光度高于同一稀釋度下陰性對(duì)照的 平均吸光度+2倍標(biāo)準(zhǔn)差,則乳清樣品在本篩選測(cè)定中視為陽(yáng)性。
[0370] 陽(yáng)性乳清樣品用于進(jìn)一步的分析。
[0371] 實(shí)施例證實(shí),可選擇并篩選動(dòng)物物種、個(gè)體和種屬,從而產(chǎn)生具有基本上高于目前 商購(gòu)可得乳的路易斯_糖基化SIgA含量的乳。
[0372] 實(shí)施例2
[0373] 路易斯-巖藻糖某化重纟目人分泌成分在晡乳動(dòng)物細(xì)朐中的表汰
[0374] 本實(shí)施例描述了表達(dá)由各種糖基轉(zhuǎn)移酶修飾的分泌成分的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的建立, 以及隨后篩選產(chǎn)生路易斯-巖藻糖基化分泌成分的克隆。
[0375] 分泌成分蛋白序列(plgR的胞外部分)示于圖1。
[0376] 將蛋白序列反向翻譯為DNA(為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)而優(yōu)化)并從頭合成 (Geneart,Germany)。出于克隆目的,DNA提供有HindIII和XbaI識(shí)別和切割位點(diǎn)(斜體 加下劃線)。參見(jiàn)圖2。
[0377] 將基因在 HindIII 和 XbaI 位點(diǎn)插入載體 pCDNA3. l+(invitrogen, USA)中。
[0378] 為了產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子,用PvuI使質(zhì)粒線性化并隨后根據(jù)制造商(Invitrogen) 使用 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染至 CHO-Kl 細(xì)胞(CHO DUK- ;ATCC CRL 9096)中。轉(zhuǎn)染后 24 小時(shí),將各T-燒瓶中的細(xì)胞分離至五個(gè)100-mm培養(yǎng)皿中并在選擇培養(yǎng)基中溫育。G418的 濃度為200-400微克/mL。選擇培養(yǎng)基每三天更換??顾幮钥寺】稍诖蠹s2周后發(fā)現(xiàn),在 顯微鏡下鑒定,并使用移液器手工挑選。選擇的克隆在G418的存在下在96孔板中培養(yǎng)2 周。將生長(zhǎng)細(xì)胞分離至雙孔,并在ELISA標(biāo)準(zhǔn)中試驗(yàn)上清液的分泌成分表達(dá)。簡(jiǎn)言之,將山 羊抗-分泌成分抗體(Acris Antibodies AP21476FC-N)包被至板,溫育并洗滌后,添加細(xì) 胞上清液(1:2和1:10稀釋)。溫育并洗滌后,添加小鼠抗人-SC(Sigma 16635),隨后用 抗-小鼠-IgG-HRP檢測(cè)。選擇的陽(yáng)性克隆用于分泌成分的純化,并用于進(jìn)一步的用糖基轉(zhuǎn) 移酶轉(zhuǎn)染。
[0379] 用各種糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)染:表達(dá)分泌成分的穩(wěn)定的陽(yáng)性克隆選擇并轉(zhuǎn)染有2個(gè)質(zhì) 粒,一個(gè)編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶2和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3,另一個(gè)編碼3 1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0380] a 1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT2)的蛋白序列示于圖3。
[0381] FUT2的反向翻譯序列在5'和3'端包括NheI和EcoRI識(shí)別和切割位點(diǎn)?;?因從頭合成(Geneart, Germany),參見(jiàn)圖4。帶有NheI和EcoRI的基因克隆至載體 pIRES(Clontech,no 631605)的多克隆位點(diǎn) A 中,得到 pIRESF2。
[0382] 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3的蛋白序列示于圖5中。
[0383] 序列反向翻譯為最優(yōu)的密碼子選擇序列(codon usage sequence),并提供有在各 端的XbaI和NotI識(shí)別位點(diǎn),參見(jiàn)圖6。
[0384] DNA從頭合成并克隆至包含如上所述的FUT 2基因的pIRESF2載體的多克隆位點(diǎn) B的XbaI和NotI位點(diǎn),產(chǎn)生質(zhì)粒pIRESF23。
[0385] 對(duì)于轉(zhuǎn)染,包含F(xiàn)UT2和FUT3基因的pIRESF23載體用BpmI線性化。
[0386] 制備若干包含各種3 1,3-半乳糖基-轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)質(zhì)粒。因此,將半乳糖基-轉(zhuǎn) 移酶的蛋白序列反向翻譯成DNA序列(為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)而優(yōu)化)并在各端提供有獨(dú)特 的限制性位點(diǎn)(NheI and NotIhDNA合成并克隆至 pEFl a IRES(Clontech631970)的 NheI 和NotI位點(diǎn)。在與包含F(xiàn)UT2和FUT3的pIRESF23共轉(zhuǎn)染至表達(dá)重組人分泌成分的CHO細(xì) 胞之前使各質(zhì)粒用AatII線性化。
[0387] P 1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I的蛋白序列示于圖7。
[0388] P 1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I的基因示于圖8。
[0389] P 1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶V的蛋白序列示于圖9,準(zhǔn)備好克隆的相應(yīng)的基因示于圖 10。
[0390] P 1,3_半乳糖基轉(zhuǎn)移酶II的蛋白序列不于圖11,具有克隆位點(diǎn)的相應(yīng)的基因不 于圖12。
[0391] 轉(zhuǎn)染和詵擇步驟
[0392] 利用質(zhì)粒混合物:Linearized pIRESF23分別與編碼P -1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I、 3 -1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶II和P -1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶V的線性化質(zhì)粒結(jié)合,在標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染 步驟中轉(zhuǎn)染表達(dá)人分泌成分的CHO細(xì)胞克隆。轉(zhuǎn)染接著進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)選擇步驟來(lái)產(chǎn)生穩(wěn)定的克 ?。℅418濃度可增加至1000微克每ml選擇培養(yǎng)基)。
[0393] 表汰路易斯-糖某化分泌成分的克降的篩詵:
[0394] 在特異性針對(duì)分泌成分和路易斯糖基化的ELISA中試驗(yàn)CHO克隆的上清液:
[0395] 篩選在標(biāo)準(zhǔn)ELISA模式中進(jìn)行:對(duì)于篩選細(xì)胞培養(yǎng)上清液,在100微升每孔下以1 微克每ml包被緩沖液(3. 03g Na2CO3,6. Og NaHCO3于IOOOml蒸餾水中,pH 9. 6)的濃度用 抗人分泌成分抗體(Ray Biotech no. DS-PB-03010, USA)包被 ELISA 板(Nunc Maxi-Sorp Tmmuno Plate)〇
[0396] 用蓋子封閉板并在4°C下溫育過(guò)夜。
[0397] 在下一步驟之前,除去包被液并通過(guò)用200 ill TPBS (I. 16g Na2HPO4, 0. Ig KCl, 0? Ig K3PO4, 4. Og NaCl 在 500ml 蒸餾水中,0? 05% (v/v)Tween20, pH 7. 4)填充孔來(lái)洗 滌板三次。通過(guò)在水槽上輕彈板來(lái)除去溶液或洗滌廢水。剩余的液滴通過(guò)在紙巾上輕拍板 來(lái)除去??蛇x地,洗滌可用ELISA洗滌器進(jìn)行。
[0398] 將板用Superblock封閉緩沖液(Thermo no 37515) 150微升/孔填充并室溫溫育 2小時(shí)。
[0399] 再次如上所述洗滌板。
[0400] 細(xì)胞培養(yǎng)上清液在樣品TPBS (1:2和1:10)中稀釋。將針對(duì)各稀釋度(1:2和1:10) 的16個(gè)陰性對(duì)照加至各板。將針對(duì)各稀釋度4個(gè)陽(yáng)性對(duì)照樣品加至板。100微升的各稀釋 液加入洗滌板的孔中并室溫溫育2小時(shí)。
[0401] 洗滌后,將100微升的抗-路易斯X-抗體(LSBio no. LS-C75829)、抗-唾液酸 化-路易斯 a-抗體(LSBio no. LS-C33820)、抗-路易斯 a-抗體(LSBio no. LS-C50512)、 抗-唾液酸化-路易斯b-抗體(GeneTex no. GTX72378, USAl:300)、抗-路易斯b抗體 (LSBio no.LS-C46049)和抗-路易斯 y-抗體(LSBio no.LS-C71674,USA,l:50)的混合物 在TPBS中的稀釋液加入至各樣品孔以及陰性和陽(yáng)性對(duì)照樣品孔。
[0402] 將板再次室溫溫育2小時(shí),隨后洗滌。
[0403] 接著,添加 100 微升每孔的雞抗鼠-IgG-HRP(Thermo, no. SA1-72029, 1:500, TPBS 中)并室溫溫育2小時(shí)。隨后,將板用TPBS洗滌三次。
[0404] 然后用基質(zhì)緩沖液(TMB 基質(zhì)試劑盒;Vector Laboratories no SK-4400, USA)進(jìn) 行另外的洗漆步驟。之后,添加顯色底物(Vector Laboratories SK-4400)。短暫溫育后 (測(cè)量,陽(yáng)性對(duì)照在OD 650>1. 0下,陰性對(duì)照0D〈0. 2)添加50微升的IN硫酸,并在酶標(biāo)儀 中在0D450下讀取板,如在標(biāo)準(zhǔn)ELSA技術(shù)中的利用TMB作為底物由0D600補(bǔ)償。
[0405] 評(píng)價(jià):
[0406] 各稀釋度的16個(gè)陰性對(duì)照用于計(jì)算負(fù)信號(hào)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
[0407] 如果樣品顯示至少一個(gè)稀釋度具有的吸光度高于同一稀釋度下陰性對(duì)照的平均 吸光度+2倍標(biāo)準(zhǔn)差,則樣品在本篩選測(cè)定中視為陽(yáng)性。
[0408] 陽(yáng)性樣品用于蛋白質(zhì)純化和進(jìn)一步的分析。
[0409] 本實(shí)施例證實(shí),可產(chǎn)生不源自人乳的具有高摩爾比例的路易斯_表位的分泌成 分。
[0410] 實(shí)施例3 :
[0411] 定量評(píng)價(jià)分泌成分h路易斯-表位的存在
[0412] 來(lái)自動(dòng)物細(xì)胞上清液和分泌性IgA的重組分泌成分的純化通過(guò)親和色譜利用結(jié) 合到瓊脂糖凝膠(Sepharose)的兔抗人分泌成分根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行。
[0413] 聚糖-分析用樣品制各:
[0414] 純化的分泌性 IgA 通過(guò)還原 SDS-PAGE (80 X 80 X lmm, 10 % BisTris NuPAGE gel,MES SDS電泳緩沖液(Invitrogen))而分離成SC、J鏈、H鏈和輕鏈。蛋白質(zhì)帶段 (protein band)通過(guò)考馬斯染色而可視化。使用分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
[0415] 約SOkDa考馬斯染色的帶段切離并用胰蛋白酶凝膠內(nèi)消化并烷基化(凝膠內(nèi) 膜蛋白酶消化試劑盒(In-Gel Tryptic Digestion Kit), Thermo Scientific product no.89871)〇
[0416] 純化的、還原的和烷基化的分泌成分的肽為通過(guò)用來(lái)自牛腎的a -1-6-巖藻糖苷 酶(ProZyme,no GKX-5006,USA)在 37°C下在 IOmM NH4Ac(pH 5.0)中過(guò)夜處理而在最內(nèi) GIcNAc殘基去巖藻糖基化的。核心-巖藻糖除去的完整性可通過(guò)分析由多孔石墨碳上的色 譜伴有MS檢測(cè)的釋放的N-聚糖來(lái)證實(shí)。
[0417] 肽和糖肽的分析在由 Aquasil C-18 柱(30mmX0. 32mm, 5 微米,Thermo Scientific)、BioBasic C18 分析柱(150mmX0. 18mm, 5 微米,Thermo Scientific)、Waters CapLC、Rheodyne 10-口閥和具有標(biāo)準(zhǔn)ESI-來(lái)源的Waters Q-TOF Ultima組成的毛細(xì)管 LC-ESI-MS體系上進(jìn)行。
[0418] 溶劑A由pH 3.0的65mM甲酸銨組成,溶劑B為80 %乙腈(ACN)在溶劑A中。 預(yù)置柱在無(wú)ACN下平衡并負(fù)載。之后,6.3至62.5%的溶劑B的梯度顯影45min。測(cè)量 m/z 150至1800范圍內(nèi)的陽(yáng)離子。毛細(xì)管電壓為3. 2kV,錐電壓為35V,源溫度(source temperature) IOCTC,去溶劑化溫度 120°C。
[0419] 使用MassLynx 4. 0軟件評(píng)價(jià)數(shù)據(jù),包括MaxEnt3去卷積/分離同位素 (deisotoping)特征(Waters) 〇
[0420] 糖基化肽通過(guò)利用PNGnase F(Roche)的去糖基化鑒定,并進(jìn)一步在反相HPLC接 著質(zhì)譜中分離。去糖基化肽包含谷氨酸代替谷氨酰胺殘基,這產(chǎn)生IDa的質(zhì)量差。
[0421] 相同肽骨架上不同的聚糖結(jié)構(gòu)將可能的糖肽信號(hào)分成幾個(gè)不同質(zhì)量的分子種類。 糖肽的存在還可在總質(zhì)譜中表示為在基于特定單糖差異的步驟下的不同糖型之間的質(zhì)量 階梯(如,m/z 146 [巖藻糖],162 [己糖],203 [N-乙?;禾前穄,291 [N-乙酰神經(jīng)氨 酸])。
[0422] 一旦鑒定了糖基化峰,測(cè)量對(duì)應(yīng)于特定糖肽物質(zhì)的峰"體積",即峰值面積。峰體積 可直接翻譯成糖型離子化的摩爾比例,因而糖肽的檢測(cè)由肽部分控制。
[0423] 隨鑒定的或潛在的糖肽的洗脫時(shí)間獲得質(zhì)譜并在將m/z與強(qiáng)度譜(m/z vs intensity spectrum)提交至軟件用于分析之前求和、平滑化和質(zhì)心化(centroided)。
[0424] 為了增加低強(qiáng)度糖型的信噪比,推薦僅對(duì)相應(yīng)的洗脫峰而不是較寬的色譜時(shí)間框 的MS-譜求和。
[0425] 從發(fā)生特定糖基化位點(diǎn)的糖型的列表,計(jì)算巖藻糖基化聚糖的摩爾級(jí)分。添加不 同位點(diǎn)的結(jié)果以獲得發(fā)生在分泌成分中的巖藻糖基化聚糖的摩爾比例。
[0426] 示例性結(jié)果和計(jì)算以人分泌成分的樣品示出:
[0427] 各肽糖型的相對(duì)量:
[0428] 肽 82-109
[0429] 2. 6% Hex9HexNAc7Fuc3NeuAc0
[0430] 5. 2% Hex10HexNAc8Fuc0NeuAc0
[0431] 15. 6% Hex10HexNAc8Fuc2NeuAc0
[0432] 4. 2% Hex10HexNAc7Fuc4NeuAc0
[0433] 21. 8% Hex10HexNAc8Fuc3NeuAc0
[0434] 21. 3% Hex10HexNAc8Fuc4NeuAc0
[0435] 15. 9% Hex10HexNAc8Puc3NeuAc1
[0436] 8. 1% Hex10HexNAc8Fuc4NeuAc1
[0437] 3. 3% Hex10HexNAc8Fuc5NeuAc1
[0438] 2. 0% Hex10HexNAc8Fuc4NeuAc2
[0439] 在糖基化位點(diǎn)Asn83和Asn90,95%的糖型具有非核心巖藻糖-殘基
[0440] 肽 168-190
[0441] 3. 3% Hex5HexNAc4Fuc0NeuAc0
[0442] 55. 1% Hex5HexNAc4Fuc2NeuAc0
[0443] 35. 4% Hex5HexNAc4Fuc3NeuAc0
[0444] 6. 1% Hex5HexNAc4Fuc2NeuAc1
[0445] 在糖基化位點(diǎn)Asnl86,97%的糖型具有非核心巖藻糖-殘基
[0446] 肽 4I3-4M
[0447] 24. 2% Hex5HexNAc4Fuc2NeuAc0
[0448] 37. 7% Hex5HexNAc4Fuc3NeuAc0
[0449] 38. 2% Hex5HexNAc4Fuc2NeuAc1
[0450] 在糖基化位點(diǎn)Asn421,100%的糖型具有非核心巖藻糖-殘基
[0451] 肽 457-479
[0452] 11. 0% Hex5HexNAc4Fuc0NeuAc0
[0453] 46. 9% Hex5HexNAc4Fuc2NeuAc0
[0454] 42. 1% Hex5HexNAc4Fuc3NeuAc0
[0455] 在糖基化位點(diǎn)Asn469,89%的糖型具有非核心巖藻糖-殘基。
[0456] 肽 498_515
[0457] 6. 1% Hex4HexNAc3Fuc0NeuAc0
[0458] 7. 7% Hex5HexNAc3Fuc0NeuAc0
[0459] 3. 6% Hex5HexNAc4Fuc0NeuAc0
[0460] 18. 9% Hex6HexNAc3Fuc0NeuAc0
[0461] 23. 2% Hex5HexNAc4Fuc1NeuAc0
[0462] 7. 8% Hex6HexNAc3Fuc2NeuAc0
[0463] 25. 8% Hex5HexNAc4Fuc2NeuAc0
[0464] 5. 1% Hex5HexNAc4Fuc3NeuAc0
[0465] I. 8% Hex5HexNAc4Fuc2NeuAc1
[0466] 在糖基化位點(diǎn)Asn499,64%的糖型具有非核心巖藻糖-殘基。
[0467] 樣品的非核心(路易斯)巖藻糖基化=0, 95mol+0, 97mol+lmol+0, 89mol+0, 64mo I = 4, 45mol/mol 分泌成分
[0468] 實(shí)施例4
[0469] 晡乳動(dòng)物細(xì)朐中二聚IgA的表汰和SIgA分子與重纟目路易斯-糖某化分泌成分的 重構(gòu)
[0470] 鼠類J558L細(xì)胞用作表達(dá)結(jié)合至半抗原硝基苯基的種系抗體的宿主。為此,嵌 合的重鏈(鼠類VH/人IgA2恒定區(qū))克隆于哺乳動(dòng)物表達(dá)載體p⑶NA3. 1,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至 J558L細(xì)胞和克隆,選擇并篩選穩(wěn)定表達(dá)的dlgA。與IgA2重鏈平行的,制備并使用具有IgAl 重鏈的構(gòu)建體。
[0471] 二聚IgA純化并與來(lái)自CHO細(xì)胞的重組分泌成分重構(gòu)(參見(jiàn)實(shí)施例2)。
[0472] 嵌合抗硝基苯基IgA重鏈的蛋白序列(小寫字母=前導(dǎo)肽,下劃線=鼠類VH)示 于圖13,重鏈構(gòu)建體的DNA序列,包括HindIII和XbaI限制性位點(diǎn),示于圖14。
[0473] 基因完全合成有HindIII和XbaI位點(diǎn)(Geneart, Germany)并克隆至 pCDNA3. l+(Invitrogen,USA)的相應(yīng)位點(diǎn)。轉(zhuǎn)染之前,用PvuI使重組質(zhì)粒線性化。
[0474] 鼠類 J558L 細(xì)胞(Health Protection Agency Culture Collections no. 88032902),顯示NIP特異性J鏈和A輕鏈的組成型合成,在含青霉素(l〇〇IU/ml)和鏈 霉素(100microg/ml ;Bio Whittaker, Walkersville, MD)和 10%胎牛血清(Invitrogen)的 RPMI培養(yǎng)基中在37°C下在含5% CO2的氣氛中生長(zhǎng)。J558L的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染通過(guò)電穿孔實(shí)現(xiàn), 克隆在包含500microg/ml G418(Sigma)的培養(yǎng)基中選擇。細(xì)胞在上清液收集并通過(guò)酶聯(lián) 免疫吸附測(cè)定(ELISA)篩選免疫球蛋白生產(chǎn)之前溫育2-3周。
[0475] 對(duì)于ELISA,微孔板包被有抗-j鏈抗體(山羊抗-J鏈,Santa Cruz, sc-34654)。 洗滌后,添加細(xì)胞培養(yǎng)上清液(稀釋1:2和1:10)。溫育和洗滌后,抗-人-IgA a鏈-HRP 結(jié)合物用于檢測(cè)表達(dá)IgA的細(xì)胞系。
[0476] 來(lái)自選擇克隆的培養(yǎng)上清液的重組dlgA的純化通過(guò)親和色譜利用抗人IgA偶聯(lián) 的瓊脂糖凝膠(Sigma A2691)根據(jù)制造商和標(biāo)準(zhǔn)親和色譜步驟來(lái)進(jìn)行。
[0477] 來(lái)自IgA和重纟目分泌成分的SIgA的重構(gòu)
[0478] dlgA-分泌成分復(fù)合物的重構(gòu)在體外通過(guò)將等摩爾純化的dlgA和純化的分泌成 分(分別巖藻糖基化和非-巖藻糖基化)以10微克每100微升的濃度在PBS緩沖液中混 合過(guò)夜來(lái)進(jìn)行。
[0479] 重構(gòu)復(fù)合物分別上樣于非還原的和還原的6% SDS-聚丙烯酰胺凝膠,印跡至聚偏 二氟乙烯膜,并用抗分泌成分的抗血清檢測(cè)。
[0480] 如分泌成分移至dlgA和plgA分子的位置所示發(fā)生共價(jià)重構(gòu)。在還原條件下,在每 個(gè)泳道中僅游離的分泌成分可檢測(cè)到類似的程度,表明分泌成分和IgA通過(guò)二硫鍵連接。
[0481] 復(fù)合物進(jìn)一步通過(guò)HPLC純化。定量此類在PBS中的純化的SIgA (路易斯糖基化 和非-巖藻糖基化)并用于抗原結(jié)合和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。
[0482] 實(shí)施例5:
[0483] 重鉬路易斯-糖某化SIgA的穩(wěn)定件試駘
[0484] 進(jìn)行各種測(cè)定以顯示本發(fā)明分子的生物物理、生物化學(xué)和生物的穩(wěn)定性。
[0485] 對(duì)于生物物理穩(wěn)定性,樣品通過(guò)差示掃描量熱法分析:
[0486] 免疫復(fù)合物和抗體在pH 6.0下用20mM檸檬酸、150mM NaCl緩沖液透析。通 過(guò)UV吸光度測(cè)量抗體濃度??贵w使用透析液稀釋為lmg/mL。掃描使用自動(dòng)毛細(xì)管 DSC(MicroCal,LLC)進(jìn)行。進(jìn)行利用透析液的兩次掃描用于基線減法。掃描以1°C /min從 20_95°C使用中等反饋模式運(yùn)行。掃描使用Origin 7.0分析。非零基線使用三階多項(xiàng)式校 正。各免疫復(fù)合物的解折疊轉(zhuǎn)化使用軟件內(nèi)的非兩種狀態(tài)解折疊模式是合適的。
[0487] 生物化學(xué)穩(wěn)定性(酸溫育后的凝膠電泳):將含有免疫復(fù)合物的樣品和對(duì)照通過(guò) 使用脫鹽柱(NAP25柱,GE Healthcare)緩沖液更換(buffer exchanged)成各種pH值 (4. 0、5. 0、6. 0和7. 0)的制劑品,并將它們的濃度調(diào)整為5mg/ml。配制的抗體溶液通過(guò)0. 22 微米濾器滅菌,并將Iml的各溶液填入滅菌的USP型I,5-ml容量的玻璃小瓶中并用高壓蒸 汽處理的橡膠塞密封。這些制備的樣品在排阻色譜(SEC)分析之前于40°C保存在控溫培養(yǎng) 器中1天。
[0488] 排阻色譜:聚集體(高分子量產(chǎn)物)和降解物質(zhì)(低分子量產(chǎn)物)的量通過(guò)SEC 使用 G3000SWXL 柱(7. 8mm i. d. 30cm ;Tosoh Corp. Japan)分析。流動(dòng)相由 50mM 憐酸鈉(pH 7. 0)和500mM氯化鈉組成。實(shí)驗(yàn)條件如下:注入蛋白質(zhì)20mg ;流速,0. 5ml/min ;檢測(cè)波長(zhǎng), 215和280nm ;和分析時(shí)間,30min。確定存在于已在40°C下在玻璃小瓶中保存1天的樣品 中的高分子量產(chǎn)物和低分子量產(chǎn)物的量并表示為與相應(yīng)的新制備樣品的那些相比的相對(duì) 增量。
[0489] 蛋白酶穩(wěn)定件
[0490] 所有消化在37°C下進(jìn)行8小時(shí),樣品的蛋白質(zhì)濃度為5mg/ml,總體積為1ml。胰 蛋白酶和胃蛋白酶(Sigma,USA)用作蛋白水解酶。胰蛋白酶消化在pH 8.0的0.05M Tris 緩沖液中進(jìn)行。利用胃蛋白酶的消化在pH 4. 0的0. 05乙酸鈉緩沖液中進(jìn)行。在消化之前 所有蛋白質(zhì)用這些緩沖液透析24小時(shí)。對(duì)于兩種酶來(lái)說(shuō),酶與蛋白質(zhì)之比為1:25或1:50。 胰蛋白酶消化通過(guò)添加等摩爾量的大豆胰蛋白酶抑制劑(Sigma)至反應(yīng)混合物來(lái)停止,而 胃蛋白酶消化通過(guò)添加100微升2. 5M Tris升高溶液pH至約8來(lái)終止。消化后,所有反應(yīng) 混合物在進(jìn)一步分析之前冷凍。
[0491] 消化的評(píng)價(jià):解凍各消化液并置于Superdex 200 (GE Healthcare)的柱 (1.5X90cm)中,用IgA二聚體、IgG和牛血清白蛋白校準(zhǔn)。280nm下記錄洗出液的吸光度。
[0492] 出現(xiàn)峰且在對(duì)應(yīng)于完整分子的位置的峰值面積表示為總面積的百分比。
[0493] 實(shí)施例6:
[0494] 不同糖基化SIgA的特異件試騎
[0495] 可試驗(yàn)各種路易斯-陽(yáng)性和路易斯-陰性SIgA (如前述實(shí)施例所述的重構(gòu)SIgA) 與一系列(spectrum of)病原體結(jié)構(gòu)的結(jié)合。
[0496] 純化的本發(fā)明免疫復(fù)合物的滴定度可在用于結(jié)合大腸桿菌-來(lái)源的脂多糖 (LPS)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)-來(lái)源的脂磷壁酸(L2515, Sigma, USA)、 來(lái)自金黃色葡萄球菌的肽聚糖(PGN)和鑰孔戚血藍(lán)蛋白(KLH, MP Biomedicals)的ELISA 步驟中試驗(yàn)。該測(cè)定記載于J. Dairy Sci. vol. 93pp. 5467-5473:
[0497] 用 100 ii L/ 孔的 I ii g KLH、4 ii g LPS、5 ii g LTA 或 2 ii g PGN 每 mL 的碳酸鹽緩沖 液(10. 6g/L Na2CO3, pH 9. 6)包被板。洗滌后,用 100 ii L/ 孔的含 0. 05% Tween20 的 PBS 中 的2.5%兔血清室溫(21°〇封閉板至少30!^11。添加在?85、0.05%1¥661120和2.5%兔血 清中連續(xù)稀釋的樣品(1:4)。將板在室溫(21°C )溫育lh。
[0498] 免疫復(fù)合物和抗體與LPS、LTA、PGN或KLH的結(jié)合使用偶聯(lián)至過(guò)氧化物酶的 100 U L/孔的1:15, 000稀釋的兔抗牛-(抗人、抗山羊)-IgA來(lái)檢測(cè)。洗滌后,100 i! L/ 孔的四甲基聯(lián)苯胺(71.7iig/mL)和0.05% H2O2W入孔中并室溫(21°C )溫育lOmin。 反應(yīng)用50iiL/孔的2.5N H2SO4停止。在450nm波長(zhǎng)下用微孔板分光光度計(jì)測(cè)量消光 (extinctions)。將水平計(jì)算為滴定度,并將滴定度表示為給出離50% Emax最近的消光的 稀釋液的l〇g2值,其中Emax表示每個(gè)微量滴定板上雙份存在的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品的最高平均 消光。
[0499] 與艱難梭菌毒素A和大腸桿菌親密素的結(jié)合已記載于例如THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 281,NO. 20, pp. 14280-14287,與諾如病毒-VLP 的結(jié)合記載于 例如 Journal of Virology, Vol. 79, pp. 6714-6722:
[0500] 微孔板結(jié)合測(cè)定一用在100微升50mM碳酸氫鈉(pH 9. 6)中的200ng免疫復(fù)合物、 抗體或分泌成分室溫包被Nunc MaxiSorp ELISA板的孔lh。用200微升含5% (w/v)脫脂 奶粉的PBS-T封閉孔。在100微升PBS中的毒素A(500ng/ml)或GST-親密素(200ng/ml) 或諾如病毒VLPs (1微克/ml)室溫溫育2h。接著用PBS-T洗滌三次,使用特異性抗體檢測(cè) 結(jié)合(SC-毒素A相互作用用鼠類抗-毒素A IgG檢測(cè),諾如病毒VLP用小鼠抗諾如病毒檢 測(cè),和GST-親密素使用鼠類mAb抗GST檢測(cè)),接著山羊抗-小鼠IgG、山葵(horseradish) 過(guò)氧化物酶-結(jié)合的1,2-苯二胺作為染色體基因。反應(yīng)用1體積的2M H2SO4停止,并在 492nm下測(cè)量光學(xué)密度,使用620nm作為參考波長(zhǎng)。
[0501] 實(shí)施例7:
[0502] 根據(jù)實(shí)施例11獲得的山羊SIgA的抗菌活件-天然抗體與細(xì)菌抗原的結(jié)合
[0503] 純化的本發(fā)明的免疫復(fù)合物與大腸桿菌來(lái)源的脂多糖(LPS)和艱難梭菌毒素A的 反應(yīng)性在ELISA中試驗(yàn)。
[0504] 用IOOy L/孔的4 iig的LPS (來(lái)自大腸桿菌0157H7的脂多糖,List Biological L aboratories, Campbell, CA, USA, cat. no. 206)或 I u g 的艱難梭菌毒素 A (List Biological Laboratories, Campbell, CA, USA, cat. no. 152)每 mL 的碳酸鹽緩沖液(10. 6g/L Na2CO3, pH 9.6)包被板。洗滌后,用IOOii L/孔的含0.05% TWeen20的PBS中的2. 5%兔血清室溫 (21°〇封閉板至少30!^11。添加在?85、0.05%了¥661120和2.5%兔血清中連續(xù)稀釋的樣品 (1:4)。將板在室溫(21°C )溫育lh。
[0505] 免疫復(fù)合物和抗體與LPS或艱難梭菌(C. diff.)毒素A的結(jié)合使用偶聯(lián)至堿性磷 酸酶的IOOy L/孔1:15, 000稀釋的兔抗山羊-IgA (和分別的抗人-IgA)檢測(cè)。洗滌后, 1001117孔的磷酸對(duì)硝基苯酯&3以]1;[1:1'(^116117]^11〇8。1^〖6)加入孔并室溫(211€)溫育 30min〇
[0506] 光密度用微孔板分光光度計(jì)在405nm波長(zhǎng)下測(cè)量。
[0507] 試驗(yàn)的制劑為由根據(jù)下述實(shí)施例11的不同樣品制備的人SIgA(SigmaI2636)和幾 個(gè)山羊SIgA,所有具有每摩爾SIgA至少0. Olmol非核心巖藻糖。結(jié)果,所有山羊SIgA結(jié)合 至艱難梭菌毒素A和LPS (大腸桿菌0157H7)約比人對(duì)照高五倍。
[0508] 實(shí)施例8:
[0509] 怏諫篩詵試駘以通討側(cè)流測(cè)定來(lái)確定乳或乳清樣品中的非核心巖藻糖某化免疫 復(fù)合物
[0510] 簡(jiǎn)單和快速測(cè)定可用于決定將特定乳樣品包含進(jìn)池中,以便增加池中分泌成分上 的具有路易斯_表位的N糖基化水平。
[0511] 此類現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定(on-site assay)可為優(yōu)化為在某一閾值具有乳或乳清樣品顯示陽(yáng) 性的快速免疫測(cè)定。
[0512] 側(cè)流試驗(yàn)(側(cè)流免疫色譜測(cè)定)為意欲檢測(cè)目標(biāo)分析物在樣品中的存在的簡(jiǎn)單裝 置。通常在量油尺模式中生產(chǎn),側(cè)流試驗(yàn)為其中試驗(yàn)樣品沿著固體基質(zhì)經(jīng)毛細(xì)管作用流動(dòng) 的免疫測(cè)定形式。在樣品用于試驗(yàn)后,其遭遇混有樣品的著色試劑并轉(zhuǎn)運(yùn)已固定化的結(jié)合 蛋白的基質(zhì)遭遇線或帶(zone)。取決于存在于樣品中的分析物,著色試劑可變得在試驗(yàn)線 或帶受限。此類測(cè)定的流程示于圖15。
[0513] 側(cè)流試驗(yàn)免疫測(cè)定可在15min內(nèi)進(jìn)行,并可用于選擇包含具有增加的非核心巖藻 糖基化的免疫復(fù)合物的乳或乳清樣品。
[0514] 該測(cè)定的說(shuō)明為在糖基化(以每摩爾分泌成分的摩爾非核心巖藻糖表示)的特定 閾值下檢測(cè)乳或乳清基質(zhì)(matrix)中的非核心糖基化分泌成分。對(duì)于此類測(cè)定的優(yōu)化,使 用不具有、具有低和高非核心巖藻糖基化的純化的SIgA(如通過(guò)聚糖分析確定的,參見(jiàn)例 如實(shí)施例9)。
[0515] 此類附有一定說(shuō)明的測(cè)定由承包公司如Kestrel Biosciences (Carlsbad, USA)、 Biocare Diagnostics (Xiangzhou, China)、Biotem(France)等開發(fā)。
[0516] 可選地,測(cè)定通過(guò)使用通用快速檢測(cè)裝置(gRAD, RapidAssays, Copenhagen, Denma rk)來(lái)設(shè)計(jì)?;旧希旌仙锼鼗牟东@試劑、金-標(biāo)記的檢測(cè)試劑和樣品,接著用于側(cè)流 測(cè)定裝置。用于本實(shí)施例的gRAD裝置包含固定化的抗-兔抗體帶和生物素-結(jié)合帶(對(duì) 照)。
[0517] 本實(shí)施例中的捕獲試劑為生物素化的DC-SIGN-Fc融合蛋白。
[0518] 本實(shí)施例中金標(biāo)記的檢測(cè)抗體為兔抗山羊-IgA。
[0519] 檢測(cè)和捕獲試劑根據(jù)RapidAssays, Denmark提供的說(shuō)明來(lái)制造。測(cè)定根據(jù) RapidAssays試劑盒的說(shuō)明優(yōu)化。
[0520] 牛物素化:
[0521] DC-SIGN-Fc (R&D Systems, no. 161-DC-050)首先與生物素化試劑混合,該生 物素化試劑與蛋白質(zhì)上游離的伯胺反應(yīng)。接著經(jīng)色譜法除去非蛋白偶聯(lián)生物素試劑。 對(duì)于具有g(shù)RAD的使用,連接子應(yīng)盡可能長(zhǎng)。應(yīng)在測(cè)定優(yōu)化階段嘗試并比較EZ-Link NHS-PEG12-Biotin、Biotin-NHS、Biotin-LC-NHS 和 Biotin-PEG4-NHS (Pierce)。
[0522] PBS pH 7. 4和IOOmM碳酸鹽緩沖液pH8. 0分別用于DC-SIGN-Fc的生物素化(不 應(yīng)在Tris緩沖液中或包含疊氮化鈉,因?yàn)檫@些將封閉結(jié)合物)。DC-SIGN-Fc濃度應(yīng)為mg/ ml 〇
[0523] 每 mg 的 DC-SIGN-Fc 添加 2 ii 1 的生物素化原液(biotinylation stock)(原 液濃度以 mg/ml DMSO 計(jì):Biotin-NHS (40),Biotin-LC-NHS (53),Biotin-PEG4-NHS (69), Biotin-PEG12-NHS(110))。
[0524] 反應(yīng)混合物接著室溫暗處混合2小時(shí)。殘留的活性生物素-NHS添加10 ill的3M 乙醇胺封閉并溫育另外30分鐘。
[0525] 用Sphadex G25介質(zhì)的凝膠過(guò)濾/緩沖液更換用于除去游離的生物素。對(duì)于較小 體積的凝膠過(guò)濾可在小的一次性柱例如F1DlO (General Electric)中進(jìn)行。重復(fù)該過(guò)程以 盡可能多地除去游離的生物素,由于游離的生物素會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至試驗(yàn)線而降低所得應(yīng)答。
[0526] 月交體金句,被的檢泖丨試齊I丨的吿丨丨備(根據(jù)RapidAssays說(shuō)明):
[0527] 使用多克隆兔抗山羊-IgA(Acris Antibodies GmbH, Germany, no. AP05548PU-N) 并以lmg/ml以上的濃度制備,并應(yīng)在0.5 XPBS緩沖液中。
[0528] 使用裸金溶膠40nm和裸金溶膠20nm。
[0529] 1.振蕩或渦旋金以重懸任意沉降的金。將0. 5ml裸金溶膠置于十個(gè)(10)干凈的 獨(dú)立試管中。
[0530] 2?用pH值(或1至10)從給定的pH圖表標(biāo)記各管:pH5. 4、pH6. 6、pH7. 3、pH7. 8、 pH8. 2、pH8. 4、pH8. 8、pH9. 2、pH9. 6、pH10. 1。
[0531] 3.使用pH圖表以向各試管添加變化量的以微升計(jì)的緩沖液。振蕩至混合。
[0532] 4.將各管置于低速漩渦振蕩器上并添加抗體溶液(參見(jiàn)樣品制備部分)。充分混 合(約2至3秒)。
[0533] 理想地,對(duì)于40nm金,7 ii 1的2mg/ml抗體溶液是最優(yōu)的。對(duì)于20nm金,理想地, 14ii 1的2mg/ml抗體溶液是最優(yōu)的。
[0534] 5.在某些管上的深紫色和/或黑色沉淀表明抗體或蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)以下,導(dǎo)致 單個(gè)金溶膠的交聯(lián)。交聯(lián)的溶膠不能夠用于免疫測(cè)定并應(yīng)丟棄。深紫色溶膠也通常最不活 躍。僅具有淺紫色或無(wú)顏色變化的試管用于免疫測(cè)定。
[0535] 6.允許反應(yīng)持續(xù)總計(jì)30分鐘。
[0536] 7.通過(guò)添加50 ill的封閉穩(wěn)定劑溶液停止反應(yīng)。
[0537] 最好允許封閉劑室溫反應(yīng)額外16小時(shí)。
[0538] 為了試驗(yàn)結(jié)合物反應(yīng)的有效性,將10 包被的金溶膠(在BSA封閉液(blocking solution)添加之前)與10 ill的IM NaCl混合。不完全包被的溶膠將從溶液析出(變 黑),而完全包被的溶膠將保持穩(wěn)定(紅色)。
[0539] 側(cè)流測(cè)定接著用如上所述的試劑和根據(jù)制造商的gRAD裝置 (RapidAssays, Denmark)優(yōu)化。將從山羊乳中純化并用于路易斯糖基化分析的SIgA用于優(yōu) 化步驟。0. OOmol非核心巖藻糖/mol分泌成分的SIgA用作陰性對(duì)照。作為陽(yáng)性對(duì)照,使 用具有預(yù)定的非核心巖藻糖基化的山羊SIgA (如果期望篩選包含具有至少0. Olmol非核心 巖藻糖/mol分泌成分的SIgA的乳,則將具有該糖基化量的SIgA制劑用作參考,例如實(shí)施 例9的樣品12,用于優(yōu)化。作為基質(zhì),使用不具有路易斯糖基化的山羊乳。每ml基質(zhì)添加 50 y g純化的SIgA。這些混合物用作陽(yáng)性和陰性樣品用于試驗(yàn)優(yōu)化。
[0540] 為了大規(guī)模提供具有升高水平的非核心巖藻糖基化分泌性免疫球蛋白的乳,用所 述測(cè)定試驗(yàn)潛在的乳源的非核心巖藻糖基化免疫球蛋白。
[0541] 僅選擇陽(yáng)性(即超過(guò)閾值的非核心巖藻糖基化)樣品用于合并。
[0542] 實(shí)施例9:
[0543] 顯示豐要的巖藻糖某化結(jié)構(gòu)的山羊分泌成分的聚糖分析
[0544] 山羊分泌成分的下列序列用于分析(SEQ ID 17)
[0545] MSRLFLACLLAVFPVVSMKSPIFGPKEVTSVEGRSVSITCYYPATSVNRHTRKYffCRQGATGRCTTLIS SEGYVSDDYVGRA NLT NFPESGTFVVDISHLTR NDS GRYKCGLGISSRGLNFDVSLEVSQDPAQASDAHIYPV DVGRTVTINCPFTSANSQKRKSLCKKTGQGCFLIIDSTGYKNENYEDRIRLNIAGTDTLVFSVVINRVLLSDAGTYV CQA⑶DAKADKSNVYLQVLEPEPELVYRDLRSSVTFDCSLGPEVANTAKFLCQQKNGEACNVVINTLGKKAQDFQGR ILFLPKDNGVFSVHIASLRKEDAGRYVCGGQPEGQPEKGWPVQAWELFVNEETAIPASPSVVKGVKGGSVTVSCPYN PKDANSAKYWCRWEEAQNGRCPRLVQSKGLVKEQYKGRLALLAQPGNGTYTVILNQLTDQDAGFYWCVTD ⑶ TSW TSTVQLKVVEGEPSLKVPKNVTAWLGEAFKLSCHFPCKFYSFEKYWCKWSNEGCSPLPTQNDGPSQAFVSCDQNSQ IVSLNLDTVTKEDEGWYWCGVKEGPRYGETAAVYVAVESRAKGSQDAKQVNAAPAGGAIESRAGEIQNKALLDPRLF VEEIAVKDAAGGPGAPADPGRPAGHSGSSK
[0546] (粗體字母表示N-糖基化位點(diǎn)。)
[0547] 總糖某化
[0548] 根據(jù)實(shí)施例11制備分泌性免疫球蛋白。純化的分泌性免疫球蛋白通過(guò)還原 SDS-PAGE(80X80X Imm, 10% BisTris NuPAGE凝膠,MES SDS 電泳緩沖液(Invitrogen))而 分離成分泌成分、J鏈、H鏈和輕鏈。蛋白質(zhì)帶段通過(guò)考馬斯染色而可視化。使用分子質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)。約SOkDa考馬斯染色的帶段切離并在凝膠內(nèi)。在胰蛋白酶消化16小時(shí)及隨后的硼 氫化物還原之前使用PNGAseF直接從SDS page凝膠將聚糖從分泌成分釋放(用胰蛋白酶 的蛋白酶處理之后PNGAse F/A消化液殘留未消化的糖基化位點(diǎn)(glycosite)Nr. 4,因而會(huì) 不完整)。聚糖分析根據(jù)PGC (多孔石墨碳色譜)和ESI-MS檢測(cè)來(lái)完成。在注射至分析體 系之前,使用來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)的連接非特異性唾液酸酶將 聚糖去唾液酸化并根據(jù)洗脫時(shí)間分析。具有非核心巖藻糖和核心巖藻糖的聚糖可分離并以 完整聚糖的百分比表示。
[0549] 糖狀分析
[0550] 以相同的方式通過(guò)使用RP-ESI-MSMS分析糖基化位點(diǎn)。結(jié)構(gòu)根據(jù)肽骨架洗脫并由 于糖基化異質(zhì)性而示出特定的質(zhì)量分布。
[0551] 肽和糖肽的分析在由Aquasil C-18預(yù)置柱(30mmX0. 32mm, 5微米,Thermo Scientific)、BioBasic C18 分析柱(150mmX0. 18mm, 5 微米,Thermo Scientific)、Waters CapLC、RheodynelO- 口閥和具有標(biāo)準(zhǔn)ESI-來(lái)源的Waters Q-TOF Ultima組成的毛細(xì)管 LC-ESI-MS體系上進(jìn)行。溶劑A由pH 3. 0的65mM甲酸銨組成,溶劑B為80%乙腈(ACN)在 溶劑A中。預(yù)置柱在無(wú)ACN下平衡并負(fù)載。之后,6. 3至62. 5%的溶劑B的梯度顯影45min。 測(cè)量m/z 150至1800范圍內(nèi)的陽(yáng)離子。毛細(xì)管電壓為3. 2kV,錐電壓為35V,源溫度100°C, 去溶劑化溫度120°C。
[0552] 使用MassLynx 4. 0軟件評(píng)價(jià)數(shù)據(jù),包括MaxEnt3去卷積/分離同位素特征 (Waters)。糖基化肽通過(guò)利用PNGnase F(Roche)的去糖基化鑒定,并進(jìn)一步在反相HPLC 接著質(zhì)譜中分離。去糖基化肽包含谷氨酸代替谷氨酰胺殘基,這產(chǎn)生IDa的質(zhì)量差。
[0553] 相同肽骨架上不同的聚糖結(jié)構(gòu)將可能的糖肽信號(hào)分成幾個(gè)不同質(zhì)量的分子種類。 糖肽的存在還可在總質(zhì)譜中表示為在基于特定單糖差異的步驟下的不同糖型之間的質(zhì)量 階梯(如,m/z 146 [巖藻糖],162 [己糖],203 [N-乙?;禾前穄,291 [N-乙酰神經(jīng)氨 酸])。
[0554] -旦鑒定了糖基化峰,測(cè)量對(duì)應(yīng)于特定糖肽物質(zhì)的峰"體積",即峰值面積。峰體積 可直接翻譯成糖型離子化的摩爾比例,因而糖肽的檢測(cè)由肽部分控制。隨鑒定的或潛在的 糖肽的洗脫時(shí)間獲得質(zhì)譜并在將m/z與強(qiáng)度譜提交至軟件用于分析之前求和、平滑化和質(zhì) 心化(centroided)。
[0555] 為了增加低強(qiáng)度糖型的信噪比,推薦僅對(duì)相應(yīng)的洗脫峰而不是較寬的色譜時(shí)間框 的MS-譜求和。從發(fā)生特定糖基化位點(diǎn)的糖型的列表,計(jì)算巖藻糖基化聚糖的摩爾級(jí)分。添 加不同位點(diǎn)的結(jié)果以獲得發(fā)生在分泌成分中的巖藻糖基化聚糖的摩爾比例。
[0556] 鑒定下列糖基化位點(diǎn)的肽:
[0557] 糖基化位點(diǎn)1號(hào)八11即?£(5£〇10 18)82-89位
[0558] 糖基化位點(diǎn) 2 號(hào) NDSGR(SEQ ID 19) 103-107 位
[0559] 糖基化位點(diǎn)3號(hào)
[0560] LALLAQPGNGTYTVILNQLTDQDAGFYWCVTD⑶TSWTSTVQLK(SEQ ID 20)412-455 位
[0561] 糖基化位點(diǎn) 4 號(hào) NVTAWLGE (SEQ ID 21) 468-476 位
[0562] 雖然能夠在分析步驟中檢測(cè)糖基化位點(diǎn)1、2和4,但糖基化位點(diǎn)3號(hào)仍有待考察, 也使用了其他蛋白酶和質(zhì)譜。
[0563] 下表不出各種山羊乳樣品的分泌成分的非核心巖藻糖的摩爾含量。
[0564] 表1 :山羊分泌成分的非核心巖藻糖的分析(在糖基化位點(diǎn)1、2和4 (每mol SC的 mmol))

【權(quán)利要求】
1. 一種生產(chǎn)以分泌性免疫球蛋白為基礎(chǔ)的免疫復(fù)合物制劑的方法,所述免疫復(fù)合物制 劑為非人分泌物來(lái)源的,所述方法包括 -提供能夠生產(chǎn)N-糖基化分泌成分的工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)體系, -通過(guò)此類體系生產(chǎn)分泌成分,所述分泌成分包括相對(duì)于每摩爾分泌成分為至少 0? Olmol的非核心巖藻糖,和 _將所述分泌成分與具有天然糖基化模式的IgA或IgM免疫球蛋白的至少之一相結(jié)合, 從而獲得免疫復(fù)合物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述分泌成分源自哺乳動(dòng)物來(lái)源的氨基酸或核苷 酸序列或其嵌合序列,所述哺乳動(dòng)物來(lái)源具體為人、牛、山羊、綿羊、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、豬、駱 駝、單峰駝、驢或馬。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法,其中所述生產(chǎn)體系選自乳腺分泌物和重組細(xì)胞培 養(yǎng)物的合并來(lái)源。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法,其中所述分泌成分富集在所述生產(chǎn)體系的 級(jí)分中,優(yōu)選作為免疫復(fù)合物,且任選地從所述級(jí)分分離。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的方法,其中所述分泌成分由選自由源自至少10個(gè) 泌乳期雌性個(gè)體的乳、乳濃縮物、乳粉、乳清、乳清濃縮物和乳清粉組成的組的合并來(lái)源獲 得。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其中所述個(gè)體為非轉(zhuǎn)基因的且為選自由山羊、豬、牛、 綿羊、馬、驢、單峰駝和駱駝組成的組的物種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法,其中所述個(gè)體選自能夠生產(chǎn)具有路易斯型N-糖基 化的糖蛋白的種群。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的方法,其中所述分泌成分由表達(dá)其中x為2、3或 4的自身或異源功能性a-1,x-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的重組生產(chǎn)型宿主細(xì)胞系獲得,所述重組 生產(chǎn)型宿主細(xì)胞系優(yōu)選選自由人細(xì)胞系、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、鳥類細(xì)胞系、細(xì)菌、植物、酵母、 昆蟲、真菌、苔蘚和古菌組成的組。
9. 一種分離的重組的分泌成分,其包括氨基酸序列SEQ ID 1,或其功能性活性變體,所 述分泌成分具有路易斯型N糖基化模式和相對(duì)于每摩爾分泌成分為至少2mol的非核心巖 藻糖。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的分泌成分,其包括唾液酸,優(yōu)選相對(duì)于每摩爾分泌成分為至 少2mol的唾液酸。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的分泌成分,其為非唾液酸化的,優(yōu)選包括相對(duì)于每摩爾分泌 成分為小于〇? lmol的唾液酸。
12. -種免疫復(fù)合物制劑,其包括根據(jù)權(quán)利要求9至11任一項(xiàng)所述的分泌成分,和IgA 或IgM免疫球蛋白的至少之一,優(yōu)選人免疫球蛋白。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的免疫復(fù)合物制劑,其中所述免疫球蛋白為血漿免疫球蛋 白。
14. 一種免疫復(fù)合物制劑,其以分泌性免疫球蛋白為基礎(chǔ),源自除人分泌物以外的其它 來(lái)源,所述免疫復(fù)合物制劑包括 -分泌成分,其具有路易斯型N糖基化模式和相對(duì)于每摩爾分泌成分為至少0. Olmol的 非核心巖藻糖,和 -具有天然糖基化模式的IgA或IgM免疫球蛋白的至少之一。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的制劑,其包括多聚免疫球蛋白。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的制劑,其包括多反應(yīng)性免疫球蛋白,優(yōu)選天然抗體。
17. -種制劑品,其以液劑、乳劑或懸浮劑的形式或以優(yōu)選噴霧干燥或冷凍干燥的干燥 形式,所述制劑品包括根據(jù)權(quán)利要求9至11任一項(xiàng)所述的分泌成分或根據(jù)權(quán)利要求12至 16任一項(xiàng)所述的制劑。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的制劑品,其以液齊IJ、糖漿齊IJ、錠劑、片劑的形式,例如泡騰片 齊IJ、噴霧劑、吸入器制劑品、粉劑、速溶粉、顆粒劑、栓劑、膠囊劑、霜?jiǎng)?、糊劑、凝膠劑、滴劑、 懸浮劑、乳劑或食品,所述食品包括乳制品和口香糖。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的制劑品,其用作食品和/或用于治療用途。
20. -種配制劑,其包括根據(jù)權(quán)利要求9至11任一項(xiàng)所述的分泌成分、根據(jù)權(quán)利要求 12至16任一項(xiàng)所述的制劑、或根據(jù)權(quán)利要求17至19所述的制劑品,所述配制劑用于治療 或預(yù)防粘膜免疫球蛋白缺陷,優(yōu)選以用于粘膜應(yīng)用的制劑品,優(yōu)選口、支氣管、鼻、陰道、胃 內(nèi)或直腸使用。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK104349789SQ201380029959
【公開日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2013年4月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月5日
【發(fā)明者】戈特弗里德·希姆萊 申請(qǐng)人:戈特弗里德·希姆萊
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