啤酒花品種的識別方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及利用由品種間不同的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性構(gòu)成的識別標(biāo)記的用于識別啤酒花品種的方法以及該識別標(biāo)記的制備方法。本發(fā)明還提供用于該識別啤酒花品種的方法中使用的引物或探針及包含該識別標(biāo)記的區(qū)域的核酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供檢測啤酒花試樣中不同品種混入的方法。
【專利說明】啤酒花品種的識別方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及利用了由品種間不同的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性構(gòu)成的識別標(biāo)記的 用于識別啤酒花品種的方法以及該識別標(biāo)記的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 啤酒花（學(xué)名：Humulus lupulus)為屬于大麻科的雌雄異株的蔓性（攀援）植物。 雌株具有稱為"球花"的像松果形的花的結(jié)構(gòu)，該球花為啤酒的原料。未受精的球花中，有 稱為蛇麻素的黃色顆粒，其為啤酒獨(dú)特的香味、清爽苦味的來源。啤酒花具有賦予啤酒略帶 苦味、爽快的香味、提高泡持性、使啤酒的光澤（色澤）良好、抑制雜菌繁殖的作用，是啤酒 釀造中不可缺少的原料之一。
[0003] 啤酒花在以德國、美國為首的捷克、英國、法國、中國、斯洛文尼亞、南非、澳大利 亞、新西蘭、日本等國栽培，其栽培品種也多種多樣。啤酒花品種中有香型啤酒花和苦型啤 酒花。香型啤酒花為賦予芬芳香味和溫和苦味的啤酒花，苦型啤酒花為賦予具有收斂性的 苦味的啤酒花。如此，啤酒花因各品種的香味、味道不同，所以在釀造高品質(zhì)的啤酒時(shí)，篩選 符合目的的啤酒花品種非常重要。而且，為了穩(wěn)定維持其品質(zhì)，準(zhǔn)確檢查所訂購的原料啤酒 花是否能正確進(jìn)貨非常重要。至今為止，根據(jù)供貨商所提供的品質(zhì)保證書、蛇麻素中所含有 的α酸等成分含量的不同、球花外觀上的差異進(jìn)行確認(rèn)。但是，在日本，通常是購入將啤酒 花的球花干燥、粉碎、壓縮整形制成顆粒狀的啤酒花來用于啤酒釀造。因此，很難從球花外 觀上的特征來識別品種。此外，從球花中得到的苦味成分、精油成分等的化學(xué)成分也易受環(huán) 境因素的影響，還有因品種關(guān)系而顯示近似值的啤酒花等，所以作為識別的指標(biāo)具有局限 性。
[0004] 另一方面，近年來，開發(fā)了一些應(yīng)用基因工程的品種識別方法。這些方法通過檢 測品種間堿基序列的不同，即檢測多態(tài)性來進(jìn)行品種識別。啤酒花中，國際公開公報(bào)（W0 1997/005281)中公開了以下方法，通過RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)法尋找品種間不同的 DNA區(qū)域，設(shè)計(jì)可擴(kuò)增該區(qū)域的引物，通過使用該引物的PCR來擴(kuò)增多態(tài)性區(qū)域，通過分析 擴(kuò)增片段的有無或其大小的差異來識別啤酒花品種，此外，日本特開平11 一 103895公報(bào)中 公開了以下方法，通過使用高濃度的氯化鋰，從啤酒花中高效提取?純化適合PCR的基因 組DNA，相對于該基因組DNA使用隨機(jī)引物、STS (序列標(biāo)簽位點(diǎn)）標(biāo)記的引物等的引物進(jìn)行 PCR，擴(kuò)增可識別啤酒花品種的DNA，通過擴(kuò)增DNA的有無來判別啤酒花品種，而且，日本特 開2006 - 34142公報(bào)中還公開了以下方法，通過使用設(shè)計(jì)成可擴(kuò)增包含品種間多態(tài)性的微 衛(wèi)星區(qū)域的引物來進(jìn)行PCR，擴(kuò)增微衛(wèi)星DNA，通過分析擴(kuò)增DNA片段長度的差異來識別品 種。
[0005] 通過利用啤酒花基因組上的多態(tài)性來識別啤酒花品種的上述方法雖不受啤酒花 的栽培環(huán)境、收獲時(shí)期或保存方法的影響，為可準(zhǔn)確識別啤酒花品種的有效手段，但因這些 方法均需從PCR擴(kuò)增的有無或大小的差異來進(jìn)行識別，所以易受酶反應(yīng)、電泳、凝膠染色等 條件不統(tǒng)一的影響，在再現(xiàn)性上存在問題。即難于區(qū)別是因 PCR、染色的不良好而未出現(xiàn)條 帶，或還是因?yàn)樵揪臀磾U(kuò)增，所以，具有錯(cuò)誤判斷結(jié)果的危險(xiǎn)性。此外，上述方法因是通過 毛細(xì)管電泳及激光的DNA片段檢測、通過凝膠電泳的試樣染色的檢測等，所以，即使可特定 作為被測物的啤酒花品種、甚至可推測有無不同品種混入，但還是難于推斷或特定混入品 種、分析混入品種的混入比例。而且，由于被測物的劣化、損傷等使DNA發(fā)生碎片化時(shí)，會降 低分析精度，有錯(cuò)誤判斷結(jié)果的危險(xiǎn)性。
[0006] 作為極為有用且容易利用的多態(tài)性標(biāo)記，單核苷酸多態(tài)性（以下也稱為"SNP"。） 受人注目。SNP(single nucleotide polymorphism)是基于1個(gè)堿基的不同的堿基序列的 多態(tài)性。因 SNP不受反應(yīng)條件不統(tǒng)一的影響，所以，無疑似結(jié)果，易判斷，且SNP數(shù)據(jù)可轉(zhuǎn)換 為（〇，1)的數(shù)字信號來進(jìn)行信息處理，所以，容易進(jìn)行樣品處理和數(shù)據(jù)分析的自動化，可使 用龐大的SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行各種各樣的分析。此外，用設(shè)計(jì)具有各種各樣長度的非特異性Tail 的引物等的方法，可一次性進(jìn)行大量的SNP分析。
[0007] 但是，啤酒花具有二倍體的20條（雙鏈為10對）染色體，基因組大小為約27? 30億堿基對（2.7?3GB)，非常龐大，與結(jié)構(gòu)基因的關(guān)聯(lián)性尚不明確。因此，還未實(shí)施過從 基因組分析的結(jié)果中找出可進(jìn)行多品種識別程度的充分?jǐn)?shù)量的啤酒花品種間SNP的工作， 至今為止，將SNP用作多態(tài)性標(biāo)記的啤酒花品種的識別方法還不為人所知。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0009] 專利文獻(xiàn)
[0010] 專利文獻(xiàn)1國際公開公報(bào)第W01997/005281號公報(bào)
[0011] 專利文獻(xiàn)2日本特開平11 一 103895號公報(bào)
[0012] 專利文獻(xiàn)3日本特開2006 - 34142號公報(bào)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明提供利用由品種間的單核苷酸多態(tài)性組成的識別標(biāo)記的用于識別啤酒花 品種的方法以及該識別標(biāo)記的制備方法。
[0014] 強(qiáng)烈希望開發(fā)出如下啤酒花品種的識別方法，即在確認(rèn)訂購的原料啤酒花是否為 所訂貨的品種且是否混入了不同品種時(shí)，可不受酶反應(yīng)、電泳、凝膠染色等的條件不統(tǒng)一的 影響而準(zhǔn)確特定品種，檢測有無不同品種混入，不僅如此，在不同品種混入時(shí)，還可推斷或 特定混入品種，可分析其混入比例。
[0015] 本
【發(fā)明者】為解決上述課題，對基于DNA分析的啤酒花品種的識別方法進(jìn)行了深入 研究。對于DNA分析，至今為止已報(bào)道了 SSR(簡單重復(fù)序列）法、RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA)法、RFLP(限制性片段長度多態(tài)性）法、AFLP(擴(kuò)增片段長度多態(tài)性）法等、基于PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物、其限制性內(nèi)切酶片段的大小的不同、有無的方法。但是，這些方法大多操作繁雜， 且易受酶反應(yīng)、電泳、凝膠染色等的條件不統(tǒng)一的影響，再現(xiàn)性令人擔(dān)心，而且在其他品種 混入時(shí)其檢測大多較為困難。我們在近年來使用發(fā)達(dá)的超高速DNA序列分析技術(shù)獲得大量 的數(shù)據(jù)，更加廣泛且高效地搜索SNP，將這些作為識別標(biāo)記，開發(fā)出了準(zhǔn)確且簡便地進(jìn)行啤 酒花品種識別的方法。
[0016] 即方式之一中，本發(fā)明可以為以下內(nèi)容。
[0017] (1) 一種方法，其為啤酒花品種的識別方法，其特征在于，所述方法包含以下工 序：
[0018] ⑴擴(kuò)增來自被測物啤酒花的DNA中的包含品種識別區(qū)域的DNA片段的工序，該品 種識別區(qū)域包含由啤酒花品種間不同的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP)構(gòu)成的識別標(biāo)記；
[0019] (ii)鑒定上述工序（i)中擴(kuò)增的DNA片段中的單核苷酸多態(tài)性的基因型的工序；
[0020] (iii)將上述工序（ii)所鑒定的被測物啤酒花DNA中的品種識別區(qū)域中的單核苷 酸多態(tài)性的基因型與已知啤酒花品種DNA所對應(yīng)的區(qū)域中的單核苷酸多態(tài)性的基因型進(jìn) 行對比，分析該區(qū)域中的單核苷酸多態(tài)性的基因型在被測物啤酒花和已知啤酒花品種之間 為一致或不一致的工序；
[0021] (iv)根據(jù)上述工序（iii)的分析結(jié)果，特定被測物啤酒花品種的工序。
[0022] (2)根據(jù)⑴中所述的方法，其特征在于，工序（ii)如下進(jìn)行，鑒定工序⑴中擴(kuò) 增的DNA片段中的品種識別區(qū)域的堿基序列，且
[0023] 工序（iii)如下進(jìn)行，將工序（ii)所鑒定的被測物啤酒花DNA中的品種識別區(qū)域 的堿基序列與已知啤酒花品種DNA所對應(yīng)的區(qū)域的堿基序列進(jìn)行對比，分析該區(qū)域中的識 別標(biāo)記在被測物啤酒花和已知啤酒花品種之間為一致或不一致。
[0024] (3)根據(jù)⑴中所述的方法，其特征在于，工序（ii)為如下工序，通過使工序⑴ 中擴(kuò)增的DNA片段與檢測啤酒花品種間不同的單核苷酸多態(tài)性的探針及/或引物接觸，而 鑒定單核苷酸多態(tài)性的基因型。
[0025] (4)根據(jù)⑴?⑶中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，品種識別區(qū)域?yàn)榘ㄟ^ 包含以下工序的方法而制備的識別標(biāo)記的區(qū)域：
[0026] (a)使用2個(gè)以上不同品種的啤酒花，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的工序；
[0027] (b)基于由上述工序（a)的結(jié)果得到的DNA片段的堿基序列，對各品種進(jìn)行組裝的 工序；
[0028] (C)將由上述工序（b)的結(jié)果得到的重疊群及/或單拷貝進(jìn)行品種間對比，進(jìn)行品 種間不同的單核苷酸多態(tài)性（SNP)的搜索的工序；
[0029] (d)根據(jù)上述工序（c)的SNP搜索的結(jié)果，選擇包含SNP的區(qū)域，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增該 區(qū)域的引物的工序；
[0030] (e)通過使用上述工序（d)中設(shè)計(jì)的引物，以從啤酒花中提取的DNA為模板，確認(rèn) 上述工序（d)中選擇的區(qū)域可擴(kuò)增，確定該堿基序列，從而確定識別區(qū)域和可擴(kuò)增該識別 區(qū)域的引物的工序；
[0031] (f)使用上述工序（e)中確定的引物，以從識別對象品種的啤酒花中提取的DNA為 模板擴(kuò)增識別區(qū)域，確定識別區(qū)域的堿基序列的工序；及
[0032] (g)將上述工序（f)中確定的識別區(qū)域的堿基序列進(jìn)行品種間對比，確定由用于 識別識別對象品種所必需的SNP的組合構(gòu)成的識別標(biāo)記的工序。
[0033] (5)根據(jù)⑴?⑶中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，品種識別區(qū)域?yàn)榘x自 序列號9、序列號10、序列號11、序列號12、序列號13、序列號14及序列號15中的1個(gè)以上 的堿基序列的一部分或全部，且還包含圖1、圖2、圖3、圖4及圖6中特定的單核苷酸多態(tài)性 或插入缺失部分的至少一個(gè)的區(qū)域。
[0034] (6)根據(jù)⑴?⑶中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，品種識別區(qū)域?yàn)檫x自包含 序列號9表不的喊基序列的區(qū)域、包含序列號10表不的喊基序列的區(qū)域、包含序列號11表 不的喊基序列的區(qū)域、包含序列號12表不的喊基序列的區(qū)域、包含序列號13表不的喊基序 列的區(qū)域、包含序列號14表示的堿基序列的區(qū)域及包含序列號15表示的堿基序列的區(qū)域 中的1個(gè)以上的區(qū)域。
[0035] (7)根據(jù)⑴?⑶中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，品種識別區(qū)域?yàn)椴粌H包含 以下：包含序列號9表不的喊基序列的區(qū)域、包含序列號10表不的喊基序列的區(qū)域，及包含 序列號11表示的堿基序列的區(qū)域的3種區(qū)域，且包含以下：序列號12及/或序列號14表 示的堿基序列的一部分或全部，且還包含圖4中特定的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失部分的 至少1個(gè)的區(qū)域。
[0036] (8)根據(jù)⑴?⑶中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，工序⑴通過使用以下引 物對的PCR反應(yīng)來進(jìn)行，為選自序列號1及序列號2的組合、序列號3及序列號4的組合、 序列號5及序列號6的組合及序列號7及序列號8的組合的引物對。
[0037] (9)根據(jù)⑴?⑶中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，工序⑴通過使用以下引 物對的PCR反應(yīng)來進(jìn)行：不僅為以下：序列號1及序列號2的組合、序列號3及序列號4的 組合以及序列號5及序列號6的組合的3種引物對，還為序列號7及序列號8的組合的引 物對。
[0038] (10) -種方法，其為由啤酒花品種間不同的單核苷酸多態(tài)性的組合構(gòu)成的識別標(biāo) 記的制備方法，其特征在于，所述方法包含以下工序：
[0039] (a)使用2個(gè)以上不同品種的啤酒花，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的工序；
[0040] (b)基于由上述工序（a)的結(jié)果得到的DNA片段的堿基序列，對各品種進(jìn)行組裝的 工序；
[0041] (C)將由上述工序（b)的結(jié)果得到的重疊群及/或單拷貝進(jìn)行品種間對比，進(jìn)行品 種間不同的單核苷酸多態(tài)性（SNP)的搜索的工序；
[0042] (d)根據(jù)上述工序（c)的SNP搜索的結(jié)果，選擇包含SNP的區(qū)域，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增該 區(qū)域的引物的工序；
[0043] (e)通過使用上述工序（d)中設(shè)計(jì)的引物，以從啤酒花中提取的DNA為模板，確認(rèn) 上述工序（d)中選擇的區(qū)域可擴(kuò)增，確定該堿基序列，從而確定識別區(qū)域和可擴(kuò)增該識別 區(qū)域的引物的工序；
[0044] (f)使用上述工序（e)中確定的引物，以從識別對象品種的啤酒花中提取的DNA為 模板擴(kuò)增識別區(qū)域，確定識別區(qū)域的堿基序列的工序；及
[0045] (g)將上述工序（f)中確定的識別區(qū)域的堿基序列進(jìn)行品種間對比，確定由用于 識別識別對象品種所必需的SNP的組合構(gòu)成的識別標(biāo)記的工序。
[0046] (11) -種核酸，其特征在于，包含通過（10)中所述的方法制備的識別標(biāo)記的至少 一部分。
[0047] (12) -種核酸，其特征在于，該核酸包含啤酒花的品種識別區(qū)域，而且，包含選自 序列號9、序列號10、序列號11、序列號12、序列號13、序列號14及序列號15中的1個(gè)以上 的堿基序列的一部分或全部，且還包含圖1、圖2、圖3、圖4及圖6中特定的單核苷酸多態(tài)性 或插入缺失部分的至少一個(gè)。
[0048] (13) -種引物，其特征在于，設(shè)計(jì)為可擴(kuò)增（11)或（12)中所述的核酸。
[0049] (14) 一種引物，其特征在于，由序列號1?8中任一個(gè)所記載的堿基序列組成，在 此，該引物用于啤酒花的品種識別。
[0050] (15) -種探針，其特征在于，用于檢測通過（10)中所述的方法鑒定的品種識別區(qū) 域中的啤酒花品種間不同的單核苷酸多態(tài)性。
[0051] (16) -種探針，其特征在于，可在選自序列號9、序列號10、序列號11、序列號12、 序列號13、序列號14及序列號15中的1個(gè)以上的堿基序列中，檢測圖1、圖2、圖3、圖4或 圖6中特定的位置中的至少1個(gè)單核苷酸多態(tài)性或插入缺失位點(diǎn)，且由此檢測啤酒花品種 間不同的單核苷酸多態(tài)性。
[0052] (17) -種方法，其為檢測啤酒花試樣中的不同品種混入的方法，所述方法包含以 下工序：
[0053] (i)擴(kuò)增從被測物啤酒花試樣中提取的DNA中的包含品種識別區(qū)域的DNA片段的 工序，該品種識別區(qū)域包含由啤酒花品種間不同的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP)構(gòu)成的 識別標(biāo)記；
[0054] (ii)分析上述工序⑴中擴(kuò)增的DNA片段中的品種識別區(qū)域的堿基序列，得到測 序數(shù)據(jù)的工序；
[0055] (iii)將上述工序（ii)中得到的測序數(shù)據(jù)中的構(gòu)成識別標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性 位點(diǎn)的信息與正常品所對應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息進(jìn)行對比的工序；及
[0056] (iv)確定啤酒花試樣中有無不同品種混入的工序，在此，上述工序（ii)中得到的 測序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息與正常品所對應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息一 致時(shí)，判斷為無不同品種混入，或上述工序（ii)中得到的測序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn) 的信息與正常品所對應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息不一致時(shí)，判斷為有不同品種混入。
[0057] (18)根據(jù)（17)中所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包含接在工序（iv)后的以下工 序：
[0058] (V)上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的測序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的 信息與正常品所對應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息不一致時(shí)，由上述工序（ii)中得到的 測序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)中出現(xiàn)的來自正常品以外的信息特定其堿基的工序；及
[0059] (vi)將上述工序（V)中特定的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的與正常品不同的堿基與識 別標(biāo)記對照，從而推斷或特定混入品種的工序。
[0060] (19)根據(jù)（17)中所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包含接在工序（iv)后的以下工 序：
[0061] (V)上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的測序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的 信息與正常品所對應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息不一致時(shí)，由上述工序（ii)中得到的 測序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)中出現(xiàn)的來自正常品以外的信息特定其堿基，并求出混入 比例的工序；及
[0062] (vi)將上述工序（V)中特定的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的與正常品不同的堿基與識 別標(biāo)記對照，從而推斷或特定混入品種和其混入比例的工序。
[0063] (20)根據(jù)⑴?（9)中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，工序（iii)中包含有無 19?25堿基的插入序列的分析。
[0064] 通過可利用由品種間的單核苷酸多態(tài)性組成的識別標(biāo)記來識別啤酒花品種，在確 認(rèn)訂購的原料啤酒花是否為所訂貨的品種且是否混入了不同品種時(shí)，可準(zhǔn)確特定作為被測 物的啤酒花品種及檢測有無不同品種混入。而且不同品種混入時(shí)，不僅可分析有無混入，還 可推斷或特定混入品種，分析其混入比例
[0065] 此外，使用通過本發(fā)明的方法制備的構(gòu)成識別標(biāo)記的堿基的信息，可制備用于識 別目標(biāo)品種的引物、探針，通過使用利用該引物、探針的實(shí)時(shí)PCR法、新一代測序儀進(jìn)行分 析，可期待能對不同品種的混入比例進(jìn)行定量分析。
[0066] 由此，可穩(wěn)定供給目標(biāo)高品質(zhì)的啤酒。此外，即使被測物劣化、損傷時(shí)，也可識別品 種。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0067] 圖1為表示14品種啤酒花的Al區(qū)域中的SNP分析結(jié)果的圖及堿基的編碼表。SNP 的位置表示從Al區(qū)域的共有序列（序列號9)的5'側(cè)開始數(shù)的SNP的位置。分析后的SNP 為24處。用于分析的14種啤酒花被分為9類型（type)的雙體型。
[0068] 圖2為表示14品種啤酒花的Bl區(qū)域中的SNP分析結(jié)果的圖。SNP的位置表示從 Bl區(qū)域的共有序列（序列號10)的5'側(cè)開始數(shù)的SNP的位置。分析后的SNP為10處。用 于分析的14種啤酒花被分為7類型的雙體型。有關(guān)A、G、C、T以外的堿基的標(biāo)記參照圖1 的編碼表。
[0069] 圖3為表示14品種啤酒花的Cl區(qū)域中的SNP分析結(jié)果的圖。SNP的位置表示從 Cl區(qū)域的共有序列（序列號11)的5'側(cè)開始數(shù)的SNP的位置。分析后的SNP為29處，其 中，序列號11的第129?134位的堿基為插入缺失（indel)部分。用于分析的14種啤酒 花被分為3類型的雙體型。有關(guān)A、G、C、T以外的堿基的標(biāo)記參照圖1的編碼表。
[0070] 圖4為表不珍珠（Perle)及北釀（Northern Brewer)的Al - 2 - L區(qū)域及Al - 2 - R區(qū)域中的SNP分析結(jié)果的圖。SNP的位置表示分別從Al - 2 - L區(qū)域的2品種共有 序列（序列號12)及Al - 2 - R區(qū)域的2品種共有序列（序列號14)的5'側(cè)開始數(shù)的 SNP的位置。對Al - 2 - L區(qū)域進(jìn)行分析后的SNP為21處，其中，序列號12的第186? 194及第399位的堿基為插入缺失（indel)部分。對Al - 2 - R區(qū)域進(jìn)行分析后的SNP 為67處，其中，序列號14的第57?59及第65位的堿基為插入缺失（indel)部分。珍珠 (Perle)及北釀（Northern Brewer)表不不同的雙體型。
[0071] 圖5為歸納用于品種識別試驗(yàn)的啤酒花品種和識別標(biāo)記的雙體型的表。
[0072] 圖6為表示斯拉德克（Slddek)、斯派爾特（Spalter)、珍珠（Perle)、泰特南 (Tettnang)及北釀（Northern Brewer)的 Al - 2 - L 區(qū)域及 Al - 2 - R 區(qū)域中的 SNP 分 析結(jié)果的圖。SNP的位置表示分別從Al - 2 - L區(qū)域的5品種共有序列（序列號13)及 Al - 2 - R區(qū)域的5品種共有序列（序列號15)的5'側(cè)開始數(shù)的SNP的位置。對Al - 2 - L區(qū)域進(jìn)行分析后的SNP為23處，其中，序列號13的第12、第183?191及第396位 的堿基為插入缺失（indel)部分。對Al - 2 - R區(qū)域進(jìn)行分析后的SNP為28處，其中，序 列號15的第437位的堿基為插入缺失（indel)部分。表示用于分析的5個(gè)品種啤酒花的 Al - 2 - L區(qū)域中的各個(gè)不同的雙體型，在Al - 2 - R區(qū)域中被分為4類型的雙體型。
[0073] 圖7為歸納斯拉德克（Slddek)、斯派爾特（Spalter)、珍珠（Perle)、泰特南 (Tettnang)及北釀（Northern Brewer)的Al - 2 - L區(qū)域（序列號13)中識別標(biāo)記的雙 體型的表。
[0074] 圖8為表示分析薩茲（Saaz)及普萊米特（Premiant)的混合試樣的Al區(qū)域堿基 序列的結(jié)果的電泳圖。Al區(qū)域的堿基號根據(jù)序列號9中的堿基號。

【具體實(shí)施方式】
[0075] 以下具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些。本發(fā)明涉及利用由品種間不同的至 少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP)構(gòu)成的識別標(biāo)記的用于識別啤酒花品種的方法、該識別標(biāo)記 的制備方法、檢測利用該識別標(biāo)記的啤酒花試樣中不同品種混入的方法、該識別標(biāo)記、設(shè)計(jì) 為可擴(kuò)增具有該識別標(biāo)記的區(qū)域的品種識別引物及用于檢測該識別標(biāo)記的品種識別探針。
[0076] <本發(fā)明的概要>
[0077] 本申請涉及如下發(fā)明，其特征在于，使用由品種間不同的至少1個(gè)SNP構(gòu)成的識別 標(biāo)記來識別啤酒花品種。具體而言，提取被測物啤酒花的DNA，分析具有與由SNP組成的識 別標(biāo)記區(qū)域的堿基序列對應(yīng)的堿基序列中的識別標(biāo)記所對應(yīng)位點(diǎn)的堿基是否與識別標(biāo)記 的堿基一致，為一致時(shí)，即將被測物啤酒花品種特定為識別標(biāo)記的品種。
[0078] < 定義 >
[0079] 本說明書中只要不特別定義，與本發(fā)明相關(guān)使用的科學(xué)用語及技術(shù)用語具有本領(lǐng) 域技術(shù)人員通常理解的意思。
[0080] 本說明書中，"識別標(biāo)記"是指用于識別啤酒花品種的指標(biāo)，由品種間不同的1以上 的單核苷酸多態(tài)性構(gòu)成。為使本發(fā)明的識別標(biāo)記在識別對象品種間不重復(fù)，將品種與識別 標(biāo)記以一一對應(yīng)的方式來確定，但也可根據(jù)作為識別對象的品種的數(shù)量、種類來變更構(gòu)成 識別標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性。例如，需要識別的品種僅為2品種時(shí)，使用由1個(gè)單核苷酸多 態(tài)性構(gòu)成的識別標(biāo)記即足夠，需要識別的品種為多個(gè)的情況下，通過多個(gè)單核苷酸多態(tài)性 的組合（根據(jù)情況為多個(gè)識別區(qū)域的多個(gè)單核苷酸多態(tài)性的組合）以不重復(fù)的方式來確定 識別標(biāo)記。識別標(biāo)記原則上以不重復(fù)的方式來確定，但根據(jù)識別的目的，也可將識別標(biāo)記重 復(fù)的多個(gè)品種（即具有相同識別標(biāo)記的多個(gè)品種）看成1個(gè)組，與1個(gè)識別標(biāo)記對應(yīng)而使 用。
[0081] 本說明書中，"識別區(qū)域"是指包含來自啤酒花DNA中的識別標(biāo)記的區(qū)域。識別區(qū) 域不限于1個(gè)區(qū)域，也可為多個(gè)區(qū)域。而且，識別區(qū)域中，有時(shí)將品種識別時(shí)被測物的DNA 片段進(jìn)行擴(kuò)增的核酸區(qū)域特別記為"品種識別區(qū)域"。品種識別區(qū)域也可為與識別區(qū)域相同 的區(qū)域，還可根據(jù)品種識別的目的而另行設(shè)定。此外，品種識別區(qū)域不限于1個(gè)區(qū)域，也可 為多個(gè)區(qū)域。
[0082] <識別標(biāo)記的制各方法>
[0083] 本申請?zhí)峁┲苽溆糜谧R別啤酒花品種的識別標(biāo)記的方法。
[0084] 在方式之一中，本發(fā)明的識別標(biāo)記如下制備，使用2個(gè)以上不同品種的啤酒花，進(jìn) 行轉(zhuǎn)錄組分析，選定單核苷酸多態(tài)性（SNP)較多存在的區(qū)域，設(shè)計(jì)引物，確定識別區(qū)域和可 擴(kuò)增該識別區(qū)域的引物。而后通過從識別對象的品種中提取DNA、使用所述引物、擴(kuò)增識別 區(qū)域、確定堿基序列、進(jìn)行品種間對比，通過確定由識別對象品種的識別中必需的至少1個(gè) SNP構(gòu)成的識別標(biāo)記而來制備。
[0085] 具體而言，制備用于識別啤酒花品種的識別標(biāo)記的方法也可包含以下工序：
[0086] (a)使用2個(gè)以上不同品種的啤酒花，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的工序；
[0087] (b)基于由上述工序（a)的結(jié)果得到的DNA片段的堿基序列，對各品種進(jìn)行組裝的 工序；
[0088] (C)將由上述工序（b)的結(jié)果得到的重疊群及/或單拷貝進(jìn)行品種間對比，進(jìn)行品 種間不同的單核苷酸多態(tài)性（SNP)的搜索的工序；
[0089] (d)根據(jù)上述工序（c)的SNP搜索的結(jié)果，選擇包含SNP的區(qū)域，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增該 區(qū)域的引物的工序；
[0090] (e)通過使用上述工序（d)中設(shè)計(jì)的引物，以從啤酒花中提取的DNA為模板，確認(rèn) 上述工序（d)中選擇的區(qū)域可擴(kuò)增，確定該堿基序列，從而確定識別區(qū)域和可擴(kuò)增該識別 區(qū)域的引物的工序；
[0091] (f)使用上述工序（e)中確定的引物，以從識別對象品種的啤酒花中提取的DNA為 模板擴(kuò)增識別區(qū)域，確定識別區(qū)域的堿基序列的工序；及
[0092] (g)將上述工序（f)中確定的識別區(qū)域的堿基序列進(jìn)行品種間對比，確定由用于 識別識別對象品種所必需的SNP的組合構(gòu)成的識別標(biāo)記的工序。但本發(fā)明不限于這些方 法，也可將通常已知的其他方法適當(dāng)改變使用。
[0093] 對上述工序（a)?（g)如下進(jìn)行說明。
[0094] (a)彳申用啤酒花分析轉(zhuǎn)錄纟的工序
[0095] 為了搜索識別標(biāo)記中應(yīng)含有的候選SNP，首先，使用2個(gè)以上不同品種的啤酒花， 分別對其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。
[0096] 轉(zhuǎn)錄組（transcriptome)是指某些特定狀態(tài)的組織、細(xì)胞中存在的總mRNA(或?yàn)?初級轉(zhuǎn)錄物、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（transcripts))的總體。
[0097] 以下將本發(fā)明中轉(zhuǎn)錄組分析的順序作為一例進(jìn)行說明，但不特別限定于此。首先， 分別從啤酒花的多個(gè)品種的組織中粗提取總RNA，純化總RNA中的總mRNA (poly (A)+RNA)， 進(jìn)行以該mRNA為模板的cDNA的合成。因所得到的cDNA文庫中表達(dá)量多的和少的混合存 在，所以，需校正表達(dá)量的不同（均一化），進(jìn)而進(jìn)行以大小（size)為基準(zhǔn)的純化。而后，使 用超高速DNA序列分析裝置進(jìn)行cDNA的測序分析。
[0098] 作為提取上述總RNA的啤酒花的組織，適合使用構(gòu)成芽、葉、莖、球花的各種組織， 但不特別限定于此。此外，從啤酒花植株上采集上述組織時(shí)，啤酒花植株的栽培方法、其生 長發(fā)育階段等也無特別限定。而且，作為啤酒花的組織，可為鮮組織，也可為干燥組織，還可 以加工成例如顆粒狀。但是，因 RNA易分解，所以，優(yōu)選立刻使用從啤酒花植株上采集的新 鮮組織，且作為富含RNA的組織，優(yōu)選使用嫩葉。此外，在采集分析用試樣時(shí)，優(yōu)選采取極力 防止RNA分解的措施，努力防止污染。
[0099] 此外，轉(zhuǎn)錄組分析中使用的啤酒花品種可使用2品種以上的不同品種，所使用的 品種、數(shù)量可根據(jù)目的不同來選擇。另外，為了檢測更大量的SNP，優(yōu)選使用3品種以上的不 同品種。此外，優(yōu)選從識別對象品種中選擇使用。
[0100] 啤酒花組織中的總RNA的提取?CDNA的測序分析的轉(zhuǎn)錄組分析的各步驟可采用 通常采用的方法進(jìn)行。
[01 01 ] (b)對各品種講_彳丁組裝的下序
[0102] 基于如上所述各品種中用轉(zhuǎn)錄組分析而明確的DNA片段（cDNA)的堿基序列，對各 品種進(jìn)行序列組裝。序列組裝是指由短的DNA片段再構(gòu)建原本的長的堿基序列。例如基于 由工序（a)的結(jié)果得到的DNA片段的堿基序列，對是否具有相互重疊的堿基序列進(jìn)行聚類 分析（Clustering)，尋找聚類后的一系列DNA片段中的重疊部分進(jìn)行拼接（組裝），而得到 一個(gè)序列。將如此組裝的序列總稱為"重疊群（contig) "，此外，將重疊群形成時(shí)未附加的 單端（single read)總稱為"單拷貝（singlet)"。通過序列組裝的重疊群的制備可通過通 常采用的方法進(jìn)行。
[0103] (c)檢測品種間對應(yīng)的喊某的不同的下序
[0104] 如上所述，基于對各品種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析而明確的DNA片段的堿基序列，以相互 重疊的序列部分為基礎(chǔ)進(jìn)行組裝而制備重疊群。使用由此得到的重疊群序列及/或單拷貝 序列，檢測品種間對應(yīng)的喊基的不同（在此為SNP)。
[0105] 檢測2品種以上品種間對應(yīng)的堿基的不同時(shí)，首先是將其中1品種作為參照序列 (參考序列）來選擇。而后，將所選擇的品種的重疊群及/或單拷貝（優(yōu)選為重疊群，更優(yōu) 選為重疊群及單拷貝）指定為參考序列，以此為基準(zhǔn)，將其他品種的單端以是否具有共有 部分的方式分別作圖（mapping)。進(jìn)而，從在分析軟件上開發(fā)的組裝信息中推斷出已作圖 (mapping)的單端成為構(gòu)成要素的重疊群。將如此得到的參考序列與其他品種的重疊群及 /或單拷貝進(jìn)行比對，以檢測SNP。另外，因僅1品種的參考序列中有忽略SNP的可能性，所 以，優(yōu)選將其他品種分別作為參考序列，與上述同樣進(jìn)行作圖（mapping)、比對而檢測SNP， 將這些結(jié)果綜合為SNP數(shù)據(jù)。通過將各種不同品種作為參考序列來檢測SNP，可檢測更多的 SNP，可選擇更適合作為識別標(biāo)記的SNP。且在檢測出本發(fā)明中3品種以上的品種間對應(yīng)的 喊基的不同時(shí)，在品種間對應(yīng)的喊基中，至少任意2品種間不同時(shí)，即可視為SNP。在檢測品 種間對應(yīng)的堿基的不同時(shí)，可用通常采用的方法進(jìn)行。上述方法為一例，但不限定于此。作 為其他方法，也可通過使用1品種的重疊群序列進(jìn)行BLAST搜索，來檢測不同。
[0106] (d)詵擇含有SNP的區(qū)域設(shè)計(jì)引物的工序
[0107] 如此，由使用重疊群序列及/或單拷貝序列檢測SNP的結(jié)果，選擇可用于識別的 SNP存在的區(qū)域。以多個(gè)品種的識別為目的時(shí)，希望選擇SNP大量存在的區(qū)域。更具體而 言，可例示從分析的容易度出發(fā)，優(yōu)選純合子（2倍體的各個(gè)雙鏈間堿基序列為一致）中的 SNP存在的區(qū)域，且選擇單位重疊群中SNP數(shù)多的區(qū)域，但無特別限定。
[0108] 其后，設(shè)計(jì)可擴(kuò)增該區(qū)域的引物。引物的設(shè)計(jì)可通過通常采用的方法進(jìn)行。
[0109] (e)確定識別區(qū)域和可擴(kuò)增該識別區(qū)域的引物的工序
[0110] 因如上所述設(shè)計(jì)的引物是基于從cDNA文庫中制備的重疊群序列或單拷貝序列而 設(shè)計(jì)的引物，所以，是否良好擴(kuò)增包含啟動子區(qū)域、內(nèi)含子的基因組的DNA還不得而知。因 此，需要使用從啤酒花中提取的基因組DNA來確認(rèn)擴(kuò)增。此外，即使在擴(kuò)增時(shí)也要確認(rèn)插入 缺失（indel)、微衛(wèi)星的有無、目標(biāo)SNP的存在，所以，需要進(jìn)行根據(jù)雙脫氧測序法（SANGER) 等的堿基序列的確認(rèn)。因此，使用工序（d)中設(shè)計(jì)的引物，以啤酒花品種（優(yōu)選為工序（a) 中使用的啤酒花品種）的顆粒、干燥球花等中提取的基因組DNA為模板，擴(kuò)增含有SNP的區(qū) 域并進(jìn)行測序。由此，確認(rèn)能以適當(dāng)大小進(jìn)行擴(kuò)增及與基于所述轉(zhuǎn)錄組分析的堿基序列進(jìn) 行對比可適用于品種識別，以確定可用于識別的區(qū)域（識別區(qū)域）和可擴(kuò)增該區(qū)域的引物。 由于內(nèi)含子的存在等無法擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增大小、堿基序列中有不合適、不良好時(shí)，要進(jìn)行選擇 區(qū)域的再探討、引物的再設(shè)計(jì)。
[0111] 另外，用于制備識別標(biāo)記的識別區(qū)域不限于1個(gè)區(qū)域，也可選擇多個(gè)區(qū)域。通過選 擇多個(gè)區(qū)域可識別更多的品種。
[0112] 此外，識別區(qū)域中也可包含插入缺失（indel)部分。從廣義上講，單核苷酸多態(tài)性 (SNP)中也可包含插入缺失（indel)，本發(fā)明中，作為構(gòu)成識別標(biāo)記的SNP，也可利用插入缺 失（indel)部分。
[0113] (f)確定識別區(qū)域的堿某序列的工序及（g)確定識別對象品種的識別標(biāo)記的工序
[0114] 使用工序（e)中確定的可擴(kuò)增識別區(qū)域的引物，以從識別對象品種中提取的基因 組DNA為模板分別擴(kuò)增識別區(qū)域。
[0115] 本說明書中，識別對象品種是指作為識別的對象而選擇的啤酒花品種，包含2個(gè) 以上不同品種。啤酒花只要是被分類為學(xué)名Humulus lupulus的植物，無特別限定。例如 可列舉以德國、美國、捷克、英國、法國、中國、斯洛文尼亞、南非、澳大利亞、新西蘭、日本等 為原產(chǎn)國的啤酒花。
[0116] 作為歐洲原產(chǎn)的啤酒花的例子，可列舉薩茲（Saaz)、斯拉德克（Slddek)、普萊米 特（Premiant)、傳統(tǒng)（Tradition)、斯派爾特（Spalter)、斯派爾特精選（Spalter Select)、 珍珠（Perle)、泰特南（Tettnang)、金釀（Brewer，s Gold)、北釀（Northern Brewer)、馬格 努門（Magnum)、海格立斯（Herkules)、德國努格特（German Nugget)、陶若斯（Taurus)、阿 德米瑞（Admiral)、奧羅拉（Aurora)、赫斯布魯克（Hersbrucker)、哈拉道默克（Hallertau Merkur)、Hallertau Mittelfrueh、塔格特（Target)等，但不限于這些。
[0117] 作為美國原產(chǎn)的啤酒花的例子，可列舉阿瑪里洛（Amarillo)、卡斯卡特 (Cascade)、世紀(jì)（Centennial)、奇努克（Chinook)、克雷斯特（Cluster)、哥倫布 (Columbus)、水晶（Crystal)、富格爾（Fuggle)、格林納（Galena)、哥爾丁（Golding)、 Horizon、自由（Liberty)、胡德峰（Mount Hood)、努格特（Nugget)、Santiam、斯特林 (Sterling)、薩米特（Summit)、超級格林納（Super Galena)、泰特楠捷（Tettnanger)、戰(zhàn)斧 (Tomahawk)、烏爾特拉（Ultra)、威廉麥特（Willamette)、宙斯（Zeus)等，但不限于這些。
[0118] 根據(jù)識別的目的不同，可自由設(shè)定對象品種的種類、數(shù)量。例如，可選擇與栽培地 鄰近的品種等，可根據(jù)其各個(gè)時(shí)期的目的不同而選擇對象品種。
[0119] 作為方式之一，識別對象品種為實(shí)施例1的表4中所示的以德國及捷克為原產(chǎn)國 的14種啤酒花。
[0120] 對于此種根據(jù)目的而選擇的識別對象品種，進(jìn)行擴(kuò)增DNA片段的測序，確定堿基 序列。
[0121] 對工序（f)中確定的各識別對象品種的識別區(qū)域的堿基序列進(jìn)行比對，提取SNP 部分。為使識別對象品種間不重復(fù)，以品種和識別標(biāo)記為一一對應(yīng)的方式來組合所提取的 SNP，確定識別標(biāo)記。
[0122] 在此，上述工序（f)及（g)可根據(jù)以下（1)?（11)中所示的順序進(jìn)行。
[0123] (1)啤酒花的獲得
[0124] 本發(fā)明中使用的"DNA"可通過從啤酒花的組織中提取DNA來得到。作為啤酒花的 組織，適合使用構(gòu)成芽、葉、莖、球花的各種組織，但不特別限定于此。此外，從啤酒花植株上 采集上述組織時(shí)，對啤酒花植株的栽培方法、其生長發(fā)育階段等也無特別限定。而且作為啤 酒花的組織，可為鮮組織，也可為干燥組織，此外，也可為例如加工成顆粒狀的啤酒花的組 織。
[0125] (2) DNA 的提取
[0126] DNA的提取可使用CTAB(十六燒基三甲基溴化銨：Cetyltrimethyl ammonium bromide)法、市售試劑盒的Qiagen DNeasy Tissue Kit(QIAGEN公司）、IS0PLANT II(日本 基因公司）等本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法提取。從操作性和經(jīng)濟(jì)性的方面考慮，優(yōu)選CTAB 法。
[0127] (3) DNA片段的擴(kuò)增
[0128] 通過PCR法擴(kuò)增如上所述提取的DNA。本發(fā)明中使用的PCR法無特別限定，不僅包 含公知的PCR法，還包含各種改良方法。以下為其中一例。
[0129] 即除了引物對、模板DNA以外，混合Tris - HCl、KCl、MgCl2、各dNTP、TaqDNA聚合 酶等的試劑類，作為PCR反應(yīng)液。PCR的1個(gè)循環(huán)由熱變性、退火、通過DNA聚合酶的DNA鏈 的延伸（合成）反應(yīng)的3步組成。各步反應(yīng)各有不同，根據(jù)情況需要同一反應(yīng)溫度和反應(yīng) 時(shí)間，這些可通過應(yīng)擴(kuò)增的DNA區(qū)域的堿基序列、其長度等適當(dāng)確定。此種操作可使用市售 的基因擴(kuò)增儀進(jìn)行。
[0130] 作為本發(fā)明中使用的引物，使用所述工序（e)中確定的可擴(kuò)增識別區(qū)域的引物 對。例如可使用本
【發(fā)明者】確定的引物對（Al - 3L/A1 - 3R(序列號1及2))、引物對（BI - 1L/B1 - 1R(序列號3及4))、引物對（Cl 一 1L/C1 一 1R(序列號5及6))及/或引物對 (Al - 2 - 1L/A1 - 2 - 1R(序列號 7 及 8))。
[0131] (4)通過PCR的擴(kuò)增的確認(rèn)
[0132] 作為PCR結(jié)果（PCR產(chǎn)物）的評價(jià)方法，使用可鑒定特定DNA片段的任意方法，例如 電泳、凝膠過濾、雜交，確認(rèn)目的大小的DNA片段進(jìn)行了擴(kuò)增。例如，分別確認(rèn)出使用引物對 (Al - 3L/A1 - 3R(序列號1及2))時(shí)，擴(kuò)增到大小為651堿基長；使用引物對（BI - IL/ Bl - 1R(序列號3及4))時(shí)，擴(kuò)增到大小為729堿基長；使用引物對（Cl 一 1L/C1 一 IR(序 列號5及6))時(shí)，擴(kuò)增到大小為646堿基長；使用引物對（Al - 2 - 1L/A1 - 2 - IR(序列 號7及8))時(shí)，擴(kuò)增到大小為約1500堿基長。
[0133] (5) PCR產(chǎn)物的純化
[0134] 所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物因作為循環(huán)測序反應(yīng)的模板使用，所以與剩余的引物等的在反 應(yīng)中使用的成分分離。該純化例如可使用市售的QIAquick PCR Purific ation Kit (QIAGEN 公司），根據(jù)其產(chǎn)品中附帶的實(shí)驗(yàn)方法來進(jìn)行。
[0135] (6)循環(huán)測序反應(yīng)及測序產(chǎn)物的純化
[0136] 因進(jìn)行如上所述純化的PCR產(chǎn)物的測序，所以，以其為模板，進(jìn)行循環(huán)測序反應(yīng)。 該方法為如下方法，與PCR法類似，使用基因擴(kuò)增儀，重復(fù)進(jìn)行熱變性、退火、通過DNA聚合 酶的DNA鏈的延伸反應(yīng)的3步，使用其中任意1種引物，在用各個(gè)堿基不同的4種熒光色素 標(biāo)記的終止子存在下，合成長度不同的各種單鏈DNA。循環(huán)測序的方法例如可使用市售的 BigDye Terminator vl. ICycle Sequencing Kit (Life Technologies) 〇 具體而言，可根據(jù) 該試劑盒的日語版實(shí)驗(yàn)方法（P. 22 "單鏈DNA、雙鏈DNA的循環(huán)測序"、p. 25 "GeneAmpPCR System9700, 9600, 2700, 2400 中的循環(huán)測序"及 ρ· 38 - 40 "旋轉(zhuǎn)柱（和 Spin Plate)中的 純化法"）實(shí)施。且所使用的引物的堿基序列可與通過目的DNA片段的PCR的擴(kuò)增中使用的 堿基序列相同。即在根據(jù)需要用滅菌蒸餾水稀釋PCR產(chǎn)物的純化液后加入規(guī)定的物質(zhì)，制 備循環(huán)測序反應(yīng)液。將其加入PCR用微型離心管中，安裝在PCR裝置上，進(jìn)行變性（例如， 96°C、1分鐘）后，重復(fù)進(jìn)行例如25次變性（例如，96°C、10秒）、退火（例如，50°C、5秒）、 鏈延伸（例如，60°C、4分鐘）的反應(yīng)。另外，反應(yīng)終止后，不立即取出樣品時(shí)，可降低樣品模 塊的溫度來保持。
[0137] 其后，從上述中得到的反應(yīng)液中，純化測序產(chǎn)物、即單鏈DNA的混合液，制備以 后的用于測序儀的試樣。作為該方法的一例，可列舉使用CENTRISEP Spin C〇lumn(Life Technologies)的方法，根據(jù)附帶的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作，得到目的試樣。
[0138] (7) DNA片段的測序
[0139] 對于用上述Dye Terminator法得到的測序產(chǎn)物進(jìn)行測序。作為方法，通常使用電 泳法，作為一例，可列舉使用ABI PRISM 310Genetic Analyzer進(jìn)行電泳，利用標(biāo)記中使用 的熒光物質(zhì)在各個(gè)堿基中的不同，通過激光熒光檢測儀依次確定堿基序列。
[0140] (8)堿基序列的分析
[0141] 分析所確定的堿基序列，得到測序數(shù)據(jù)。對照分別得到的測序數(shù)據(jù)，確定正確的堿 基序列。
[0142] (9)堿基序列的比對
[0143] 對如上所述得到的識別對象品種的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對。
[0144] (10)全部識別對象品種的上述堿基序列中保守的堿基除外
[0145] 如此，比對的結(jié)果，從上述堿基序列中，將由全部識別對象品種的上述堿基序列中 保守的1個(gè)或其以上的堿基形成的位點(diǎn)除外。如此，通過將全部的上述堿基序列中保守的 堿基位點(diǎn)除外，可明確地確認(rèn)單核苷酸多態(tài)性的存在，而且，在之后的工序中，可容易地進(jìn) 行基于單核苷酸多態(tài)性的識別標(biāo)記的確定。
[0146] 具體而言，從通過比對而得到的數(shù)據(jù)中，提取全部識別對象品種的堿基序列中堿 基保守的位點(diǎn)。"堿基保守"是指所得到的比對數(shù)據(jù)的縱列在全部識別對象品種的堿基序列 中均為相同的堿基。將所提取的位點(diǎn)全部除外。將所保守的位點(diǎn)全部除外的理由如下。
[0147] 即對比啤酒花品種的堿基序列時(shí)，認(rèn)為大部分的堿基在全部識別對象品種中共有 存在。但是，本發(fā)明的特征在于，著眼于除去與全部識別對象品種共有的部分的單核苷酸多 態(tài)性的部分，基于該單核苷酸多態(tài)性與品種具有相關(guān)性，從而制備識別標(biāo)記。
[0148] 提取的方法只要是可提取全部識別對象品種的堿基序列中保守的堿基的方法，也 可使用目測、機(jī)械操作等的任何方法。
[0149] (11)識別標(biāo)記的確定
[0150] 使用進(jìn)行了上述除外后剩余的SNP，確定識別標(biāo)記。如前所述，為使本發(fā)明的識別 標(biāo)記在識別對象品種間不重復(fù)，以一一對應(yīng)的方式確定品種和識別標(biāo)記。另外，識別標(biāo)記每 次均需根據(jù)其使用目的、即作為識別對象的品種的數(shù)量、種類，而確定構(gòu)成識別標(biāo)記的SNP。 例如，僅識別特定的2品種時(shí)，可選擇1處可進(jìn)行該2品種識別的SNP來作為識別標(biāo)記。此 夕卜，需要識別多個(gè)品種時(shí)，可通過將多處的SNP (根據(jù)情況，將多個(gè)識別區(qū)域的多處的SNP) 組合，確定識別標(biāo)記，使其在該品種間不重復(fù)。
[0151] 例如，將以下實(shí)施例1中記載的如表4中所示的14品種啤酒花作為識別對象時(shí)， 該14品種中，Al區(qū)域（序列號9)中存在的24處SNP可分為9類型，Bl區(qū)域（序列號10) 中存在的10處SNP可分為7類型，Cl區(qū)域（序列號11)中存在的29處SNP(其中，相當(dāng)于 序列號11的第129?134位的堿基的6處為插入缺失部分）可分為3類型，通過將這些組 合，可將14品種分為13類型。即對14品種中的12品種，可通過Al區(qū)域、Bl區(qū)域、Cl區(qū)域 中分別存在的SNP，使識別標(biāo)記和品種一一對應(yīng)。而且因剩余的1類型適合類似的2品種， 所以，作為識別這些類似的2品種的區(qū)域，可通過Al - 2 - L區(qū)域（序列號12)中存在的 21處SNP (其中，10處為插入缺失部分）及Al - 2 - R區(qū)域（序列號14)中存在的67處 SNP(其中，4處為插入缺失部分）的任一個(gè)，使識別標(biāo)記與2品種對應(yīng)。如此，在識別上述 的14品種時(shí)，可將Al區(qū)域的24處SNP、Bl區(qū)域的10處SNP、Cl區(qū)域的29處SNP (其中，6 處為插入缺失部分）以及Al - 2 - L區(qū)域及Al - 2 - R區(qū)域中的任意1個(gè)的SNP的合計(jì) 64處SNP確定為識別標(biāo)記。此外，例如從上述14品種中選擇一些品種作為識別對象時(shí)，也 可從上述64處SNP中選擇用于識別該識別對象品種所必需的SNP，而確定為識別標(biāo)記。
[0152] 此外，例如僅將上述類似2品種作為識別對象品種時(shí)，可將Al - 2 - L區(qū)域及 Al - 2 - R區(qū)域中的任一個(gè)SNP確定為識別標(biāo)記。而且，將如以下實(shí)施例1中記載的表4 中所示的14品種啤酒花中的斯拉德克（Slddek)、斯派爾特（Spalter)、珍珠（Perle)、泰特 南（Tettnang)及北釀（Northern Brewer)的5品種作為識別對象品種時(shí)，可將Al - 2 - L區(qū)域（序列號13)中存在的23處SNP(其中，11處為插入缺失部分）確定為識別標(biāo)記。
[0153] 上述記載中，作為識別對象品種，將實(shí)施例1的表4中所示的以德國及捷克為原產(chǎn) 國的14種啤酒花的情況作為例子來進(jìn)行說明，包含以美國為原產(chǎn)國的品種的更多品種的 識別方式希望參照實(shí)施例5。如表20中所示，方框中所包圍的22堿基（堿基號64 - 85) 被認(rèn)定是普萊米特（Premiant)和薩米特（Summit),相對于此，宙斯（Zeus)中不存在其插 入序列。如此，插入序列的有無也可作為品種識別的要素。插入序列的長度無特別限制，例 如為19?25堿基。而且，該插入序列中也確認(rèn)有SNP (堿基號64位、67位、75位），也可 將插入序列中的SNP作為識別標(biāo)記。作為進(jìn)一步的識別要素，該插入序列之后直到堿基號 141的（CA)或（TA)的重復(fù)序列的長度也成為識別要素。例如，與普萊米特（Premiant)和 宙斯（Zeus)相比，薩米特（Summit)為12堿基長的結(jié)構(gòu)。
[0154] 此外，如上所述，將表4中所示的14品種啤酒花作為識別對象時(shí)，Bl區(qū)域（序列號 10) 中存在的10處SNP可分為7類型，包含以美國為原產(chǎn)國的品種（例如格林納（Galena)) 時(shí)，第245?248位的堿基也為SNP，成為識別標(biāo)記。
[0155] 而且，如上所述，將表4中所示的14品種啤酒花作為識別對象時(shí)，Cl區(qū)域（序列號 11) 中存在的29處SNP可分為3類型，包含以美國為原產(chǎn)國的品種（例如格林納（Galena)) 時(shí)，第 76 ?80、93、136、138、163、165、245、313、321、373、376、435、438位的堿基也5咿，成為 識別標(biāo)記。
[0156] 在其他方式中，本發(fā)明的識別標(biāo)記也可使用來自2個(gè)以上不同品種啤酒花的基因 組DNA、線粒體DNA、葉綠體DNA來制備。優(yōu)選為也可使用來自2個(gè)以上不同品種啤酒花的 基因組DNA。
[0157] 在制備用于使用基因組DNA、線粒體DNA或葉綠體DNA識別啤酒花品種的識別標(biāo)記 時(shí)，制備識別標(biāo)記的方法也可包含以下工序：
[0158] (a-Ι)從2個(gè)以上不同品種的啤酒花的組織中提取基因組DNA、線粒體DNA或葉綠 體DNA的工序；
[0159] (a-2)隨機(jī)切割由上述工序（a-Ι)的結(jié)果得到的DNA，篩選適合尺寸的片段的工 序；
[0160] (a-3)確定上述工序（a-2)中得到的DNA片段的堿基序列的工序；
[0161] (b)基于由上述工序（a-3)的結(jié)果得到的DNA片段的堿基序列，對各品種進(jìn)行組裝 的工序；
[0162] (C)將由上述工序（b)的結(jié)果得到的重疊群及/或單拷貝進(jìn)行品種間對比，進(jìn)行品 種間不同的單核苷酸多態(tài)性（SNP)的搜索的工序；
[0163] ⑷根據(jù)上述工序（c)的SNP搜索的結(jié)果，選擇包含SNP的識別區(qū)域，設(shè)計(jì)用于擴(kuò) 增該區(qū)域的引物的工序；
[0164] (f)使用上述工序（d)中設(shè)計(jì)的引物，以從識別對象品種的啤酒花中提取的DNA為 模板擴(kuò)增識別區(qū)域，確定識別區(qū)域的堿基序列的工序；及
[0165] (g)將上述工序（f)中確定的識別區(qū)域的堿基序列進(jìn)行品種間對比，確定由用于 識別識別對象品種所必需的SNP的組合構(gòu)成的識別標(biāo)記的工序。
[0166] 工序（a-Ι)?（a-3)可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。特別是為了得到大 量的DNA片段，在確定DNA片段的堿基序列時(shí)，優(yōu)選使用超高速DNA序列分析裝置。
[0167] 工序（b)?（d)及（f)?（g)可用作為上述記載的方式的通過轉(zhuǎn)錄組分析的方法 中說明的方法來進(jìn)行。
[0168] 此外，通過轉(zhuǎn)錄組分析的方法中，基于不含內(nèi)含子的mRNA搜索翻譯區(qū)域或5'或3' 非翻譯區(qū)域的SNP，相對于此，在使用基因組DNA、線粒體DNA或葉綠體DNA的方式中，進(jìn)行 包含內(nèi)含子的DNA的全部區(qū)域的SNP搜索。由此，使用基因組DNA、線粒體DNA或葉綠體DNA 時(shí)，可省略如下工序（e)，相當(dāng)于在通過轉(zhuǎn)錄組分析的識別標(biāo)記的制備方法中，確認(rèn)通過用 于擴(kuò)增含有SNP的區(qū)域而設(shè)計(jì)的引物的該區(qū)域的擴(kuò)增的工序。
[0169] 使用上述轉(zhuǎn)錄組的方式及使用基因組DNA(核基因組）、線粒體DNA或葉綠體DNA 的方式中，首先，用以下2步方法制備識別標(biāo)記，即在開始使用2種以上不同的啤酒花品種 進(jìn)行SNP搜索而確定識別區(qū)域和引物后，使用全部識別對象品種，對比識別區(qū)域的堿基序 列，確定適合識別標(biāo)記的SNP，但也可從最初開始，使用全部識別對象品種進(jìn)行SNP搜索而 確定識別區(qū)域和引物后，對比該識別區(qū)域的堿基序列，確定適合識別標(biāo)記的SNP。即在上述 記載的2個(gè)方式中，從開始即使用全部識別對象品種時(shí)，不需要確定識別對象品種的識別 區(qū)域的喊基序列的工序（f)。
[0170] <啤酒花品種的識別方法>
[0171] 本發(fā)明還提供用于識別啤酒花品種的方法。具體而言，啤酒花品種的識別方法還 可包含以下工序：
[0172] ⑴擴(kuò)增來自被測物啤酒花的DNA中的包含品種識別區(qū)域的DNA片段的工序，該品 種識別區(qū)域包含由啤酒花品種間不同的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP)構(gòu)成的識別標(biāo)記；
[0173] (ii)鑒定上述工序（i)中擴(kuò)增的DNA片段中的單核苷酸多態(tài)性的基因型的工序；
[0174] (iii)將上述工序（ii)所鑒定的被測物啤酒花DNA中的品種識別區(qū)域中的單核苷 酸多態(tài)性的基因型與已知啤酒花品種DNA所對應(yīng)的區(qū)域中的單核苷酸多態(tài)性的基因型進(jìn) 行對比，分析該區(qū)域中的單核苷酸多態(tài)性的基因型在被測物啤酒花和已知啤酒花品種之間 為一致或不一致的工序；
[0175] (iv)根據(jù)上述工序（iii)的分析結(jié)果，特定被測物啤酒花品種的工序。
[0176] 被測物啤酒花只要是被分類為學(xué)名Humulus lupulus的植物，無特別限定。例如， 可列舉識別標(biāo)記的制備方法的項(xiàng)目中列舉的歐洲原產(chǎn)的啤酒花、美國原產(chǎn)的啤酒花，但不 限于這些。
[0177] 作為方式之一，被測物啤酒花為實(shí)施例1的表4中所示的14種啤酒花。
[0178] 對上述的工序（i)?（iv)，如下進(jìn)行說明。
[0179] (i)擴(kuò)增何含品種識別區(qū)域的DNA片段的工序
[0180] 包含品種識別區(qū)域的DNA片段：從需要識別品種的被測物啤酒花中提取基因組 DNA，以其為模板，使用可擴(kuò)增具有作為基準(zhǔn)的識別標(biāo)記的區(qū)域的品種識別引物擴(kuò)增包含品 種識別區(qū)域的DNA片段。基因組DNA的提取及DNA片段的擴(kuò)增例如可根據(jù)上述<識別標(biāo)記 的制備方法>中的"（f)確定識別區(qū)域的堿基序列的工序及（g)確定識別對象品種的識別 標(biāo)記的工序"的項(xiàng)目中（1)啤酒花的獲得?（3)DNA片段的擴(kuò)增中所記載的方法或按照該方 法來進(jìn)行。
[0181] 品種識別區(qū)域?yàn)榘ㄟ^上述識別標(biāo)記的制備方法制備的識別標(biāo)記的區(qū)域。構(gòu)成 識別標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性存在于多個(gè)區(qū)域中時(shí)，品種識別區(qū)域也可為該多個(gè)區(qū)域。此外， 存在多個(gè)構(gòu)成識別標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性時(shí)，品種識別區(qū)域可以為存在這些全部的1個(gè)區(qū) 域，還可以為具有多個(gè)存在至少1個(gè)單核苷酸多態(tài)性的區(qū)域。作為具體的品種識別區(qū)域，可 列舉包含
[0182] 序列號 9(A1 區(qū)域）的堿基序列的第 74、77、87、103、116、118、121、125、134、135、 148、192、195、197、199、203、204、226、230、235、306、316、330、532 位；
[0183] 序列號 10(B1 區(qū)域）的堿基序列的第 178、204、227、234、370、426、439、547、562、 624 位；
[0184] 序列號 11 (Cl 區(qū)域）的堿基序列的第 3、13、17、87、88、129、130、131、132、133、134、 254、331、356、375、380、396、398、399、421、460、474、475、476、477、480、481、500、547 位（第 129?134位為插入缺失（indel)部分）；序列號12 (Al - 2 - L區(qū)域）的堿基序列的第34、 101、118、124、164、168、171、186、187、188、189、190、191、192、193、194、392、398、399、459、 502位（第186?194及第399位為插入缺失（indel)部分）；
[0185] 序列號 13 (Al - 2 -L 區(qū)域）的堿基序列的第 2、12、31、98、115、121、161、165、168、 183、184、185、186、187、188、189、190、191、389、395、396、456、499位（第12、183?191及第 396位為插入缺失（indel)部分）；
[0186] 序列號 14(A1 - 2 - R區(qū)域）的堿基序列的第 1、2、3、5、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、20、21、25、26、27、28、29、30、31、33、35、36、37、38、41、42、43、44、46、47、48、50、51、 56、57、58、59、63、65、68、72、78、79、84、86、88、90、92、118、153、154、191、205、206、226、228、 2 33、254、289、315、 35〇、392、4〇5 位（第 57 ?59 及第 65 位為插入缺失（indel)部分）；
[0187] 序列號 15(A1 - 2 - R 區(qū)域）的堿基序列的第 2、6、12、13、18、20、22、24、26、36、 52、87、88、125、139、140、160、162、167、188、223、249、273、284、326、339、421、437位（第437 位的插入缺失（indel)部分）；
[0188] 中記號η所示的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失（indel)部分的至少一個(gè)的區(qū)域。
[0189] 在方式之一中，品種識別區(qū)域可為包含序列號9 (Al區(qū)域）的堿基序列的一部分或 全部且還包含記號η所示的單核苷酸多態(tài)性的至少一個(gè)的區(qū)域，品種識別區(qū)域也可為包含 序列號9的堿基序列的區(qū)域?；蚱贩N識別區(qū)域可為包含序列號10 (BI區(qū)域）的堿基序列的 一部分或全部且還包含記號η所示的單核苷酸多態(tài)性的至少一個(gè)的區(qū)域，品種識別區(qū)域也 可為包含序列號10的堿基序列的區(qū)域?；蚱贩N識別區(qū)域可為包含序列號11 (Cl區(qū)域）的 堿基序列的一部分或全部且還包含記號η所示的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失（indel)部分 的至少一個(gè)的區(qū)域，品種識別區(qū)域也可為包含序列號11的堿基序列的區(qū)域。進(jìn)而，品種識 別區(qū)域可為包含序列號12或13 (Al - 2 - L區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且還包含 記號η所示的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失（indel)部分的至少一個(gè)的區(qū)域，品種識別區(qū)域 也可為包含序列號12或13的堿基序列的區(qū)域。此外，品種識別區(qū)域可為包含序列號14或 15 (Al - 2 - R區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且還包含記號η所示的單核苷酸多態(tài)性 或插入缺失（indel)部分的至少一個(gè)的區(qū)域，品種識別區(qū)域也可為包含序列號14或15的 喊基序列的區(qū)域。
[0190] 在其他方式中，品種識別區(qū)域可為選自以下區(qū)域的2個(gè)以上的區(qū)域，為包含序列 號9(A1區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且還包含η所示的單核苷酸多態(tài)性的至少一個(gè) 的區(qū)域；為包含序列號10 (BI區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且還包含η所示的單核苷 酸多態(tài)性的至少一個(gè)的區(qū)域；為包含序列號11 (Cl區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且還 包含η所示的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失（indel)部分的至少一個(gè)的區(qū)域；為包含序列號 12或13 (Al - 2 - L區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且還包含η所示的單核苷酸多態(tài)性 或插入缺失（indel)部分的至少一個(gè)的區(qū)域；及為包含序列號14或15 (Al - 2 - R區(qū)域） 的堿基序列的一部分或全部且還包含η所示的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失（indel)部分的 至少一個(gè)的區(qū)域。或品種識別區(qū)域可為選自以下區(qū)域的2個(gè)以上、3個(gè)以上、4個(gè)以上或5個(gè) 全部的區(qū)域，包含序列號9(A1區(qū)域）的堿基序列的區(qū)域、包含序列號10(B1區(qū)域）的堿基 序列的區(qū)域、包含序列號11 (Cl區(qū)域）的堿基序列的區(qū)域、包含序列號12或13 (Al - 2 - L區(qū)域）的堿基序列的區(qū)域及包含序列號14或15 (Al - 2 - R區(qū)域）的堿基序列的區(qū)域。
[0191] 而且在其他方式中，品種識別區(qū)域不僅為選自以下區(qū)域的1以上的區(qū)域，為包含 序列號9 (Al區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且還包含η所示的單核苷酸多態(tài)性的至少 一個(gè)的區(qū)域，為包含序列號10 (BI區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且還包含η所示的單 核苷酸多態(tài)性的至少一個(gè)的區(qū)域及為包含序列號11 (Cl區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部 且還包含η所示的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失（indel)部分的至少一個(gè)的區(qū)域，還可為以 下區(qū)域，為包含序列號12或13 (Al - 2 - L區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且還包含η 所示的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失（indel)部分的至少一個(gè)的區(qū)域或?yàn)榘蛄刑?4或 15 (Al - 2 - R區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且還包含η所示的單核苷酸多態(tài)性或插 入缺失（indel)部分的至少一個(gè)的區(qū)域?；蚱贩N識別區(qū)域不僅為選自以下的1個(gè)以上、優(yōu)選 為2個(gè)以上、進(jìn)一步優(yōu)選為3個(gè)全部的區(qū)域，包含序列號9 (Al區(qū)域）的堿基序列的區(qū)域，包 含序列號1〇(Β1區(qū)域）的堿基序列的區(qū)域及包含序列號11(C1區(qū)域）的堿基序列的區(qū)域， 還可為以下序列，為包含序列號12或13 (Al - 2 - L區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且 還包含η所示的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失（indel)部分的至少一個(gè)的區(qū)域或?yàn)榘蛄?號14或15(A1 - 2 - R區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且還包含η所示的單核苷酸多 態(tài)性或插入缺失（indel)部分的至少一個(gè)的區(qū)域?；蚱贩N識別區(qū)域不僅為選自以下的1個(gè) 以上、優(yōu)選為2個(gè)以上、進(jìn)一步優(yōu)選為3個(gè)全部的區(qū)域，包含序列號9 (Al區(qū)域）的堿基序列 的區(qū)域、包含序列號10 (BI區(qū)域）的堿基序列的區(qū)域及包含序列號11 (Cl區(qū)域）的堿基序 列的區(qū)域，還可為以下區(qū)域，包含序列號12或13(A1 - 2 - L區(qū)域）的堿基序列的區(qū)域或 包含序列號14或15 (Al - 2 - R區(qū)域）的堿基序列的區(qū)域。
[0192] 品種識別引物可為制備識別標(biāo)記時(shí)確定的可擴(kuò)增識別區(qū)域的引物，還可為為了可 擴(kuò)增含有識別標(biāo)記的區(qū)域（品種識別區(qū)域）而另行設(shè)計(jì)的引物。構(gòu)成識別標(biāo)記的單核苷酸 多態(tài)性存在于多個(gè)區(qū)域中時(shí)，品種識別引物也可為可擴(kuò)增各個(gè)區(qū)域的引物。此外，存在多個(gè) 構(gòu)成識別標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性時(shí)，品種識別引物可為可擴(kuò)增存在這些全部的1個(gè)區(qū)域的 引物，還可為可分別擴(kuò)增存在至少1個(gè)單核苷酸多態(tài)性的多個(gè)區(qū)域的多個(gè)引物。
[0193] 作為品種識別引物而可利用的引物中，包含由序列號1?8中記載的堿基序列組 成的引物。工序（i)中用于DNA片段擴(kuò)增的引物對的例子，可列舉選自以下的1個(gè)以上的 組合的引物對，由序列號1及2的堿基序列組成的引物的組合、由序列號3及4的堿基序列 組成的引物的組合、由序列號5及6的堿基序列組成的引物的組合以及由序列號7及8的 堿基序列組成的引物的組合。
[0194] 在其他方式中，工序（i)通過使用選自以下組合的1個(gè)以上、優(yōu)選為2個(gè)以上、進(jìn) 一步優(yōu)選為3個(gè)全部的引物對的PCR反應(yīng)來進(jìn)行，由序列號1及2的堿基序列組成的引物 的組合、由序列號3及4的堿基序列組成的引物的組合以及由序列號5及6的堿基序列組 成的引物的組合。
[0195] 在另一方式中，工序（i)不僅通過使用以下3個(gè)組合的引物對的PCR反應(yīng)來進(jìn)行， 由序列號1及2的堿基序列組成的引物的組合、由序列號3及4的堿基序列組成的引物的 組合以及由序列號5及6的堿基序列組成的引物的組合，還通過使用由序列號7及8的堿 基序列組成的引物的組合引物對的PCR反應(yīng)來進(jìn)行。
[0196] (ii)鑒定單核苷酸多杰件的某閔型的工序
[0197] 鑒定工序（i)中擴(kuò)增的DNA片段中的單核苷酸多態(tài)性的基因型。
[0198] 在方式之一中，單核苷酸多態(tài)性的基因型的鑒定可通過鑒定包含品種識別區(qū)域的 DNA片段的堿基序列來進(jìn)行。堿基序列的分析例如可根據(jù)上述<識別標(biāo)記的制備方法>中 的"（f)確定識別區(qū)域的堿基序列的工序及（g)確定識別對象品種的識別標(biāo)記的工序"的項(xiàng) 目中的（5)PCR產(chǎn)物的純化?（8)堿基序列的分析中記載的方法或也可按照該方法來進(jìn)行。
[0199] 在其他方式中，單核苷酸多態(tài)性的基因型的鑒定可通過使所擴(kuò)增的DNA片段與構(gòu) 成識別標(biāo)記的檢測啤酒花品種間不同的單核苷酸多態(tài)性的探針及/或引物接觸來進(jìn)行。檢 測單核苷酸多態(tài)性的探針及/或引物可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來設(shè)計(jì)及制備。使 用如此得到的探針的單核苷酸多態(tài)性的基因型的鑒定例如可利用DNA微陣列法等的本領(lǐng) 域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行。此外，使用引物的單核苷酸多態(tài)性的基因型的鑒定除了根據(jù) 序列分析以外，還可根據(jù)SNaPshot (注冊商標(biāo)）法（Life Technologies公司）等，利用使 用如下設(shè)計(jì)的引物的鑒定方法，根據(jù)應(yīng)檢測的單核苷酸多態(tài)性，產(chǎn)生長度不同的擴(kuò)增產(chǎn)物。 而且，使用探針及引物的單核苷酸多態(tài)性的基因型的鑒定可利用并用MGB(Minor Groove Binder)探針（Life Technologies公司）和設(shè)計(jì)為夾著該探針的引物的實(shí)時(shí)PCR法等。
[0200] (iii)對比、分析品種識別區(qū)域中的單核苷酸多杰件的某閔型的工序
[0201] 工序（iii)中，將被測物啤酒花DNA中的品種識別區(qū)域中的構(gòu)成識別標(biāo)記的單核 苷酸多態(tài)性的基因型與已知啤酒花品種DNA所對應(yīng)的區(qū)域中的單核苷酸多態(tài)性的基因型 進(jìn)行對比。且在該對比中，分析構(gòu)成識別標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性的基因型在被測物啤酒花 和已知啤酒花品種之間為一致或不一致。
[0202] 對比可通過視覺檢查、數(shù)學(xué)計(jì)算來進(jìn)行。或也可使用計(jì)算機(jī)程序。此外，對比也可 通過將包含品種識別區(qū)域的DNA片段的堿基序列與已知啤酒花品種DNA所對應(yīng)的區(qū)域的堿 基序列進(jìn)行對比來進(jìn)行。對比可通過通常在被測物的基因上具有的單核苷酸多態(tài)性的檢驗(yàn) (SNP分型）中所采用方法來進(jìn)行。
[0203] 以下，將直接對比堿基序列時(shí)的具體的對比方法使用分析用計(jì)算機(jī)程序的情況進(jìn) 行例示。即準(zhǔn)備包含表示通過上述識別標(biāo)記的制備方法得到的識別標(biāo)記的堿基的數(shù)據(jù)和表 示所述堿基的堿基序列位置的數(shù)據(jù)的識別標(biāo)記表，存儲到SeqScape (Life Technologies) 等的分析用計(jì)算機(jī)程序運(yùn)行的計(jì)算機(jī)中。所存儲的識別標(biāo)記表可為1個(gè)或多個(gè)。且將包含 表示從作為被測物的啤酒花中得到的堿基的數(shù)據(jù)的被測物堿基序列的序列表存儲到所述 計(jì)算機(jī)中。
[0204] 且參照所述識別標(biāo)記表的表示所述堿基序列位置的數(shù)據(jù)，將表示被測物堿基序列 的序列表與所述識別標(biāo)記表之間對應(yīng)的堿基序列位置上的堿基的數(shù)據(jù)用所述計(jì)算機(jī)進(jìn)行 對比。對比通過將運(yùn)用所述分析用計(jì)算機(jī)程序的兩組堿基序列進(jìn)行比對來進(jìn)行。
[0205] (iv)特定被測物啤酒花品種的工序
[0206] 工序（iv)中，根據(jù)工序（iii)的分析結(jié)果，特定被測物啤酒花品種。
[0207] 具體而言，分析相當(dāng)于被測物堿基序列中的識別標(biāo)記的位點(diǎn)的堿基與所述識別標(biāo) 記的堿基是否完全一致，完全一致時(shí)，被測物特定為所述識別標(biāo)記的品種。
[0208] 如此，使用本發(fā)明的識別標(biāo)記時(shí)，可特定作為被測物的啤酒花品種。使用計(jì)算機(jī)進(jìn) 行分析時(shí)，預(yù)先記錄具有與多個(gè)品種相關(guān)的識別標(biāo)記的區(qū)域的堿基序列，通過將被測物的 堿基序列依次與各品種的堿基序列進(jìn)行對比？分析，可簡便且迅速特定作為被測物的啤酒 花品種。
[0209] 另外，通過將作為識別標(biāo)記而確定的特定的堿基著色，也可容易地進(jìn)行上述對比。 即首先，將具有著色的對照堿基（識別標(biāo)記）的堿基序列與被測物的堿基序列進(jìn)行比對后， 僅將著色的堿基抽出，制成將兩者進(jìn)行對比的表。由此可容易地識別堿基的種類和存在的 位置是否完全一致，可容易的辨別作為被測物的啤酒花是否為其識別標(biāo)記的品種。另外，因 該方法可同時(shí)分析多個(gè)被測物，所以優(yōu)選。
[0210] <何含識別標(biāo)記的核酸>
[0211] 本發(fā)明還提供如下核酸，其包含通過制備上述識別標(biāo)記的方法制備的識別標(biāo)記的 至少一部分。
[0212] 在此，"核酸"是指由2種以上的核苷酸構(gòu)成的脫氧核糖核酸（DNA)或核糖核酸 (RNA)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，對于DNA的堿基序列中記載的核酸意指RNA時(shí)，可將 DNA的堿基序列的胸腺嘧啶取代為尿嘧啶。此外，核酸可為單鏈，也可為與互補(bǔ)鏈雜交的雙 鏈。
[0213] 具體而言，包含識別標(biāo)記的至少一部分的核酸也可為如下核酸，包含選自以下的 堿基序列的一部分，序列號9 (Al區(qū)域）、序列號10 (BI區(qū)域）、序列號11 (Cl區(qū)域）、序列號 12或13 (Al - 2 - L區(qū)域）、序列號14或15 (Al - 2 - R區(qū)域），且在該喊基序列中包含記 號η所示的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失（indel)部分的至少一個(gè)。優(yōu)選為包含識別標(biāo)記的 至少一部分的核酸也可為包含選自以下堿基序列的核酸，序列號9 (Al區(qū)域）、序列號10 (BI 區(qū)域）、序列號11 (Cl區(qū)域）、序列號12或13 (Al - 2 - L區(qū)域）及序列號14或15 (Al - 2 一 R區(qū)域）。
[0214] < 引物 >
[0215] 本發(fā)明也提供如下引物，其可擴(kuò)增包含上述識別標(biāo)記的至少一部分的核酸。
[0216] 引物只要是設(shè)計(jì)為可擴(kuò)增包含上述識別標(biāo)記的至少一部分的核酸的引物，無特別 限定。
[0217] < 探針 >
[0218] 本發(fā)明還提供如下探針，其用于檢測構(gòu)成識別標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性。
[0219] 探針為可檢測例如選自序列號9 (Al區(qū)域）、序列號10 (BI區(qū)域）、序列號11 (Cl區(qū) 域）、序列號12或13 (Al - 2 - L區(qū)域）及序列號14或15 (Al - 2 - R區(qū)域）的堿基序列 中η所示的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失（indel)部分的至少一個(gè)。
[0220] <檢測不同品種混入的方法>
[0221] 在擔(dān)心不同品種混入時(shí)，利用本發(fā)明的識別標(biāo)記，例如可用以下所述的方法檢測 不同品種混入。
[0222] 其為檢測啤酒花試樣中的不同品種混入的方法，所述方法包含以下工序：
[0223] ⑴擴(kuò)增從被測物啤酒花試樣中提取的DNA中的包含品種識別區(qū)域的DNA片段的 工序，該品種識別區(qū)域包含由啤酒花品種間不同的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP)構(gòu)成的 識別標(biāo)記；
[0224] (ii)分析上述工序⑴中擴(kuò)增的DNA片段中的品種識別區(qū)域的堿基序列，得到測 序數(shù)據(jù)的工序；
[0225] (iii)將上述工序（ii)中得到的測序數(shù)據(jù)中的構(gòu)成識別標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性 位點(diǎn)的信息與正常品所對應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息進(jìn)行對比的工序；及
[0226] (iv)確定啤酒花試樣中有無不同品種混入的工序，在此，上述工序（ii)中得到的 測序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息與正常品所對應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息一 致時(shí)，判斷為無不同品種混入，或上述工序（ii)中得到的測序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn) 的信息與正常品所對應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息不一致時(shí)，判斷為有不同品種混入。
[0227] 而且，通過在（iv)之后繼續(xù)進(jìn)行以下的工序，可進(jìn)行混入品種的推斷或特定。即 包含
[0228] (V)上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的測序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的 信息與正常品所對應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息不一致時(shí)，由上述工序（ii)中得到的 測序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)中出現(xiàn)的來自正常品以外的信息特定其堿基的工序；及
[0229] (Vi)將上述工序（V)中特定的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的與正常品不同的堿基與識 別標(biāo)記對照，從而推斷或特定混入品種的工序。
[0230] 此外，通過進(jìn)一步在（iv)之后繼續(xù)進(jìn)行以下的工序，可分析混入比例。即包含
[0231] (V)上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的測序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的 信息與正常品所對應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息不一致時(shí)，由上述工序（ii)中得到的 測序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)中出現(xiàn)的來自正常品以外的信息特定其堿基，并求出混入 比例的工序；及
[0232] (Vi)將上述工序（V)中特定的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的與正常品不同的堿基與識 別標(biāo)記對照，從而推斷或特定混入品種和其混入比例的工序。
[0233] 在此，測序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息是指例如由測序的結(jié)果得到的單核 苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的形狀、數(shù)值，具體而言，可列舉由測序的結(jié)果得到的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn) 的電泳圖（測序的時(shí)得到的表示各堿基的顏色分開的波形），將擴(kuò)增片段克隆到大腸桿菌 等中，對所得到的多個(gè)克隆進(jìn)行測序，通過對這些序列進(jìn)行對比而得到的單核苷酸多態(tài)性 位點(diǎn)上的堿基的含有比率等。
[0234] 此外，此處的正常品是指為單一品種，指已確立構(gòu)成識別標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性 位點(diǎn)的信息的啤酒花品種。根據(jù)情況，所謂正常品的記載也有時(shí)指包含已確立構(gòu)成識別標(biāo) 記的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息的僅單一品種的試樣。
[0235] 使用電泳圖檢測不同品種混入時(shí)，由于在作為被測物的啤酒花試樣的電泳圖中重 疊出現(xiàn)與正常品的波形不同的其他波形，所以，可確認(rèn)不同品種的存在。且通過由單核苷酸 多態(tài)性位點(diǎn)上出現(xiàn)的與正常品不同的波形特定其堿基，與識別標(biāo)記對照，從而可推斷或特 定混入品種。只要各識別標(biāo)記（SNP)中的其品種上特征性的堿基完全被確認(rèn)，即可特定混 入品種。而且，通過將這些波形的重疊狀況、高度等與另外實(shí)施的預(yù)先已知混入比例的其他 品種混合品的分析結(jié)果進(jìn)行對比，可求出不同品種大約的混入比例。
[0236] 此外，在使用將擴(kuò)增片段克隆到大腸桿菌等中而得到的多個(gè)克隆的測序數(shù)據(jù)時(shí)， 通過將其多個(gè)克隆的序列進(jìn)行比對，求出各單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的堿基的含有比率，可檢 測不同品種的混入。即如未混入不同品種，則所有位點(diǎn)均與正常品的堿基為同樣堿基的含 有比率應(yīng)為100*%，在不同品種混入時(shí)，與正常品的喊基同樣的喊基不為100*%，可看出其 他的堿基的含有比率。如此，通過將與正常品的堿基不同的堿基與識別標(biāo)記對照，可特定混 入品種，求出含有比率。但是，在大腸桿菌上克隆的方法因需要分析大量的克隆，所以，會產(chǎn) 生需要大量勞力和時(shí)間的操作。
[0237] 作為求出各單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的堿基的含有比率的其他方法，通過將包含作為 被測物的啤酒花試樣的品種識別區(qū)域的DNA片段使用具有下一步驟中必需的附加序列的 特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，并將其用新一代測序儀大量測序，將這些進(jìn)行比對，求出各單核苷酸 多態(tài)性位點(diǎn)的堿基的含有比率，從而可更準(zhǔn)確地進(jìn)行混入品種的特定和求出混入比率。
[0238] 此外，還具有將引物在馬上進(jìn)行多態(tài)性（SNP)分析之前進(jìn)行設(shè)定，對僅使一堿基 伸長而摻入的堿基的種類進(jìn)行多態(tài)性分型的方法。例如，稱為SNaPshot (注冊商標(biāo)）法 (Life Technologies公司）的方法。此外，還有可使用MGB(Minor Groove Binder)探針 (Life Technologies公司），用實(shí)時(shí)PCR法對不同品種進(jìn)行定量分析的方法。
[0239] 實(shí)施例
[0240] 以下，通過實(shí)施例進(jìn)一步具體說明本發(fā)明。但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
[0241] 實(shí)施例1識別標(biāo)記的制各
[0242] (a)轉(zhuǎn)錄纟目分析
[0243] 為了得到啤酒花品種識別技術(shù)開發(fā)中必需的品種間DNA多態(tài)性區(qū)域，認(rèn)為需要使 用新一代測序儀得到大量的測序數(shù)據(jù)，從其中廣泛搜索SNP (檢測人基因組時(shí)的SNP的頻率 認(rèn)為是 1 個(gè)/100 - 300 喊基；http://www.eubios.info/hmba ck.htm)。因此，本
【發(fā)明者】著 眼于轉(zhuǎn)錄組。轉(zhuǎn)錄組分析與以全部基因組為對象時(shí)相比，以大約1/100左右的數(shù)據(jù)處理即 可實(shí)現(xiàn)，因而可控制交貨期、成本。而且雖然與全基因組相比可以說為少數(shù)，然而在我們的 計(jì)算中，可利用1萬5千個(gè)SNP數(shù)據(jù)。因此，設(shè)想得到了多品種識別所必需的SNP，利用本方 法，實(shí)施品種間的SNP分析。
[0244] (1)試樣的采集?保管
[0245] 從下一項(xiàng)表4中記載的識別對象品種中選擇3品種（從方便上，記為品種A、B、C)， 采集該品種的啤酒花鮮葉。即用以下所示的方法進(jìn)行采樣·保管。
[0246] a.組織一盡可能采集嫩葉（小、黃綠色、柔軟）。但表面上附著白色異物的葉除外。
[0247] b.方法一為了防止RNAse的附著，用帶上手術(shù)用手套的手采集葉。采集的同時(shí)，在 防止RNA分解用的試劑中浸漬。
[0248] C.保管一常溫下，至少1星期左右RNA為穩(wěn)定，但到進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析及SNP序列分 析的期間，盡可能放入冰箱內(nèi)保管。
[0249] (2)轉(zhuǎn)錄鉬分析
[0250] 對于如上所述采集的試樣，委托Eurofins公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。具體而言， 進(jìn)行了總RNA的提取、mRNA的純化、cDNA文庫的構(gòu)建、表達(dá)量的差的均一化、大小調(diào)整 (500?700bp)、GS FLX測序儀用的cDNA文庫的制備、通過使用"Titanium Chemistry"的 Roche/454Genome Sequencer FLX 進(jìn)行測序。
[0251] (b)纟目裝（重疊群的制各）
[0252] 使用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的SNP分析
[0253] 使用通過上述轉(zhuǎn)錄組分析而得到的測序數(shù)據(jù)，委托Eurofins公司進(jìn)行重疊群的制 備。具體而言，基于各啤酒花品種的DNA片段的堿基序列，進(jìn)行聚類和組裝。其結(jié)果，從各 品種中得到合計(jì)為約42000?45000種的重疊群（cDNA的一部分）的堿基序列。其中，具 有IOOObp以上的長度的重疊群為約4500?6700個(gè)。
[0254]【表1】
[0255]

【權(quán)利要求】
1. 一種方法，其為啤酒花品種的識別方法，其特征在于，所述方法包含以下工序： (i) 擴(kuò)增來自被測物啤酒花的DNA中的包含品種識別區(qū)域的DNA片段的工序，該品種識 別區(qū)域包含由啤酒花品種間不同的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性即SNP構(gòu)成的識別標(biāo)記； (ii) 鑒定上述工序（i)中擴(kuò)增的DNA片段中的單核苷酸多態(tài)性的基因型的工序； (iii) 將上述工序（ii)所鑒定的被測物啤酒花DNA中的品種識別區(qū)域中的單核苷酸多 態(tài)性的基因型與已知啤酒花品種DNA所對應(yīng)的區(qū)域中的單核苷酸多態(tài)性的基因型進(jìn)行對 t匕，分析該區(qū)域中的單核苷酸多態(tài)性的基因型在被測物啤酒花和已知啤酒花品種之間為一 致或不一致的工序； (iv) 根據(jù)上述工序（iii)的分析結(jié)果，特定被測物啤酒花品種的工序。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于，工序（ii)如下進(jìn)行，鑒定工序（i)中擴(kuò) 增的DNA片段中的品種識別區(qū)域的堿基序列，且 工序（iii)如下進(jìn)行，將工序（ii)所鑒定的被測物啤酒花DNA中的品種識別區(qū)域的堿 基序列與已知啤酒花品種DNA所對應(yīng)的區(qū)域的堿基序列進(jìn)行對比，分析該區(qū)域中的識別標(biāo) 記在被測物啤酒花和已知啤酒花品種之間為一致或不一致。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于，工序（ii)為如下工序，通過使工序（i) 中擴(kuò)增的DNA片段與檢測啤酒花品種間不同的單核苷酸多態(tài)性的探針及/或引物接觸，而 鑒定單核苷酸多態(tài)性的基因型。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，品種識別區(qū)域?yàn)榘ㄟ^包 含以下工序的方法而制備的識別標(biāo)記的區(qū)域： (a) 使用2個(gè)以上不同品種的啤酒花，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的工序； (b) 基于由上述工序（a)的結(jié)果得到的DNA片段的堿基序列，對各品種進(jìn)行組裝的工 序； (c) 將由上述工序（b)的結(jié)果得到的重疊群及/或單拷貝進(jìn)行品種間對比，進(jìn)行品種間 不同的單核苷酸多態(tài)性即SNP的搜索的工序； (d) 根據(jù)上述工序（c)的SNP搜索的結(jié)果，選擇包含SNP的區(qū)域，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增該區(qū)域 的引物的工序； (e) 通過使用上述工序（d)中設(shè)計(jì)的引物，以從啤酒花中提取的DNA為模板，確認(rèn)上述 工序（d)中選擇的區(qū)域可擴(kuò)增，確定該堿基序列，從而確定識別區(qū)域和可擴(kuò)增該識別區(qū)域 的引物的工序； (f) 使用上述工序（e)中確定的引物，以從識別對象品種的啤酒花中提取的DNA為模板 擴(kuò)增識別區(qū)域，確定識別區(qū)域的堿基序列的工序；及 (g) 將上述工序（f)中確定的識別區(qū)域的堿基序列進(jìn)行品種間對比，確定由用于識別 識別對象品種所必需的SNP的組合構(gòu)成的識別標(biāo)記的工序。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，品種識別區(qū)域?yàn)榘x自序 列號9、序列號10、序列號11、序列號12、序列號13、序列號14及序列號15中的1個(gè)以上的 堿基序列的一部分或全部，且還包含圖1、圖2、圖3、圖4及圖6中特定的單核苷酸多態(tài)性或 插入缺失部分的至少一個(gè)的區(qū)域。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，品種識別區(qū)域?yàn)檫x自包含序 列號9表不的喊基序列的區(qū)域、包含序列號10表不的喊基序列的區(qū)域、包含序列號11表不 的喊基序列的區(qū)域、包含序列號12表不的喊基序列的區(qū)域、包含序列號13表不的喊基序列 的區(qū)域、包含序列號14表不的喊基序列的區(qū)域及包含序列號15表不的喊基序列的區(qū)域中 的1個(gè)以上的區(qū)域。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，品種識別區(qū)域?yàn)椴粌H包含以 下：包含序列號9表不的喊基序列的區(qū)域、包含序列號10表不的喊基序列的區(qū)域及包含序 列號11表示的堿基序列的區(qū)域的3種區(qū)域，且包含以下：序列號12及/或序列號14表示 的堿基序列的一部分或全部，且還包含圖4中特定的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失部分的至 少1個(gè)的區(qū)域。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，工序（i)通過使用以下引物 對的PCR反應(yīng)來進(jìn)行，為選自序列號1及序列號2的組合、序列號3及序列號4的組合、序 列號5及序列號6的組合及序列號7及序列號8的組合的引物對。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，工序（i)通過使用以下引物 對的PCR反應(yīng)來進(jìn)行：不僅為以下：序列號1及序列號2的組合、序列號3及序列號4的組 合以及序列號5及序列號6的組合的3種引物對，還為序列號7及序列號8的組合的引物 對。
10. -種方法，其為由啤酒花品種間不同的單核苷酸多態(tài)性的組合構(gòu)成的識別標(biāo)記的 制備方法，其特征在于，所述方法包含以下工序： (a) 使用2個(gè)以上不同品種的啤酒花，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的工序； (b) 基于由上述工序（a)的結(jié)果得到的DNA片段的堿基序列，對各品種進(jìn)行組裝的工 序； (c) 將由上述工序（b)的結(jié)果得到的重疊群及/或單拷貝進(jìn)行品種間對比，進(jìn)行品種間 不同的單核苷酸多態(tài)性即SNP的搜索的工序； (d) 根據(jù)上述工序（c)的SNP搜索的結(jié)果，選擇包含SNP的區(qū)域，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增該區(qū)域 的引物的工序； (e) 通過使用上述工序（d)中設(shè)計(jì)的引物，以從啤酒花中提取的DNA為模板，確認(rèn)上述 工序（d)中選擇的區(qū)域可擴(kuò)增，確定該堿基序列，從而確定識別區(qū)域和可擴(kuò)增該識別區(qū)域 的引物的工序； (f) 使用上述工序（e)中確定的引物，以從識別對象品種的啤酒花中提取的DNA為模板 擴(kuò)增識別區(qū)域，確定識別區(qū)域的堿基序列的工序；及 (g) 將上述工序（f)中確定的識別區(qū)域的堿基序列進(jìn)行品種間對比，確定由用于識別 識別對象品種所必需的SNP的組合構(gòu)成的識別標(biāo)記的工序。
11. 一種核酸，其特征在于，包含通過權(quán)利要求10中所述的方法制備的識別標(biāo)記的至 少一部分。
12. -種核酸，其特征在于，該核酸包含啤酒花的品種識別區(qū)域，而且，包含選自序列號 9、序列號10、序列號11、序列號12、序列號13、序列號14及序列號15中的1個(gè)以上的堿基 序列的一部分或全部，且還包含圖1、圖2、圖3、圖4及圖6中特定的單核苷酸多態(tài)性或插入 缺失部分的至少一個(gè)。
13. -種引物，其特征在于，設(shè)計(jì)為可擴(kuò)增權(quán)利要求11或12中所述的核酸。
14. 一種引物，其特征在于，由序列號1?8中任一個(gè)所記載的堿基序列組成，在此，該 引物用于啤酒花的品種識別。
15. -種探針，其特征在于，用于檢測通過權(quán)利要求10中所述的方法鑒定的品種識別 區(qū)域中的啤酒花品種間不同的單核苷酸多態(tài)性。
16. -種探針，其特征在于，可在選自序列號9、序列號10、序列號11、序列號12、序列號 13、序列號14及序列號15中的1個(gè)以上的堿基序列中，檢測圖1、圖2、圖3、圖4或圖6中 特定的位置中的至少1個(gè)單核苷酸多態(tài)性或插入缺失位點(diǎn)，且由此檢測啤酒花品種間不同 的單核苷酸多態(tài)性。
17. -種方法，其為檢測啤酒花試樣中的不同品種混入的方法，所述方法包含以下工 序： (i) 擴(kuò)增從被測物啤酒花試樣中提取的DNA中的包含品種識別區(qū)域的DNA片段的工序， 該品種識別區(qū)域包含由啤酒花品種間不同的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性即SNP構(gòu)成的識別 標(biāo)記； (ii) 分析上述工序⑴中擴(kuò)增的DNA片段中的品種識別區(qū)域的堿基序列，得到測序數(shù) 據(jù)的工序； (iii) 將上述工序（ii)中得到的測序數(shù)據(jù)中的構(gòu)成識別標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn) 的信息與正常品所對應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息進(jìn)行對比的工序；及 (iv) 確定啤酒花試樣中有無不同品種混入的工序，在此，上述工序（ii)中得到的測序 數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息與正常品所對應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息一致時(shí)， 判斷為無不同品種混入，或上述工序（ii)中得到的測序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信 息與正常品所對應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息不一致時(shí)，判斷為有不同品種混入。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17中所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包含接在工序（iv)后的以下 工序： (v) 上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的測序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息 與正常品所對應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息不一致時(shí)，由上述工序（ii)中得到的測序 數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)中出現(xiàn)的來自正常品以外的信息特定其堿基的工序；及 (vi) 將上述工序（v)中特定的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的與正常品不同的堿基與識別標(biāo) 記對照，從而推斷或特定混入品種的工序。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17中所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包含接在工序（iv)后的以下 工序： (v)上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的測序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息 與正常品所對應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息不一致時(shí)，由上述工序（ii)中得到的測序 數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)中出現(xiàn)的來自正常品以外的信息特定其堿基，并求出混入比例 的工序；及 (Vi)將上述工序（V)中特定的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的與正常品不同的堿基與識別標(biāo) 記對照，從而推斷或特定混入品種和其混入比例的工序。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1?9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，工序（iii)中包含有無 19?25堿基的插入序列的分析。
【文檔編號】C12Q1/68GK104350151SQ201380029975
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年6月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月7日
【發(fā)明者】山內(nèi)啟正, 古久保進(jìn) 申請人:三得利控股株式會社