使樹突細(xì)胞成熟的組合物以及用其制備抗原特異性樹突細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種使樹突細(xì)胞成熟的組合物，包括：作為成熟促進(jìn)因子的白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)、前列腺素E2(PGE2)、溶鏈菌制劑(OK432)和/或聚肌胞。本發(fā)明的使樹突細(xì)胞成熟的組合物可具有不僅改進(jìn)樹突細(xì)胞誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，而且可以降低樹突細(xì)胞的抗原非特異性的免疫應(yīng)答，并且提高樹突細(xì)胞的抗原特異性的免疫應(yīng)答，從而使免疫療法的效果最大化。
【專利說明】使樹突細(xì)胞成熟的組合物W及用其制備抗原特異性樹突細(xì) 胞的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種使樹突細(xì)胞成熟的組合物，W及一種使用該組合物制備抗原特異 性的樹突細(xì)胞的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 樹突細(xì)胞值C)是抗原提呈細(xì)胞（APC)，具有在免疫系統(tǒng)的細(xì)胞中提呈抗原的最大 潛力。樹突細(xì)胞刺激還沒有暴露至抗原的T細(xì)胞（被稱為幼稚T細(xì)胞），從而誘導(dǎo)免疫反 應(yīng)。因此，樹突細(xì)胞是獨(dú)特的免疫細(xì)胞，它與其它的APC不同，能夠有效誘導(dǎo)初次免疫應(yīng)答 并且活化記憶T細(xì)胞。已知，樹突細(xì)胞在它的表面表達(dá)高濃度的共刺激分子，W及血IC分子 (1/11)，而且樹突細(xì)胞釋放T細(xì)胞活化所需的細(xì)胞因子（IFN-a、IL-12、IL-18)。該是為什 么樹突細(xì)胞能夠誘導(dǎo)潛在的免疫應(yīng)答的原因。通過釋放與Thl免疫相關(guān)的細(xì)胞因子（諸如 IFN-a、IL-12等），I型樹突細(xì)胞能夠誘導(dǎo)抗原特異性的Thl細(xì)胞的增殖W及細(xì)胞毒性T 淋己細(xì)胞（CTL)的活化，因此I型樹突細(xì)胞在免疫療法中具有有益的應(yīng)用。
[0003] 為了在癌癥的免疫療法中利用樹突細(xì)胞，必需使用體外使單核細(xì)胞分化成樹突細(xì) 胞，并使未成熟的樹突細(xì)胞成熟為在誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫時(shí)有用的成熟樹突細(xì)胞的技術(shù)。在本 領(lǐng)域中，從體內(nèi)的單核細(xì)胞制備未成熟的樹突細(xì)胞的技術(shù)W及成熟的工序還沒有標(biāo)準(zhǔn)化。 具體地，通過如下工序?qū)崿F(xiàn)從單核細(xì)胞分化得到的未成熟樹突細(xì)胞的成熟；使未成熟樹突 細(xì)胞能夠遷移到淋己結(jié)中，未成熟樹突細(xì)胞在淋己結(jié)中將抗原片段提呈給幼稚T細(xì)胞，W 誘導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答。與未成熟的樹突細(xì)胞相比，完全成熟的樹突細(xì)胞在它的表面上表達(dá)MHC I和II分子W及高濃度的T細(xì)胞共刺激分子（即CD80和CD86)。此外，成熟的樹突細(xì)胞分 泌很多細(xì)胞因子，該些細(xì)胞因子直接參與誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。在經(jīng)歷了成熟引起的此種 改變之后，樹突細(xì)胞大大增加了誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的潛能。
[0004] 已知，MCM(單核細(xì)胞條件培養(yǎng)基）可用于樹突細(xì)胞的成熟。通過體外培養(yǎng)單核細(xì) 胞制備的MCM用作成熟因子的來源。但是，MCM途徑并不能確保從一個(gè)成熟工序至另一成熟 工序都有一致的條件，因?yàn)?，單核?xì)胞響應(yīng)于外部信號(hào)所釋放的促炎細(xì)胞因子的數(shù)量在不 同人之間有很大不同。此外，另一缺點(diǎn)是需要大量的外周血單核細(xì)胞來制備MCM。作為MCM 途徑的替代，開發(fā)了選自MCM組分中的重要的細(xì)胞因子（IL-1目、比-6、TNF-a、PGEs)組成 的細(xì)胞因子雞尾酒。細(xì)胞因子雞尾酒能夠穩(wěn)定生產(chǎn)具有相對(duì)較高功能的樹突細(xì)胞，且解決 了MCM的問題。但是，僅有細(xì)胞因子雞尾酒不能提供充分成熟的樹突細(xì)胞。
[0005] 韓國(guó)專利申請(qǐng)未經(jīng)審查的公開第10-2011-0035633號(hào)公開了，通過使用Thl細(xì)胞 核樹突細(xì)胞在體外生成細(xì)胞毒性T細(xì)胞。但是，因?yàn)樵摲N方法利用的是還沒有完全成熟的 樹突細(xì)胞，因此難W預(yù)期由此方法能夠得到足夠的免疫治療效果。
[0006] 因此，非常需要更有效的樹突細(xì)胞的成熟技術(shù)，通過該成熟技術(shù)能夠誘導(dǎo)針對(duì)癌 癥的潛在的抗原特異性免疫，從而產(chǎn)生對(duì)癌癥的最好的免疫治療效果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供使樹突細(xì)胞成熟的組合物，該組合物增強(qiáng)樹突細(xì) 胞誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，降低樹突細(xì)胞的抗原非特異性的免疫應(yīng)答，并且提高樹突細(xì)胞的 抗原特異性的免疫應(yīng)答，從而發(fā)揮最好的免疫治療效果。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供抗原特異性的樹突細(xì)胞，該抗原特異性的樹突細(xì)胞通過 使用所述使樹突細(xì)胞成熟的組合物來制備。
[0009] 本發(fā)明的又一目的是提供制備抗原特異性的樹突細(xì)胞的方法。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種使樹突細(xì)胞成熟的組合物，該組合物 包括；作為成熟因子的選自白細(xì)胞介素-1目（IL-1目）、白細(xì)胞介素-6 (比-6)、腫瘤壞死因 子-a(TNF-a)、干擾素Y(IFN-Y)、前列腺素E2(PGE2)、溶鏈菌制劑（Picibanil) (0K432) 和聚肌胞（PolyIC)中的至少一種。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了抗原特異性的樹突細(xì)胞，該抗原特異性的 樹突細(xì)胞通過使用上述組合物制備。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了制備抗原特異性的樹突細(xì)胞的方法，該方 法包括：使用抗原使未成熟的樹突細(xì)胞致敏；W及，使用選自W下成熟因子中的至少一種 成熟因子來處理經(jīng)過致敏的樹突細(xì)胞；白細(xì)胞介素-1目（IL-1目）、白細(xì)胞介素-6 (比-6)、 腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、干擾素Y(IFN-Y)、前列腺素E2 (PGE2)、溶鏈菌制劑（0K432) 和聚肌胞。
[0013] 除了提高樹突細(xì)胞誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力之外，本發(fā)明的成熟組合物的組成還能夠 提高抗原特異性的T細(xì)胞免疫應(yīng)答，同時(shí)降低非特異性的免疫應(yīng)答，從而帶來最好的免疫 治療效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是同時(shí)使用抗原（Ag)和所有的成熟因子（CM)處理炬），或在時(shí)間滯后處僅使 用成熟因子溶鏈菌制劑（0K432)處理（A)，來制備成熟的樹突細(xì)胞的示意圖。
[00巧]圖2是示出了在實(shí)施例1-1 (MAGE-1/0K+)和對(duì)比例1-1 (MAGE-1/0K-)中，在樹突 細(xì)胞的成熟過程中釋放到樹突細(xì)胞的培養(yǎng)液中的IL-12和IL-IO的水平的柱形圖。在柱形 圖中，cvDC和sDC分別表示在實(shí)施例1-1和對(duì)比例1-1中制備的樹突細(xì)胞。
[001引圖3是示出了當(dāng)從外周血細(xì)胞中分離的T細(xì)胞與實(shí)施例I-I(MAGE-I)或?qū)Ρ壤?1-1的樹突細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，通過MIT測(cè)定測(cè)量的T細(xì)胞的增殖的柱形圖。在該柱形圖中，cvDC和sDC分別表示在實(shí)施例1-1和對(duì)比例1-1中制備的樹突細(xì)胞。
[0017]圖4是示出了當(dāng)從外周血細(xì)胞中分離的T細(xì)胞與實(shí)施例I-I(MAGE-I)或?qū)Ρ壤?1-1的樹突細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，通過化ISA測(cè)量的在培養(yǎng)上清液中的IFN-Y的水平的柱形圖。 在該柱形圖中，cvDC和sDC分別表示在實(shí)施例1-1和對(duì)比例1-1中制備的樹突細(xì)胞。
[001引圖5是示出了在H輪測(cè)量中釋放到培養(yǎng)基中的IFN-Y的水平的曲線圖，其中在每 次測(cè)量的過程中，W細(xì)胞間預(yù)先設(shè)定的混合比率，使用實(shí)施例1-2(AFP/0K+)、對(duì)比例2扣n/ OK+)、對(duì)比例3-2(AFP/0K-)和對(duì)比例4化n/OK-)的樹突細(xì)胞刺激自身的T細(xì)胞。
[001引 圖6是顯示了通過IFN-YELISPOT分析測(cè)量的，由實(shí)施例1-3佑PC-3/0K+)和對(duì)比 例2化n/OK+)、對(duì)比例3-3佑PC-3/0K-)及對(duì)比例4化n/OK-)的樹突細(xì)胞誘導(dǎo)的CTL的抗原 特異性的柱形圖。
[0020] 圖7是示出了當(dāng)通過實(shí)施例1-2 (AFP/0K+)、對(duì)比例2 (Un/OK+)、對(duì)比例3-2 (AFP/ 0K-)和對(duì)比例4扣n/OK-)的樹突細(xì)胞活化的CTL與祀細(xì)胞反應(yīng)時(shí)，釋放到培養(yǎng)基中的 IFN-Y的水平的柱形圖。
[0021] 圖8是示出了實(shí)施例1-2 (AFP/0K+)和對(duì)比例3-2 (AFP/0K-)的樹突細(xì)胞在它們的 成熟過程中釋放到培養(yǎng)基中的IL-12和IL-IO的水平的柱形圖。
[0022] 圖9是示出了當(dāng)從外周血細(xì)胞中純化的T細(xì)胞與實(shí)施例1-3佑PC-3/0K+)和對(duì)比 例3-3佑PC-3/0K-)的樹突細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，通過MT測(cè)定測(cè)量的T細(xì)胞增殖的柱形圖。
[0023] 圖10是示出了當(dāng)從外周血細(xì)胞中純化的T細(xì)胞與實(shí)施例1-2 (AFP/0K+)或?qū)Ρ壤?3-2(AFP/0K-)的樹突細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，通過化ISA測(cè)量的在培養(yǎng)基中的IFN-Y的水平的柱形 圖。
[0024] 圖11是示出了在實(shí)施例1-3佑PC-3/0K+)和對(duì)比例3-3佑PC-3/0K-)的樹突細(xì)胞 所引起的CTL擴(kuò)增的每一階段中的細(xì)胞增殖的曲線圖。
[00巧]圖12是示出了在使用實(shí)施例1-3佑PC-3/0K+)和對(duì)比例3-3佑PC-3/0K-)的樹突 細(xì)胞誘導(dǎo)CTL期間，通過化ISA測(cè)量的在培養(yǎng)基中IFN-Y的水平的曲線圖。
[0026] 圖13是示出了通過實(shí)施例1-3佑PC-3/0K+)和實(shí)施例2-3佑PC-3/0K+)的樹突細(xì) 胞活化的，通過IFN-Y化ISPOT分析測(cè)量的CTL的抗原特異性的柱形圖。如圖IB中所示， CTL通過經(jīng)抗原和除了溶鏈菌制劑之外的成熟因子處理之后0或4小時(shí)又經(jīng)溶鏈菌制劑 (0K432)處理的樹突細(xì)胞誘導(dǎo)。
[0027] 圖14示出了實(shí)施例1-3佑PC-3/0K+)和實(shí)施例2-3佑PC-3/0K+)的CTL的抗原特 異性的細(xì)胞毒性的曲線圖。
[002引圖15是示出了通過實(shí)施例3-1至3-5的樹突細(xì)胞誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖的柱形圖。
[0029] 圖16是示出了通過實(shí)施例3-1至3-5的樹突細(xì)胞誘導(dǎo)的Thl免疫應(yīng)答的柱形圖。
[0030] 圖17是示出了通過實(shí)施例3-1至3-5的樹突細(xì)胞誘導(dǎo)的，通過IFN-YELISPOT分 析測(cè)量的CTL的抗原特異性的柱形圖。

【具體實(shí)施方式】
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提出了一種使樹突細(xì)胞成熟的組合物，該組合物 包括含溶鏈菌制劑（0K432)成熟因子。本發(fā)明具體是發(fā)明人通過發(fā)現(xiàn)W下過程來完成的： 經(jīng)過成熟因子溶鏈菌制劑（0K432)和抗原W-定時(shí)間間隔進(jìn)行的處理而成熟的樹突細(xì)胞 誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力明顯提高。另外，通過本發(fā)明的樹突細(xì)胞，降低了抗原非特異性的免疫 應(yīng)答，同時(shí)提高了抗原特異性的免疫應(yīng)答，從而使免疫療法的效果最大化。
[0032] 在本發(fā)明中使用的成熟因子可W是選自白細(xì)胞介素-1目（IL-1目）、白細(xì)胞介 素-6 (比-6)、腫瘤壞死因子-a (TNF-a )、干擾素Y (IFN-Y )、前列腺素E2 (PGE2)、溶鏈菌 制劑（0K432)和聚肌胞中的至少一種，優(yōu)選是溶鏈菌制劑（0K432)。
[0033] 溶鏈菌制劑（0K432)是抗腫瘤的藥物，用于增加細(xì)胞免疫力，并且是由經(jīng)青霉素 預(yù)處理的凍干的溶血性鏈球菌制得的。在本領(lǐng)域中，只要是指溶鏈菌制劑（0K432)的任 何藥劑都可W在本發(fā)明中使用，沒有任何特別的限制。雖然最初開發(fā)溶鏈菌制劑（0K432) 是用于治療消化系統(tǒng)癌癥、甲狀腺癌和肺癌，但在本發(fā)明中，溶鏈菌制劑（0K432)用作 樹突細(xì)胞成熟因子，W大大增強(qiáng)樹突細(xì)胞誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力。而且，選自白細(xì)胞介 素-1目（比-1目）、白細(xì)胞介素-6 (比-6)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、干擾素Y(IFN-Y)、 前列腺素E2 (PGE2)和聚肌胞中的任何物質(zhì)都可用在本發(fā)明中，而沒有任何限制。
[0034] 在不依賴于諸如RPMI(洛斯維帕克紀(jì)念研究所）1640、無血清的X-VIV015等培養(yǎng) 基的情況下，本發(fā)明的樹突細(xì)胞顯示出優(yōu)異的誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的潛力。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明的成熟組合物不僅能增強(qiáng)樹突細(xì)胞誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，而且還能提 高抗原特異性的免疫應(yīng)答，同時(shí)降低非特異性的免疫應(yīng)答。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了使用上述成熟組合物制備的樹突細(xì)胞，該 樹突細(xì)胞能夠誘導(dǎo)抗原特異性的免疫應(yīng)答。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了制備能夠誘導(dǎo)抗原特異性的免疫應(yīng)答的樹 突細(xì)胞的方法，該方法包括：使用抗原使未成熟的樹突細(xì)胞致敏；W及，使用成熟因子處理 經(jīng)過致敏的樹突細(xì)胞。
[0038] 使用抗原的致敏和使用成熟因子的處理可W同時(shí)進(jìn)行或順序進(jìn)行。例如，細(xì)胞可 W同時(shí)與抗原和成熟因子一起賠育?？蛇x擇的，可W在使用抗原進(jìn)行致敏之后1至30小時(shí)， 再使用成熟因子處理該細(xì)胞。該是優(yōu)選的方法。
[0039] 尤其當(dāng)利用溶鏈菌制劑和不同的成熟因子時(shí)，更優(yōu)選W-定時(shí)間間隔來使用該溶 鏈菌制劑和不同的成熟因子。也就是說，可W使用選自白細(xì)胞介素-1目（IL-1目）、白細(xì)胞介 素-6(比-6)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、干擾素Y(IFN-Y)、前列腺素E2(PGE2)和聚肌 胞中的至少一種處理細(xì)胞，然后細(xì)胞再與溶鏈菌制劑（0K432) -起賠育。優(yōu)選的，在使用抗 原進(jìn)行致敏的同時(shí)或之后1小時(shí)之內(nèi)，使用除了溶鏈菌制劑之外的成熟因子的組合進(jìn)行處 理。對(duì)于溶鏈菌制劑，優(yōu)選在使用抗原的進(jìn)行致敏之后1小時(shí)，并且更優(yōu)選的，在經(jīng)抗原的 致敏和經(jīng)其它成熟因子的處理之后且在收獲樹突細(xì)胞之前1至4小時(shí)，進(jìn)行溶鏈菌制劑的 施用。
[0040] 在使用除了溶鏈菌制劑之外的成熟因子處理之后的預(yù)定時(shí)間時(shí)使用溶鏈菌制劑 進(jìn)行處理，該樣能夠使樹突細(xì)胞降低非特異性的免疫應(yīng)答，并且顯示出最大的抗原特異性 的免疫應(yīng)答。
[0041] 成熟因子如上所述。
[0042] 樹突細(xì)胞是抗原提呈細(xì)胞，在免疫系統(tǒng)的細(xì)胞中，它們具有提呈抗原的最大潛力。 因此，樹突細(xì)胞具有通過抗原攝取和抗原加工提呈至MHCI/II分子的能力，其中，抗原的類 型并不特別限制為大的重組蛋白或膚、癌裂解物、核糖核酸、癌細(xì)胞的融合物，或調(diào)亡或壞 死的癌細(xì)胞。因此，樹突細(xì)胞能夠有益于不受具體類型限制的抗原。本發(fā)明中可用的抗原 的實(shí)例包括；但并不限于，AFP(a-胎甲球蛋白）、GPC-3 (磯脂醜基醇蛋白聚糖-3)、PSA(前 列腺特異性抗原）、MAGE-1 (黑素瘤相關(guān)的抗原1)、PSMA(前列腺特異性的膜抗原）、PAP(前 列腺酸性磯酸酶）和癌細(xì)胞系的裂解物，或癌組織。
[0043] 通過W下實(shí)施例可W更好地理解本發(fā)明，W下實(shí)施例用于例示本發(fā)明，但并不能 理解為限制本發(fā)明。
[0044] <實(shí)施例和對(duì)比例〉
[0045] 如下表1中所示，制備實(shí)施例和對(duì)比例的成熟的樹突細(xì)胞。
[0046] 表1
[0047]

【權(quán)利要求】
1. 一種使樹突細(xì)胞成熟的組合物，包括：作為成熟因子的選自白細(xì)胞介 素-1MIL-1 0 )、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、干擾素Y(IFN-Y)、 前列腺素E2(PGE2)、溶鏈菌制劑（0K432)和聚肌胞中的至少一種。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，包括溶鏈菌制劑（0K432)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物增強(qiáng)所述樹突細(xì)胞誘導(dǎo)免疫應(yīng)答 的能力。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物降低所述樹突細(xì)胞的抗原非特異 性的免疫應(yīng)答。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物提高所述樹突細(xì)胞的抗原特異性 的免疫應(yīng)答。
6. -種抗原特異性的樹突細(xì)胞，所述抗原特異性的樹突細(xì)胞通過使用權(quán)利要求1至5 中任一項(xiàng)所述的組合物制備。
7. -種制備抗原特異性的樹突細(xì)胞的方法，包括： 使用抗原使未成熟的樹突細(xì)胞致敏；以及 使用選自白細(xì)胞介素-1MIL-1 @ )、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因 子-a(TNF-a)、干擾素Y (IFN-Y)、前列腺素E2(PGE2)、溶鏈菌制劑（0K432)和聚肌胞中 的至少一種成熟因子處理經(jīng)致敏的所述樹突細(xì)胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，在致敏步驟之后1至30小時(shí)，使用所述成熟因子 處理所述細(xì)胞。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述成熟因子包括白細(xì)胞介素-IP(IL-1P)、白 細(xì)胞介素-6 (IL-6)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、干擾素y(IFN-Y)、前列腺素E2 (PGE2)、 溶鏈菌制劑（OK432)和聚肌胞。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述處理的步驟包括使用選自白細(xì)胞介 素-1MIL-1 0 )、白細(xì)胞介素-6(IL_6)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、干擾素y(IFN-Y)、 前列腺素E2(PGE2)和聚肌胞中至少一種處理所述細(xì)胞，然后使用溶鏈菌制劑（OK432)處理 所述細(xì)胞。
11. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述抗原是選自癌細(xì)胞系或癌組織的裂解 物、AFP(a-胎甲球蛋白）、GPC-3 (磷脂?；嫉鞍拙厶?3)、PSA(前列腺特異性抗原）、 MAGE-1 (黑素瘤相關(guān)的抗原1)、PSMA(前列腺特異性的膜抗原）、PAP(前列腺酸性磷酸酶）， 及它們的重組蛋白中的至少一種。
【文檔編號(hào)】C12N5/02GK104379730SQ201380029061
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2013年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月31日
【發(fā)明者】李潤(rùn), 康惠媛, 韓承洙, 金永穆, 裵容洙, 安瑞姬 申請(qǐng)人:Jw可瑞基因株式會(huì)社