用于流式細胞術(shù)的樣品制備方法
【專利摘要】這里描述的是用于識別和分析樣品中的至少一種微生物（例如細菌）以及降低當(dāng)通過流式細胞術(shù)分析樣品時獲得的背景信號強度的方法和試劑。通過結(jié)合樣品與減少背景信號的分子或與和淬滅劑以共價鍵連接的核酸染色劑來制備樣品。樣品中的一部分顆粒物質(zhì)可以在利用核酸染色劑染色之前可選擇地利用樹脂去除。
【專利說明】用于流式細胞術(shù)的樣品制備
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年4月5日提交的美國第61/620, 823號臨時專利申請的申請日 的權(quán)益，并且本申請與2013年3月13日提交的美國第61/779, 766號臨時申請相關(guān)，該申 請與本申請是共同擁有的，該兩個申請的公開的內(nèi)容通過參考結(jié)合于此。

【背景技術(shù)】
[0003] 確定特定樣品中活的生物體的身份和總數(shù)非常重要。通過監(jiān)督和食物中致病菌的 鑒定快速、有效、準(zhǔn)確地監(jiān)控和確保食物和供水的安全尤為重要。
[0004] 總活的生物體（totalVi油Ieorganism，TV0)測定是實現(xiàn)上述目標(biāo)的一種該樣的 方法。目前，TVO測定技術(shù)作為一種質(zhì)量控制應(yīng)用廣泛用在工業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域。例如，TVO 測定用于監(jiān)控消費類食物產(chǎn)品一例如肉類一中的細菌數(shù)量和類型。TVO方法也可W用 于監(jiān)控飲用水中的細菌群落。當(dāng)然，監(jiān)控食品和飲用水對保障食品和供水消費安全是至關(guān) 重要的。
[0005] TVO測定的步驟總體上包括；1)獲取測樣品品；W及2)在放置在適宜容器中的瓊 脂（一種凝膠狀的營養(yǎng)基）上培養(yǎng)樣品或者直接涂覆樣品。該樣，微生物得W生長，并且基 于形成于瓊脂之上的菌落數(shù)，可W計算多個菌落形成單位（C即)。僅在菌落生長的允許時間 之后，可W計算CFU。計算C即時，通常要將樣品進行稀釋，并考慮該稀釋因數(shù)（即樣品和總 體積的體積比率）。
[0006] 也可W將樣品放置于各種各樣的瓊脂板上培養(yǎng)，瓊脂板含有不同類型的選擇性培 養(yǎng)基W幫助隔離目標(biāo)微生物，并且更準(zhǔn)確和可靠地確定存在何種類型的微生物。選擇性試 劑（例如抗生素，抗真菌藥劑等）將消除某些非目標(biāo)微生物（例如，不感興趣的細菌）。如 果形成來自于許多不同類型的微生物的群落，則該樣可W避免可能產(chǎn)生的假性結(jié)果的可能 性。
[0007] 選擇性試劑還可W優(yōu)于其他試劑促成某些類型的微生物的生長。盡管TVO測定考 慮到檢測不同的微生物種群一例如不同的細菌種群，但食品和環(huán)境微生物學(xué)家必須經(jīng)常 在枚舉和鑒定兩者之間在沒有二者的選擇能力的情況下進行選擇。雖然可W增加選擇性試 劑W促成特定群組的菌類的生長，但是TVO測定經(jīng)常要基于在富營養(yǎng)培養(yǎng)基中繁殖正常的 健康細胞的能力（即沒有選擇性）。因此，TVO具有測量被測樣品中微生物總數(shù)或微生物的 群組的能力。然而，因為缺乏區(qū)分特定微生物的能力，TVO整體來看可W是對于微生物種群 來說是相對非特異性的。
[0008] 識別特定微生物，尤其是病原體可用的方法很多。該樣的方法廣泛應(yīng)用于臨床環(huán) 境。檢測微生物的方法經(jīng)常依賴于微生物培養(yǎng)的富集W增加目標(biāo)微生物的數(shù)量，W及允許 受損微生物的恢復(fù)。當(dāng)使用選擇性和區(qū)分性平皿培養(yǎng)（plating)時，研究人員能夠?qū)⒛繕?biāo) 生物體從背景微生物群落中區(qū)分開來。然而，結(jié)果幾乎總是不可計數(shù)的。換言之，僅可W確 定特定的細菌種群的存在或者不存在，而非數(shù)量。
[0009] 利用樣品富集和選擇性平皿培養(yǎng)二者都是很耗時的測定，它們在甚至可W得到初 步的結(jié)果之前，也經(jīng)常要花費數(shù)天時間。盡管該樣的富集或者選擇性平皿培養(yǎng)是確定樣品 中微生物的數(shù)量和種類的最基本的程序，但要在計數(shù)瓊脂上生長的菌落后典型地花費數(shù)天 得到最終的結(jié)果。得到結(jié)果所花費的時間的總量是利用最基本的TVO測定的最顯著的缺 陷。
[0010] 通過取消選擇性和區(qū)分性平皿培養(yǎng)步驟來試圖縮短檢測時間的不同方法已經(jīng)得 到開發(fā)。該些方法包括DNA雜交，凝集，W及酶免疫分析法。盡管該些可供選擇的技術(shù)已經(jīng) 縮短了用于檢測的時間，但培養(yǎng)富集步驟仍然是必須的，原因在于該些方法只允許目標(biāo)病 原體的1〇3 -IO4CFU的最終檢測。因此，對于TVO測定來講，對于假定地陽性結(jié)果的確認仍 然是必須的。
[0011] 進一步來說，不存在用于分析生物樣品一尤其是食物樣品一W檢測多種微生 物的存在或者不存在的通用方法或者單一技術(shù)。該使得在用于微生物的測定前用于從生物 樣品中的微生物的分離和隨后的濃縮的樣品制備步驟成為用于病原體一包括食物源性 病原體一的檢測的分子方法中的限制步驟。
[0012] 至于用于微生物的分離的特異性樣品制備技術(shù)，利用離也法然后進行洗涂和過濾 步驟的技術(shù)是不利的，因為在處理過程中，它們會導(dǎo)致微生物的顯著損失或者對微生物的 損傷。進一步來說，整個程序不適合于自動化操作。
[0013]為實現(xiàn)從樣品中分離微生物，已經(jīng)使用針對特定微生物的親和劑。然而，用于從復(fù) 雜基質(zhì)中隔離微生物的親和劑的有效利用也是很復(fù)雜的，原因如下：1)缺乏從其他的樣品 組分中選擇性地結(jié)合所有的生物體的通用親和劑；2)對于通用的親和試劑，結(jié)合不同的生 物體的親和性的變化性；3)很難將結(jié)合后的生物體洗脫回到溶液中。
[0014] 其他用于識別食品和水中的病原體的技術(shù)也是公知的。例如，有報道稱流式細 胞術(shù)作為一種快速確定微生物的數(shù)目和識別微生物的技術(shù)。最初，流式細胞術(shù)是用于分 離和分析真核細胞種群的方法，但也已經(jīng)用于評估和檢試微生物。具體地，已經(jīng)例如利用 核酸染料進行英光染色的微生物穿過一束光。對感興趣的微生物唯一的圖案通過光的吸 收和散射二者的組合來實現(xiàn)。炬reeuwer等人發(fā)表在環(huán)境微生物應(yīng)用（Appl. Environ. Micriobiol.)，61 (4) : 1614-9(1995年4月版）中的啤酒酵母中通過細胞內(nèi)醋酶的導(dǎo)致英 光產(chǎn)物積累的英光素二己酸醋和二醋酸駿基英光素的吸收和水解表征（化aracterization of uptake and hydrolysis of fluorescein diacetate and carboxyfIuorescein diacetate by intracellular esterases in S. cerevisiae) ；de Boer&Beumer發(fā)表在國 際食品微生物雜志50 (1-2) : 119-30 (1999年9月版）中的食物源性微生物的檢測和歸類方 法（Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms))。
[0015] 流式細胞術(shù)的主要優(yōu)點在于它操作起來快速、簡單。流式細胞術(shù)適用于不同類型 的樣品和方法，成為了也適應(yīng)于自動化操作的穩(wěn)健應(yīng)用。許多流式細胞術(shù)應(yīng)用已經(jīng)出現(xiàn)在 工業(yè)生物技術(shù)、食品和藥品質(zhì)量控制、飲用水和廢水系統(tǒng)的常規(guī)監(jiān)測^及±壤和天然水生 生境的微生物生態(tài)研究也就不足為奇了。
[0016] 然而，流式細胞術(shù)具有其他局限性，例如為檢測而對標(biāo)記目標(biāo)微生物進行染色的 需要，設(shè)備的高昂成本W(wǎng)及對人員的?？诘呐嘤?xùn)的需要。對于檢測的進一步的限制是由 W下方面強加的：非特異性英光的干擾，小于最佳檢測極限，將該方法應(yīng)用于固體或者顆 粒狀食品樣品的困難，對區(qū)分活的和死亡的細胞的無能一處分使用?？诘闹?，W及會 在樣品處理過程中發(fā)生的細胞存活率的破壞（Quintero-Betancoud等人在微生物方法 雜志（J.Microbiol.Methods),49(3) :209-24(2002年5月版）中發(fā)表的隱抱子蟲和環(huán)抱 子蟲；檢測水傳播寄生蟲的實驗室方法綜述（Cryptosporidiumparvumand切clospora cayetanensis:areviewoflaboratorymethodsfordetectionofthewaterborne parasites))。該技術(shù)的廣闊且常規(guī)的利用已經(jīng)開始減輕該些缺陷。
[0017] 其他實際問題也屬于流式細胞術(shù)，特別是在分析來自于被稱為"復(fù)雜基質(zhì)"的生物 或者環(huán)境樣品的情況下。復(fù)雜基質(zhì)可W由包括顆粒物質(zhì)的物質(zhì)組成，其中顆粒物質(zhì)干擾生 物或者環(huán)境樣品中微生物的檢測。用于檢測樣品中微生物的核酸染料可W非特異性地結(jié)合 樣品基質(zhì)中的該樣的顆粒物質(zhì)，產(chǎn)生一個高背景英光信號。該一高背景使得識別和分析樣 品中的低濃度的微生物變得困難。
[0018] 如在buttry等人的美國專利第7, 205, 100號中已有描述的-該專利的全部內(nèi) 容通過參考結(jié)合于此，通過在感興趣的樣品中混合目標(biāo)特異性英光染料和英光巧滅劑可W降低由滲透膜生成的英光背景和英光信號。然而，在一些含有細胞外顆粒的樣品基質(zhì) 中一細胞外顆粒具有對目標(biāo)特異性英光染料的非特異性親和力，英光背景就不能被英光 巧滅劑有效巧滅。另外，在含有大量具有對目標(biāo)特異性英光染料的非特異性親和力的細胞 外顆粒的樣品中，絕大多數(shù)目標(biāo)特異性染料將非特異性地結(jié)合該些顆粒，結(jié)果溶液中就不 會有足夠的染料分子用來標(biāo)記目標(biāo)生物體。
[0019] 因此，人口尋求解決針對利用流式細胞術(shù)檢測樣品中微生物的存在或不存在的當(dāng) 前方法的缺點的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] 本發(fā)明涉及一種在樣品中識別至少一種微生物的存在或不存在的方法。如此處所 描述的，首先獲得針對至少一種微生物的存在或不存在的待測樣品，然后制備該待測樣品 用于待進行的測定。使用活著的或者死亡的生物體二者可滲透的英光核酸染色劑標(biāo)記用于 流式細胞術(shù)研究的息浮液中的細胞。然而，當(dāng)息浮液里的目標(biāo)細胞具有來自于非特異性地 結(jié)合核酸染料的樣品基質(zhì)的顆粒物質(zhì)時，會不利地影響該樣的流式細胞術(shù)的檢測靈敏性。 該里描述了一些掩蓋和/或者去除溶液中的來自那些干擾顆粒的英光信號并隨后提高檢 測靈敏度的途徑。
[0021] 在一個實施例中，分析樣品用來確定活的微生物的數(shù)量的方法包括獲得樣品，W 及制備樣品用于檢測樣品中活的微生物的存在或不存在的測定。在一個實施例中，測定是 TVO測定。作為樣品制備的一部分，樣品中加入過量的減少背景信號的分子。核酸染色劑 透過活細胞（也加入樣品中），減少背景信號的分子不會滲透樣品中的活細胞，但是在制備 的樣品中具有與滲透活細胞的核酸染色劑（其也加入到樣品中）類似的對樣品中的非活細 胞（例如死細胞，細胞碎片）和其他非細胞物質(zhì)的結(jié)合能力。制備好的樣品進行總活的生 物體的測定。
[0022] 該里預(yù)期的減少背景信號的分子的示例是半花菁或者閉鏈花菁。該樣的分子包括 基本花菁結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有含有至少一個氮原子的五元雜環(huán)?；净ㄝ糤結(jié)構(gòu)（I)進行說 是：
[0023]Y-(CH=CH)"-CH=Z
[0024] 結(jié)構(gòu)（I)，或者是它的鹽。
[0025] 其中，Y是：
[0026]

【權(quán)利要求】
1. 一種針對活的微生物的量分析樣品的方法，包含： 獲得針對至少一種目標(biāo)微生物的存在或不存在的待測樣品；制備樣品；加入包含過量 的減少背景信號的分子的減少背景信號的物質(zhì)；加入滲透和標(biāo)記微生物的目標(biāo)活的細胞的 核酸染色劑；以及分析制備好的樣品，其中減少背景信號的分子以與核酸染色劑類似的方 式和類似的效率與非目標(biāo)顆粒結(jié)合。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，樣品選自由食物樣品、環(huán)境樣品、化妝品 樣品和生物樣品組成的群組。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當(dāng)與樣品結(jié)合時，減少背景信號的分子的 濃度為從〇. ΙμΜ到50μΜ。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當(dāng)與樣品結(jié)合時，減少背景信號的分子的 濃度為從〇. ΙμΜ到10 μΜ。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當(dāng)與樣品結(jié)合時，減少背景信號的分子的 濃度為從〇. 5μΜ到5μΜ。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，加入核酸染色劑之前，利用樣品培養(yǎng)減少 背景信號的分子2分鐘到1小時。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，加入核酸染色劑之前，利用樣品培養(yǎng)減少 背景信號的分子2分鐘到30分鐘。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，加入核酸染色劑之前，利用樣品培養(yǎng)減少 背景信號的分子2分鐘到5分鐘。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，淬滅劑附加于減少背景信號的分子。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，減少背景信號的分子是半花菁或者閉鏈 花菁。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，減少背景信號的分子選自由具有結(jié)構(gòu) Y-(CH=CH)n-CH=Z的分子或者它的鹽組成的群組，其中，
，并且是取代的或未取代的； η是0或者直到大約5的整數(shù)； X是碳或者硫； R1可選擇地是氫、具有1-6個碳原子的烷基、亞硫酸鹽部分或者烷基酰胺，并且可以進 行選擇以便降低進入活的目標(biāo)微生物中的減少背景信號的分子的細胞滲透性；并且 Z與Y相同或不同。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，η是0或者直到大約3的整數(shù)。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，Y選自由與其融合的苯部分；與其融合 的苯部分衍生物；喹諾酮取代基組成的群組， 其中苯部分、苯部分衍生物和喹諾酮可以是取代的或未取代的。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，η是0或者直到大約3的整數(shù)；X是硫， R1是烷基酰胺；并且Y具有與其融合的苯或者苯衍生物。
15. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，減少背景信號的分子選自由下述組成 的群組：
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，減少背景信號的分子在核酸染色劑之后 加入或者與核酸染色劑同時加入。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，制備好的樣品通過流式細胞術(shù)進行分 析。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，背景信號強度降低至少90%。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，背景信號強度降低至少70%。
20. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，背景信號強度降低至少50%。
21. -種分析樣品以確定活的微生物的量的方法，包含： 獲得針對至少一種目標(biāo)微生物的存在或不存在的待測樣品；制備樣品；加入與熒光淬 滅劑以共價鍵連接的核酸染色劑；加入不具有淬滅劑、滲透活的細胞的核酸染色劑；以及 分析制備好的樣品，其中與淬滅劑以共價鍵連接的核酸染色劑以與不具有淬滅劑的核酸染 色劑類似的方式和類似的效率結(jié)合非目標(biāo)顆粒，與淬滅劑以共價鍵連接的核酸染色劑沒有 實質(zhì)上滲透微生物的目標(biāo)活的細胞，并且熒光淬滅劑通過光譜重疊淬滅不具有淬滅劑的核 酸染色劑的熒光信號；并且，其中不具有淬滅劑的核酸染色劑滲透并標(biāo)記微生物的目標(biāo)活 的細胞。
22. -種針對至少一種目標(biāo)微生物的存在或不存在分析樣品的方法，包含： 獲得針對至少一種目標(biāo)微生物的存在或不存在的待測樣品；制備樣品；結(jié)合樣品與選 擇的樹脂從而結(jié)合樣品中的非目標(biāo)顆粒；從樣品中去除樹脂，樹脂攜帶隨其的非目標(biāo)顆粒； 在去除隨其的樹脂之后，結(jié)合樣品和核酸染色劑；以及分析制備好的樣品。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，通過過濾從樣品中去除樹脂。
24. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過使用樹脂去除樣品中的至少一部分 顆粒物質(zhì)來制備樣品。
25. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，通過使用樹脂去除樣品中的至少一部 分顆粒物質(zhì)來制備樣品。
26. -種用于檢測樣品中的至少一種微生物的試劑盒，包含下述中的至少一種：減少 背景信號的分子或者與淬滅劑以共價鍵連接的核酸染色劑；不具有猝滅劑的核酸染色劑； 以及可選擇地樹脂，其中減少背景信號的分子以與不具有淬滅劑的核酸染色劑類似的方式 和類似的效率結(jié)合樣品中的非目標(biāo)顆粒，其中與淬滅劑以共價鍵連接的核酸染色劑沒有實 質(zhì)上滲透微生物的目標(biāo)活的細胞，熒光淬滅劑通過光譜重疊淬滅不具有淬滅劑的核酸染色 劑的熒光信號，并且與淬滅劑以共價鍵連接的核酸染色劑以與不具有淬滅劑的核酸染色劑 類似的方式和類似的效率結(jié)合非目標(biāo)顆粒；其中不具有淬滅劑的核酸染色劑滲透并標(biāo)記微 生物的目標(biāo)活的細胞，并且其中選擇樹脂以結(jié)合樣品中的非目標(biāo)顆粒。
27. -種用于降低流式細胞術(shù)測定中的背景信號強度的減少背景信號的物質(zhì)，其特征 在于，該物質(zhì)包含結(jié)合包含復(fù)雜基質(zhì)和至少一種微生物的樣品中的非目標(biāo)顆粒的分子，其 中所述分子以與核酸染色劑類似的方式和類似的效率結(jié)合非目標(biāo)顆粒，其中所述核酸染色 劑加入到樣品中以檢測其中的活的微生物的存在或不存在，該物質(zhì)結(jié)合非目標(biāo)顆粒。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的分子，其特征在于，減少背景信號的分子具有結(jié)構(gòu) Y-(CH=CH) n-CH=Z或者它的鹽，其中，
，并且是取代的或未取代的； η是0或者直到大約5的整數(shù)； X是碳或者硫； R1可選擇地是氫、具有1-6個碳原子的烷基、亞硫酸鹽部分或者烷基酰胺，并且可以進 行選擇以便降低進入活的目標(biāo)微生物中的減少背景信號的分子的細胞滲透性；并且 Z與Y相同或不同。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的分子，其特征在于，η是O或者直到大約3的整數(shù)。
30. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的分子，其特征在于，Y選自由與其融合的苯部分；與其融合 的苯部分衍生物；以及喹諾酮取代基組成的群組，其中苯部分、苯部分衍生物和喹諾酮是取 代的或未取代的。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的分子，其特征在于，η是0或者直到大約3的整數(shù)；X是硫， R1是烷基酰胺；并且Y具有與其融合的苯或者苯衍生物。
32. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的分子，其特征在于，減少背景信號的分子選自由下述組成 的群組

【文檔編號】C12Q1/02GK104379760SQ201380029083
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年4月4日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月5日
【發(fā)明者】李曉, 張永強, 肯尼思.安東尼.高夫, 約翰.D.曼特羅, 威廉.艾爾弗雷德.波普, 石松, 阿克塞爾.A.俞 申請人:Bd公司