使用絲狀菌的來自西洋山葵的過氧化物酶重組蛋白質(zhì)的制造方法
【專利摘要】一種多核苷酸，其是在至少一個(gè)密碼子中具有與編碼來自西洋山葵的過氧化物酶多肽的野生型堿基序列不同的堿基序列且被修飾的多核苷酸，修飾的密碼子的使用頻率為腐質(zhì)霉、曲霉及木霉3種絲狀菌的密碼子使用頻率，在絲狀菌中能夠使編碼的多肽表達(dá)。
【專利說明】使用絲狀菌的來自西洋山葵的過氧化物酶重組蛋白質(zhì)的制 造方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種使用絲狀菌的來自西洋山葵的過氧化物酶重組蛋白質(zhì)的制造方 法。更詳細(xì)地涉及：編碼來自西洋山葵的過氧化物酶多肽并在該絲狀菌中能夠表達(dá)該多肽 的多核苷酸、含有該多核苷酸的表達(dá)載體、將該表達(dá)載體導(dǎo)入絲狀菌而形成的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體、 使用該形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的來自西洋山葵的過氧化物酶重組蛋白質(zhì)的制造方法、以該制造方法制 造的來自西洋山葵的過氧化物酶重組蛋白質(zhì)及含有其的制劑以及其用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 來自西洋山葵的過氧化物酶作為在酶聯(lián)免疫測定法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ;ELISA)、免疫組織染色法、南方墨點(diǎn)法、西方墨點(diǎn)法等各種試驗(yàn)中檢 測用的酶的一種，被廣泛使用。此外，近年來也被廣泛用作臨床檢測試劑盒用酶。
[0003] 雖然過氧化物酶廣泛存在于蘿卜、紅薯、小麥、日本山葵、西洋山葵等一般植物界 中，但是由于西洋山葵的過氧化物酶含量較高等理由，在工業(yè)生產(chǎn)上，優(yōu)選用西洋山葵。
[0004] 但是,來自西洋山葵的過氧化物酶由酸性、中性及堿性同工酶等多種酶構(gòu)成。另 夕卜，過氧化物酶含量及這些同工酶組成比除了根據(jù)栽培土壤的性質(zhì)、給予肥料的種類以及 量、氣候、收獲時(shí)間等不同會有顯著的變動以外，由于是以破壞植物并從多種多樣的夾雜成 分中純化過氧化物酶的方法來制造，因此從西洋山葵純化的過氧化物酶的品質(zhì)并不一定是 恒定的。也就是，現(xiàn)在廣泛使用的來自西洋山葵的過氧化物酶制品的大多數(shù)幾乎是多種同 工酶的混合物的狀態(tài)，其比例幾乎每個(gè)批次不同。進(jìn)行使用這種來自西洋山葵的過氧化物 酶制品的各種測定，例如ELISA時(shí)，隨制造批次而產(chǎn)生不均勻，因而存在難以得到穩(wěn)定的測 定結(jié)果的重大問題。
[0005] 此外，由于作為原料的西洋山葵的栽培需要長時(shí)間，根據(jù)氣候不同其產(chǎn)量會變動， 近年來，由于栽培效率的惡劣或輪栽成需要量大的生物乙醇用谷物等理由，擔(dān)憂會產(chǎn)生西 洋山葵的供給不穩(wěn)定的狀況，對于能夠穩(wěn)定供給的來自西洋山葵的過氧化物酶的潛在的需 要大。
[0006] 作為克服具有如前述所示的來自西洋山葵的過氧化物酶的問題的方法，考慮通過 使用基因重組技術(shù)的微生物來大量生產(chǎn)。通過使用微生物，不僅能夠在短時(shí)間內(nèi)大量栽培， 也能夠不受氣候等影響而進(jìn)行穩(wěn)定供給。此外，利用基因重組技術(shù)，能夠大量地僅表達(dá)作為 目的的過氧化物酶，因此也能夠避免同工酶的夾雜的問題。
[0007] 在來自西洋山葵的過氧化物酶中，作為主要同工酶之一的過氧化物酶CI a，其DNA 序列及氨基酸序列已明確（參照非專利文獻(xiàn)1)。此外，研究使用編碼過氧化物酶Cla的基因 在大腸桿菌、酵母及煙草植物細(xì)胞中的表達(dá)。但是，其表達(dá)量在大腸桿菌中的〇. llmg/L(參 照非專利文獻(xiàn)2)、在酵母中的5. 3mg/L(參照非專利文獻(xiàn)3)、在煙草植物細(xì)胞中的3mg/ L (參照非專利文獻(xiàn)4)為微量，生產(chǎn)極低且不實(shí)用。由以上所述，期望開發(fā)可大量生產(chǎn)來自 西洋山葵的過氧化物酶的重組生物以及使用它的來自西洋山葵的過氧化物酶的制造方法。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)：
[0009] 非專利文獻(xiàn)
[0010] 非專利文獻(xiàn) I :Fujiyama et al. Eur. J. Biochem, 1988 年，173 卷，第 681-687 頁
[0011] 非專利文獻(xiàn) 2 :Lin et al. Biotechnol. Prog.，1999 年，15 卷，第 467-471 頁
[0012] 非專利文獻(xiàn) 3 :Morawski et al. Protein Engineering, 2000 年，13 卷，第 377-384 頁
[0013] 非專利文獻(xiàn) 4 :Matsui et al.J. Biosci. Bioeng. ,2006 年，102 卷，第 102-109 頁


【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 發(fā)明要解決的課題
[0015] 本發(fā)明鑒于前述現(xiàn)有技術(shù)具有的問題而作成，其目的為提供一種能夠大量并高效 率地制造來自西洋山葵的過氧化物酶多肽的多核苷酸。
[0016] 解決課題的方法
[0017] 本
【發(fā)明者】為了達(dá)成所述目的，首先，將含有編碼野生型的來自西洋山葵的過氧化 物酶（HRP)Cla的多核苷酸的表達(dá)載體導(dǎo)入到絲狀菌中，研究在得到的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體中的HRP 肽的產(chǎn)生量。但是，明確的是：不能確認(rèn)由該形質(zhì)轉(zhuǎn)換體產(chǎn)生HRP肽，即使使用編碼野生型 HRP多肽的多核苷酸，也不能使絲狀菌中產(chǎn)生HRP多肽。
[0018] 因此，本
【發(fā)明者】為了使HRP多肽在絲狀菌中被高表達(dá)而進(jìn)行認(rèn)真研究，首先，考量 在腐質(zhì)霉、曲霉及木霉3種絲狀菌中密碼子的使用頻率。接著，調(diào)制出使HRP多核苷酸中密 碼子的出現(xiàn)頻率符合于所得的密碼子使用頻率的密碼子修飾HRP多核苷酸。然后，使用此 密碼子修飾HRP多核苷酸，對腐質(zhì)霉、曲霉及木霉進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)換后，雖然無法在腐質(zhì)霉中確 認(rèn)其表達(dá)，但能夠在曲霉及木霉中確認(rèn)HRP的表達(dá)。特別是使用木霉時(shí)，成功生產(chǎn)出以往的 100倍以上濃度的HRP。
[0019] 因此，本
【發(fā)明者】為了使HRP在木霉中有更高的表達(dá)，使用僅符合于木霉的密碼子 使用頻率的HRP多核苷酸，對木霉進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)換。其結(jié)果為，能夠在該形質(zhì)轉(zhuǎn)換體中確認(rèn) HRP的表達(dá)。但是，驚訝的是與預(yù)想相反，考量腐質(zhì)霉、曲霉及木霉3種絲狀菌中的密碼子使 用頻率并使用修飾后的多核苷酸來進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)換的情況與使用僅符合作為宿主細(xì)胞的木 霉的密碼子使用頻率的多核苷酸來進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)換的情況相比，HRP的生產(chǎn)性顯著地更高。
[0020] 本
【發(fā)明者】為了進(jìn)一步驗(yàn)證考量腐質(zhì)霉、曲霉及木霉3種絲狀菌的密碼子使用頻率 的有效性，考量該3種絲狀菌的密碼子使用頻率并調(diào)制修飾后的其他多核苷酸，對木霉進(jìn) 行形質(zhì)轉(zhuǎn)換，評價(jià)HRP的表達(dá)。其結(jié)果為，與前述同樣地，在形質(zhì)轉(zhuǎn)換的木霉中，確認(rèn)HRP有 高表達(dá)。另外，通過利用該密碼子修飾HRP多核苷酸，使來自木霉的CBHl多肽或His-tag 多肽融合后的HRP多肽也能夠在絲狀菌中表達(dá)。另外，還發(fā)現(xiàn)介由與這些HRP融合的多肽 能夠簡單地分離純化HRP。此外，還發(fā)現(xiàn)介由密碼子修飾HRP多核苷酸而被形質(zhì)轉(zhuǎn)換的絲 狀菌所產(chǎn)生的HRP多肽在過氧化氫的存在下，能夠?qū)㈦僦瑯浼t色素脫色，從而完成本發(fā)明。 艮P，本發(fā)明更詳細(xì)地提供以下內(nèi)容。
[0021] (1) 一種多核苷酸，其是在至少一個(gè)密碼子中具有與編碼來自西洋山葵的過氧化 物酶多肽的野生型堿基序列不同的堿基序列且經(jīng)修飾的多核苷酸，其密碼子的使用頻率為 下述百分比，其在絲狀菌中能夠使編碼的多肽表達(dá)，
[0022] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為丙氨酸時(shí)，GCC的使用頻率為80%，GCT的使用頻 率為20!% ;
[0023] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為精氨酸時(shí)，CGC的使用頻率為90%，CGT的使用頻 率為10% ;
[0024] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為天冬酰胺時(shí)，AAC的使用頻率為100% ;
[0025] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為天冬氨酸時(shí)，GAC的使用頻率為95%，GAT的使用 頻率為5% ;
[0026] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為半胱氨酸時(shí)，TGC的使用頻率為100% ;
[0027] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為谷氨酰胺時(shí)，CAG的使用頻率為100% ;
[0028] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為谷氨酸時(shí)，GAG的使用頻率為100% ;
[0029] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為甘氨酸時(shí)，GGC的使用頻率為75%，GGT的使用頻 率為25% ;
[0030] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為組氨酸時(shí)，CAC的使用頻率為100% ;
[0031] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為異亮氨酸時(shí)，ATC的使用頻率為100% ;
[0032] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為亮氨酸時(shí)，CTC的使用頻率為80%，CTG的使用頻 率為20!% ;
[0033] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為賴氨酸時(shí)，AAG的使用頻率為100% ;
[0034] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為苯丙氨酸時(shí)，TTC的使用頻率為100% ;
[0035] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為脯氨酸時(shí)，CCC的使用頻率為80%，CCT的使用頻 率為20!% ;
[0036] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為絲氨酸時(shí)，AGC的使用頻率為15%，TCC的使用頻 率為85% ;
[0037] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為蘇氨酸時(shí)，ACC的使用頻率為85%，ACG的使用頻 率為15% ;
[0038] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為酪氨酸時(shí)，TAC的使用頻率為100% ;
[0039] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為纈氨酸時(shí)，GTC的使用頻率為85%，GTG的使用頻 率為5%，GTT的使用頻率為10%。
[0040] (2)根據(jù)（1)中記載的多核苷酸，其中至少2個(gè)密碼子被修飾。
[0041] (3)根據(jù)⑴或⑵中記載的多核苷酸，其中至少10%的密碼子被修飾。
[0042] (4)根據(jù)（1)-(3)中任意一項(xiàng)記載的多核苷酸，其編碼來自西洋山葵的過氧化物 酶Cla多肽且具有選自下述（i)-(ii)中的至少1個(gè)特征，
[0043] (i)含有序列編號：1中記載的喊基序列的編碼區(qū)
[0044] (ii)與序列編號：1中記載的91-1017位組成的堿基序列有95%以上的相同性。
[0045] (5)根據(jù)（1)-(3)中任意一項(xiàng)記載的多核苷酸，其編碼來自西洋山葵的過氧化物 酶Cla多肽且具有選自下述（i)-(ii)中的至少1個(gè)特征，
[0046] (i)含有序列編號：26中記載的喊基序列的編碼區(qū)
[0047] (ii)與序列編號：26中記載的91-1017位組成的堿基序列有95%以上的相同性。
[0048] (6) -種多核苷酸，在（1)-(5)中任意一項(xiàng)記載的多核苷酸中，還附加編碼所期望 的多肽的多核苷酸。
[0049] (7) -種表達(dá)載體，其含有（1)-(6)中任意一項(xiàng)記載的多核苷酸。
[0050] (8) -種形質(zhì)轉(zhuǎn)換體，其由將（7)中記載的表達(dá)載體導(dǎo)入到絲狀菌中而形成。
[0051] (9)根據(jù)⑶中記載的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體，其中所述絲狀菌為木霉屬菌或曲霉屬菌。
[0052] (10)根據(jù)⑶中記載的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體，其中所述絲狀菌為綠色木霉或黑曲霉。
[0053] (11)根據(jù)⑶中記載的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體，其中所述絲狀菌為綠色木霉。
[0054] (12) -種（1)-(6)中任意一項(xiàng)記載的多核苷酸編碼的多肽的制造方法，其包括培 養(yǎng)（8)-(11)中任意一項(xiàng)記載的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體，從培養(yǎng)的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體和/或該形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的培 養(yǎng)物中提取表達(dá)的多肽的步驟。
[0055] (13) -種多肽，其以（12)中記載的方法制造。
[0056] (14) -種多肽，其以（12)中記載的方法制造并除去糖鏈。
[0057] (15) -種制劑，其含有以（12)中記載的方法制造的多肽。
[0058] (16) -種用于檢測目標(biāo)分子的方法，其特征在于：使通過（12)中記載的方法制造 的多肽與所述目標(biāo)分子結(jié)合。
[0059] (17) -種色素的脫色方法，其特征在于：使通過（12)中記載的方法制造的多肽在 過氧化氫的存在下對該色素作用。
[0060] (18) -種酚性化合物的去除方法，其特征在于：使通過（12)中記載的方法制造的 多肽在過氧化氫的存在下對該酚性化合物作用。
[0061] 發(fā)明的效果
[0062] 通過本發(fā)明，提供含有最適于編碼來自西洋山葵的過氧化物酶的絲狀菌表達(dá)的密 碼子的多核苷酸。另外，可使用將所述多核苷酸進(jìn)行了形質(zhì)轉(zhuǎn)換的綠色木霉或黑曲霉來制 造來自西洋山葵的過氧化物酶重組蛋白質(zhì)。
[0063] 附圖簡要說明
[0064] [圖1]是表示介由含有編碼野生型的來自西洋山葵的過氧化物酶（HRP)Cla的多 核苷酸的表達(dá)載體（pCBl-HRP_Native)，將絲狀菌（木霉）進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)換，將所得的形質(zhì)轉(zhuǎn) 換體的培養(yǎng)上清液通過使用抗HRP抗體的西方墨點(diǎn)法（western blot)進(jìn)行分析的結(jié)果的 照片。圖中，1的電泳帶表示分子量標(biāo)記展開的結(jié)果，2的電泳帶表示形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的培養(yǎng)上 清液展開的結(jié)果。
[0065][圖2]是表示將野生型HRP多核苷酸與本發(fā)明的多核苷酸（密碼子修飾HRP多 核苷酸）在堿基序列（1-540位）中比較的結(jié)果的圖。圖中，上方的序列表示野生型HRP多 核苷酸的堿基序列（序列編號：3中記載的堿基序列），下方的序列表示本發(fā)明的多核苷酸 (序列編號：1中記載的堿基序列）。
[0066][圖3]是表示將野生型HRP多核苷酸與本發(fā)明的多核苷酸（密碼子修飾HRP多 核苷酸）在堿基序列（541-1014位）中比較的結(jié)果的圖。圖中，上方序列表示野生型HRP 多核苷酸的堿基序列（序列編號：3中記載的堿基序列），下方序列表示本發(fā)明的多核苷酸 (序列編號：1中記載的堿基序列）。
[0067][圖4]是表示介由含有本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)載體（pNCE2-HRP-humic〇la)，將 腐質(zhì)霉進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)換，將所得的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的培養(yǎng)上清液通過使用抗His-tag抗體的西方 墨點(diǎn)法進(jìn)行分析的結(jié)果的照片。圖中，1的電泳帶表示分子量標(biāo)記展開的結(jié)果，2的電泳帶 表示形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的培養(yǎng)上清液展開的結(jié)果。
[0068][圖5]是表示介由含有本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)載體 (pAmyB-pyr-HRP-AspergiIIus)，將曲霉進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)換，將所得的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的培養(yǎng)上清液 通過使用抗His-tag抗體的西方墨點(diǎn)法進(jìn)行分析的結(jié)果的照片。圖中，1的電泳帶表示分子 量標(biāo)記展開的結(jié)果，2的電泳帶表示形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的培養(yǎng)上清液展開的結(jié)果。
[0069][圖6]是表示介由含有本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)載體（pCBl-HRP-tricho)，將木 霉進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)換，將所得的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的培養(yǎng)上清液通過使用抗His-tag抗體的西方墨點(diǎn) 法進(jìn)行分析的結(jié)果的照片。圖中，1的電泳帶表示分子量標(biāo)記展開的結(jié)果，2的電泳帶表示 形質(zhì)轉(zhuǎn)換體培養(yǎng)上清液展開的結(jié)果。
[0070] [圖7]是表示介由含有本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)載體 (pCBl-HRP (Hisless)-tricho)，將木霉進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)換，將所得的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的培養(yǎng)上清液 通過使用抗HRP抗體的西方墨點(diǎn)法進(jìn)行分析的結(jié)果的照片。圖中，1的電泳帶表示分子量標(biāo) 記展開的結(jié)果，2的電泳帶表示形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的培養(yǎng)上清液展開的結(jié)果。
[0071] [圖8]是表示介由含有本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)載體（pCBl-KR-HRP-tricho)，將 木霉進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)換，將所得的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的培養(yǎng)上清液通過使用抗HRP抗體的西方墨點(diǎn)法 進(jìn)行分析的結(jié)果的照片。圖中，1的電泳帶表示分子量標(biāo)記展開的結(jié)果，2的電泳帶表示形 質(zhì)轉(zhuǎn)換體培養(yǎng)上清液展開的結(jié)果。
[0072] [圖9]是表示介由含有僅符合木霉密碼子使用頻率的HRP多核苷酸的表達(dá)載體 (pCBl-HRP (Hisless)-tricho-2)，將木霉進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)換，將所得的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的培養(yǎng)上清 液通過使用抗HRP抗體的西方墨點(diǎn)法進(jìn)行分析的結(jié)果的照片。圖中，1的電泳帶表示分子量 標(biāo)記展開的結(jié)果，2的電泳帶表示形質(zhì)轉(zhuǎn)換體培養(yǎng)上清液展開的結(jié)果。
[0073] [圖10]是表示將野生型HRP多核苷酸與本發(fā)明多核苷酸（密碼子修飾HRP多核 苷酸）在堿基序列（1-540位）中比較的結(jié)果的圖。圖中，上方序列表示野生型HRP多核苷 酸的堿基序列（序列編號：3中記載的堿基序列），下方序列表示本發(fā)明的多核苷酸（序列 編號：26中記載的堿基序列）。
[0074] [圖11]是表示將野生型HRP多核苷酸與本發(fā)明多核苷酸（密碼子修飾HRP多核 苷酸）在堿基序列（541-1014位）中比較的結(jié)果的圖。圖中，上方序列表示野生型HRP多核 苷酸的堿基序列（序列編號：3中記載的堿基序列），下方序列表示本發(fā)明的多核苷酸（序 列編號：26中記載的堿基序列）。
[0075] [圖12]是表示將本發(fā)明的多核苷酸彼此在堿基序列（1-540位）中進(jìn)行比較的 結(jié)果的圖。圖中，上方序列表示序列編號：1中記載的堿基序列，下方序列表示序列編號：26 中記載的堿基序列。
[0076][圖13]是表示將本發(fā)明的多核苷酸彼此在堿基序列（541-1017位）中進(jìn)行比較 的結(jié)果的圖。圖中，上方序列表示序列編號：1中記載的堿基序列，下方序列表示序列編號： 26中記載的堿基序列。
[0077][圖14]是表示介由含有本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)載體 (pCBl-HRP (Hisless)-tricho-3)，將木霉進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)換，將所得的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的培養(yǎng)上清 液通過使用抗HRP抗體的西方墨點(diǎn)法進(jìn)行分析的結(jié)果的照片。圖中，1的電泳帶表示分子量 標(biāo)記展開的結(jié)果，2的電泳帶表示形質(zhì)轉(zhuǎn)換體培養(yǎng)上清液展開的結(jié)果。
[0078] 發(fā)明的實(shí)施方式
[0079]〈多核苷酸〉
[0080] 如后述的實(shí)施例所示，使用具有編碼來自西洋山葵的過氧化物酶多肽（HRP)的野 生型堿基序列的多核苷酸，在絲狀菌中，通過西方墨點(diǎn)法分析，雖然不能檢測出HRP多肽的 表達(dá)，但是使用密碼子中具有與所述野生型的堿基序列不同的堿基序列的被修飾的多核苷 酸后，在該絲狀菌中，能夠檢測出HRP多肽的表達(dá)。
[0081] 因此，本發(fā)明提供下述多核苷酸。
[0082] 其是在至少一個(gè)密碼子中具有與編碼來自西洋山葵的過氧化物酶多肽的野生型 堿基序列不同的堿基序列且被修飾的多核苷酸，其密碼子的使用頻率為下述百分比，其在 絲狀菌中能夠使編碼的多肽表達(dá)，
[0083] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為丙氨酸時(shí)，GCC的使用頻率為80%，GCT的使用頻 率為20!% ;
[0084] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為精氨酸時(shí)，CGC的使用頻率為90%，CGT的使用頻 率為10% ;
[0085] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為天冬酰胺時(shí)，AAC的使用頻率為100% ;
[0086] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為天冬氨酸時(shí)，GAC的使用頻率為95%，GAT的使用 頻率為5% ;
[0087] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為半胱氨酸時(shí)，TGC的使用頻率為100% ;
[0088] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為谷氨酰胺時(shí)，CAG的使用頻率為100% ;
[0089] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為谷氨酸時(shí)，GAG的使用頻率為100% ;
[0090] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為甘氨酸時(shí)，GGC的使用頻率為75%，GGT的使用頻 率為25% ;
[0091] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為組氨酸時(shí)，CAC的使用頻率為100% ;
[0092] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為異亮氨酸時(shí)，ATC的使用頻率為100% ;
[0093] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為亮氨酸時(shí)，CTC的使用頻率為80%，CTG的使用頻 率為20!% ;
[0094] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為賴氨酸時(shí)，AAG的使用頻率為100% ;
[0095] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為苯丙氨酸時(shí)，TTC的使用頻率為100% ;
[0096] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為脯氨酸時(shí)，CCC的使用頻率為80%，CCT的使用頻 率為20!% ;
[0097] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為絲氨酸時(shí)，AGC的使用頻率為15%，TCC的使用頻 率為85% ;
[0098] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為蘇氨酸時(shí)，ACC的使用頻率為85%，ACG的使用頻 率為15% ;
[0099] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為酪氨酸時(shí)，TAC的使用頻率為100% ;
[0100] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為纈氨酸時(shí)，GTC的使用頻率為85%，GTG的使用頻 率為5%，GTT的使用頻率為10%。
[0101] 在本發(fā)明中，HRP多肽是指從西洋山葵中提取并具有將過氧化物結(jié)構(gòu)氧化性地切 割并分解成2個(gè)羥基的活性的酶，例如，可列舉HRP Cla，HRP Clb、HRP Clc、HRP C2、HRP C3 的同工酶，但從由于在來自西洋山葵的過氧化物酶中是含有率最高的同工酶、因此在從西 洋山葵中提取并作為試劑等廣泛使用的過氧化物酶混合物的性質(zhì)方面最強(qiáng)地反映其性質(zhì) 的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選HRP Cla多肽。
[0102] 此外，作為HRP Cla多肽，典型的為序列編號4中記載的氨基酸序列組成的多肽。 另外，在自然界中也會發(fā)生氨基酸序列變異。因此，HRP多肽中，只要編碼具有所述活性的 蛋白質(zhì)，在序列編號：4中記載的氨基酸序列中也可包含編碼由1個(gè)或多個(gè)氨基酸經(jīng)置換、 刪除、嵌入、和/或附加而得的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
[0103] 另外，公知的是在HRP Cla多肽中，由自N末端的蛋氨酸殘基開始算起至第30個(gè)丙 氨酸殘基為止構(gòu)成的多肽作為HRP的信號肽而起作用。此外，在本發(fā)明中，多肽是指2個(gè)以 上的氨基酸介由肽鍵結(jié)合的分子。因此，不僅包括全長的蛋白質(zhì)，還包括所謂寡肽的概念。 多肽中，除了氨基酸序列的變異以外，例如，可進(jìn)行糖基化、磷酸化、棕櫚?；愇於┗?、 甲基化、乙酰化、泛素化、SUMO化、羥基化、酰胺化等修飾。
[0104] 在本發(fā)明中，典型地，"編碼HRP多肽的野生型堿基序列"是指在序列編號3中記載 的堿基序列。"密碼子"是指3個(gè)編碼氨基酸的核苷酸的堿基的組合。
[0105] 本發(fā)明中，作為具有與所述野生型堿基序列不同的堿基序列的至少1個(gè)密碼子， 優(yōu)選在絲狀菌中使翻譯效率提高的密碼子。該密碼子優(yōu)選為導(dǎo)入了不伴隨氨基酸序列變化 的"退化變異"的密碼子。
[0106] 與通過將具有所述野生型堿基序列的多核苷酸導(dǎo)入到絲狀菌中所產(chǎn)生的HRP多 肽的量相比，通過將在至少1個(gè)密碼子中具有與所述野生型堿基序列不同的堿基序列且被 修飾的多核苷酸導(dǎo)入到絲狀菌中所產(chǎn)生的HRP多肽的量更多時(shí)，可以判定該密碼子為"在 絲狀菌中使翻譯效率提高的密碼子"。對于HRP多肽的量的比較，如后述的實(shí)施例所示，例 如，可使用西方墨點(diǎn)法、檢測四甲基聯(lián)苯胺引起的顯色（測定波長450nm下的吸光度）、測定 愈創(chuàng)木酚氧化活性等公知的方法來進(jìn)行。
[0107] 此外，經(jīng)修飾的密碼子數(shù)優(yōu)選為至少2個(gè)（例如，3個(gè)以上、5個(gè)以上），更優(yōu)選為10 個(gè)以上（例如，20個(gè)以上、30個(gè)以上、50個(gè)以上），進(jìn)一步優(yōu)選為100個(gè)以上（例如，120個(gè) 以上、150個(gè)以上、180個(gè)以上），特別優(yōu)選為200個(gè)以上（例如，210個(gè)以上、220個(gè)以上、230 個(gè)以上、240個(gè)以上）。此外，在本發(fā)明中，在具有所述野生型堿基序列的多核苷酸中的全部 密碼子中，被修飾的密碼子比例優(yōu)選為至少10%，更優(yōu)選為30%以上，特別優(yōu)選為60%以 上（例如，70%以上、80%以上、90%以上、100%)。另夕卜，在序列編號：1中記載的堿基序列 的編碼區(qū)中，338個(gè)密碼子中的246個(gè)密碼子（72.8%)被修飾（退化變異的導(dǎo)入）。此外， 在序列編號：26中記載的堿基序列的編碼區(qū)中，338個(gè)密碼子中的245個(gè)密碼子（72. 5% ) 被修飾（退化變異的導(dǎo)入）。
[0108] 本發(fā)明中，絲狀菌是指由菌絲構(gòu)成的真菌，可列舉例如，木霉（Trichoderma)屬 菌、曲霉（Aspergillus)屬菌、枝頂孢（Acremonium)屬菌，鐮孢（Fusarium)屬菌、自毀絲 霉（Myceliopthora)屬菌、鏈抱霉（Neurospora)屬菌、青霉（Penicillium)屬菌、毛霉 (Rhizomucor)屬菌、嗜熱真菌（Thermomyces)屬菌、梭孢殼（Thielavia)屬菌、多孔木霉 (TolypoCladium)屬菌。
[0109] 另外，更具體地，作為木霉屬菌，可列舉綠色木霉（Trichoderma viride)、哈茨木 霉（Trichoderma harzianum)、康寧木霉（Trichoderma koningii)、長枝木霉（Tricoderma longibrachiatum)、里氏木霉（Trichoderma reesei)。此外，作為曲霉屬菌，可列舉黑 曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉（Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉（Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans)、米曲 霉（Aspergillus oryzae)。這些中優(yōu)選木霉屬菌及曲霉屬菌，更優(yōu)選綠色木霉及黑曲霉。
[0110] 在本發(fā)明中，在該絲狀菌中，"能夠使編碼的多肽表達(dá)"是指通過導(dǎo)入至少1個(gè)密碼 子中具有與編碼HRP多肽的野生型堿基序列不同的堿基序列且被修飾的多核苷酸、從而將 絲狀菌形質(zhì)轉(zhuǎn)換，將該絲狀菌進(jìn)行培養(yǎng)，在該形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的濃度稀釋為9 X IO8CFUAiL的培 養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的HRP的濃度為0. 001mg/L以上，優(yōu)選為lmg/L以上，更優(yōu)選為10mg/L以 上，進(jìn)一步優(yōu)選為l〇〇mg/L以上，特別優(yōu)選為300mg/L以上。
[0111] 如后述的實(shí)施例所示，考量在腐質(zhì)霉、曲霉及木霉3種菌中的密碼子使用頻率，算 出后面示出的表1中記載的密碼子使用頻率。然后，使野生型HRP多核苷酸密碼子的出現(xiàn) 頻率符合于所得的密碼子使用頻率，并將野生型HRP多核苷酸堿基序列（序列編號：3中 記載的堿基序列），改變?yōu)樾蛄芯幪枺?中記載的堿基序列或序列編號：26中記載的堿基序 列。然后，使用這樣調(diào)制的密碼子修飾HRP多核苷酸，將絲狀菌進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)換后，使用野生 型HRP多核苷酸，對于之前不能確認(rèn)表達(dá)的HRP多肽，也能夠檢測出其表達(dá)。
[0112] 因此，本發(fā)明的多核苷酸為密碼子的使用頻率為下述百分比的被修飾的編碼HRP 多肽的多核苷酸。
[0113] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為丙氨酸時(shí)，GCC的使用頻率為80%，GCT的使用頻 率為20!% ;
[0114] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為精氨酸時(shí)，CGC的使用頻率為90%，CGT的使用頻 率為10% ;
[0115] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為天冬酰胺時(shí)，AAC的使用頻率為100% ;
[0116] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為天冬氨酸時(shí)，GAC的使用頻率為95%，GAT的使用 頻率為5% ;
[0117] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為半胱氨酸時(shí)，TGC的使用頻率為100% ;
[0118] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為谷氨酰胺時(shí)，CAG的使用頻率為100% ;
[0119] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為谷氨酸時(shí)，GAG的使用頻率為100% ;
[0120] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為甘氨酸時(shí)，GGC的使用頻率為75%，GGT的使用頻 率為25% ;
[0121] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為組氨酸時(shí)，CAC的使用頻率為100% ;
[0122] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為異亮氨酸時(shí)，ATC的使用頻率為100% ;
[0123] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為亮氨酸時(shí)，CTC的使用頻率為80%，CTG的使用頻 率為20!% ;
[0124] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為賴氨酸時(shí)，AAG的使用頻率為100% ;
[0125] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為苯丙氨酸時(shí)，TTC的使用頻率為100% ;
[0126] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為脯氨酸時(shí)，CCC的使用頻率為80%，CCT的使用頻 率為20!% ;
[0127] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為絲氨酸時(shí)，AGC的使用頻率為15%，TCC的使用頻 率為85% ;
[0128] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為蘇氨酸時(shí)，ACC的使用頻率為85%，ACG的使用頻 率為15% ;
[0129] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為酪氨酸時(shí)，TAC的使用頻率為100% ;
[0130] 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為纈氨酸時(shí)，GTC的使用頻率為85%，GTG的使用頻 率為5%，GTT的使用頻率為10%。
[0131] 在本發(fā)明中，"將野生型HRP的堿基序列修飾成為密碼子的使用頻率為所述百分 比"不僅是指與所述百分比的值一致，還包括以2. 5%的范圍符合于所述百分比的值的意 思。例如，是指在經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為絲氨酸時(shí)，為了實(shí)現(xiàn)AGC的使用頻率為 12. 5-17. 5%、TCC的使用頻率為82. 5-87. 5%這樣的適合，在編碼HRP多肽的多核苷酸的堿 基序列中，將編碼絲氨酸的密碼子的使用頻率進(jìn)行修正。此外，在本發(fā)明的多核苷酸中，雖 然使密碼子使用頻率為所述百分比的氨基酸至少有1種即可，但優(yōu)選為至少2種（例如，3 種以上、5種以上、7種以上），進(jìn)一步優(yōu)選為10種以上（例如，12種以上、15種以上、17種 以上），特別優(yōu)選為所述全部18種。
[0132] 如前所述，使用具有被修飾成密碼子使用頻率為所述百分比的堿基序列（序列編 號：1中記載的堿基序列或序列編號：26中記載的堿基序列）的多核苷酸，將絲狀菌進(jìn)行形 質(zhì)轉(zhuǎn)換后，能夠檢測出HRP多肽顯著地高表達(dá)。
[0133] 因此，本發(fā)明提供一種多核苷酸，其編碼來自西洋山葵的過氧化物酶（HRP)Cla多 肽且具有選自下述（i)-(ii)中的至少1個(gè)特征，
[0134] (i)含有序列編號：1中記載的喊基序列的編碼區(qū)
[0135] (ii)與序列編號：1中記載的91-1017位組成的堿基序列具有95%以上的相同 性。
[0136] 此外，本發(fā)明提供一種多核苷酸，其編碼來自西洋山葵的過氧化物酶（HRP)Cla多 肽且具有選自下述（i)-(ii)中的至少1個(gè)特征，
[0137] (i)含有序列編號：26中記載的喊基序列的編碼區(qū)
[0138] (ii)與序列編號：26中記載的91-1017位組成的堿基序列具有95%以上的相同 性。
[0139] 在本發(fā)明中，"序列編號：1中記載的91-1017位組成的堿基序列"及"序列編號：26中記載的91-1017位組成的堿基序列"是指，S卩，進(jìn)行修飾使密碼子使用頻率為所述百分 t匕，且編碼信號序列的堿基序列除外的編碼HRP Cla多肽的堿基序列。
[0140] 此外，關(guān)于堿基序列的"相同性"是指在被比較的序列間，構(gòu)成各個(gè)序列的堿基的 一致程度。本說明書所示的"相同性"的數(shù)值都可以是使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的相同性 檢索程序算出的數(shù)值，例如通過使用FASTA，BLAST, Smith-Waterman等默認(rèn)（default)(初 期設(shè)定）的參數(shù)，能夠輕易地算出。
[0141] 此外，為了 HRP Cla多肽發(fā)揮其活性，不需要信號序列，因此作為本發(fā)明的多核苷 酸，可從HRP多核苷酸中除去編碼信號序列的多核苷酸（相當(dāng)于序列編號：1中記載的1-90 位的堿基序列）。
[0142] 對于本發(fā)明的多核苷酸，只要本領(lǐng)域技術(shù)人員通過使用適當(dāng)?shù)墓姆椒ň湍軌?調(diào)制。例如，如后述的實(shí)施例所示，設(shè)計(jì)至少1個(gè)密碼子中與編碼HRP多肽的野生型堿基 序列不同的堿基序列，基于此堿基序列信息，使用市售的DNA合成機(jī)，能夠化學(xué)性地合成本 發(fā)明的多核苷酸。此外，在野生型HRP多核苷酸中，通過公知的定點(diǎn)誘變（site-directed mutagenesis)法等導(dǎo)入變異（堿基的置換），也能夠調(diào)制本發(fā)明的多核苷酸。
[0143] 如后述的實(shí)施例所示，明確地：通過利用所述密碼子修飾HRP多核苷酸，也能夠使 來自木霉的CBHl (纖維素生物水解酶1)多肽或His-tag多肽融合的HRP多肽在絲狀菌中 表達(dá)。
[0144] 因此，本發(fā)明提供一種多核苷酸，其在所述密碼子修飾HRP多核苷酸中進(jìn)一步附 加編碼所期望的多肽的多核苷酸。
[0145] 在本發(fā)明中，所期望的多肽沒有特別限制，例如，通過附加 HRP多肽作為檢測用的 標(biāo)記，能夠容易地檢測出該期望的多肽。
[0146] 另一方面，在本發(fā)明中，為了純化HRP多肽，可將所期望的多肽附加于該HRP多 肽。作為用于純化該HRP多肽的多肽，例如，可列舉具有基質(zhì)吸附能力的多肽，更具體地，可 列舉纖維二糖水解酶（CBH)、內(nèi)切葡聚糖酶、￠-葡萄糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、白蛋白、抗體、 Fab抗體、scFV抗體、His-標(biāo)記、GST標(biāo)記、MBP標(biāo)記、TAP標(biāo)記、FLAG標(biāo)記、Myc標(biāo)記、HA標(biāo) 記、V5標(biāo)記、17標(biāo)記。
[0147] 作為所述密碼子修飾HRP多核苷酸和編碼所期望的多肽的多核苷酸間的附加方 式，通過附加，這些多肽的可讀框（Reading Frame)不偏離，并翻譯成連續(xù)的融合多肽即可， 也可在密碼子修飾HRP多核苷酸的5'側(cè)及3'側(cè)的其中一側(cè)或兩側(cè)附加編碼所期望的多肽 的多核苷酸。此外，該附加可是直接的也可是間接的。作為間接性的附加，例如，可列舉在 所述密碼子修飾HRP多核苷酸與編碼所期望的多肽的多核苷酸之間嵌入編碼連接多肽的 多核苷酸的方式。作為該連接多肽的長度，通常為1-100個(gè)氨基酸，優(yōu)選為1-50個(gè)氨基酸， 更優(yōu)選為1-30個(gè)氨基酸，特別優(yōu)選為12-18個(gè)氨基酸（例如15個(gè)氨基酸）。
[0148] 〈表達(dá)載體，形質(zhì)轉(zhuǎn)換體〉
[0149] 本發(fā)明提供一種含有所述本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)載體。作為本發(fā)明的表達(dá)載 體，作為自我復(fù)制載體，即，染色體外的獨(dú)立體而存在，其復(fù)制并不依賴于染色體的復(fù)制，例 如，能夠構(gòu)筑基本的質(zhì)粒。此外，本表達(dá)載體被導(dǎo)入到作為宿主的絲狀菌時(shí)，會被鑲嵌到該 絲狀菌的基因組中，其可與被鑲嵌的染色體一起復(fù)制。
[0150] 本發(fā)明的表達(dá)載體，為了導(dǎo)入到絲狀菌中并使HRP等表達(dá)，除了所述本發(fā)明的多 核苷酸以外，也可含有控制其表達(dá)的多核苷酸或用于選擇形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的基因標(biāo)記等。
[0151] 作為控制該表達(dá)的多核苷酸，可列舉啟動子、引導(dǎo)序列及終止子等。啟動子只要 在絲狀菌中顯示出轉(zhuǎn)錄活性即可，而不特別限定，能夠得到控制編碼與作為宿主的絲狀菌 同種或異種或同屬或異屬的任意多肽的基因的表達(dá)的多核苷酸。作為該啟動子，可列舉例 如，a -淀粉酶基因、葡萄糖淀粉酶基因、纖維素生物水解酶基因、甘油醛-3-磷酸去氫酶基 因的啟動子。終止子只要是用于結(jié)束轉(zhuǎn)錄的可被絲狀菌所辨識的序列即可，例如可列舉， TAKA淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、纖維素生物水解酶基因、鄰氨基苯甲酸合成酶、a-葡萄糖苷 酶、trpC基因、胰蛋白酶樣蛋白酶基因的終止子。引導(dǎo)序列只要為能夠?qū)⒔z狀菌的翻譯效 率提高的mRNA的非翻譯區(qū)域即可，例如可列舉，TAKA淀粉酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、glaA基因的 引導(dǎo)序列。
[0152] 此外，作為用于選擇形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的基因標(biāo)記，可根據(jù)形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的選擇方法來適 當(dāng)?shù)剡x擇，例如，可利用編碼抗藥性的基因、補(bǔ)足營養(yǎng)要求性的基因，例如，可列舉尿嘧啶生 物合成基因（pyr4)、硝酸鹽同化基因（niaD)、精氨酸生物合成基因（argB)、乙酰胺酶基因 (amdS)、鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶基因（argB)、草胺膦（phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶基因 (bar)、腐草霉素結(jié)合性基因（WeA)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hygB)、乳清苷_5'_磷酸脫羧 酶基因（pyrG)、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因（sC)、鄰氨基苯甲酸合成酶基因（trpC)、越霉素抗 性基因、潮霉素抗性基因、雙丙氨膦抗性基因、博來霉素抗性基因、短梗霉素抗性基因。
[0153] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過利用公知的基因重組技術(shù)等，適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行該載體的設(shè)計(jì) 及調(diào)制。
[0154] 此外，通過導(dǎo)入這種本發(fā)明的載體，能夠在絲狀菌中產(chǎn)生HRP多肽等。因此，本發(fā) 明提供一種將所述表達(dá)載體導(dǎo)入到絲狀菌而形成的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體。
[0155] 作為該絲狀菌，雖如前所述，但從HRP多肽等的產(chǎn)生量更多的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選木霉 屬菌（特別是綠色木霉）、曲霉屬菌（特別是黑曲霉），更優(yōu)選木霉屬菌，特別優(yōu)選綠色木 霉。
[0156] 作為導(dǎo)入本發(fā)明的載體的方法不特別限定，可使用公知的方法進(jìn)行。作為該公知 的方法，例如，可列舉原生質(zhì)體法、氯化鈣法、電穿孔法、形質(zhì)轉(zhuǎn)換受容法、熱休克法、原生質(zhì) 球法、乙酸鋰法。此外，如后述的實(shí)施例所示，也可用將含有本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)載體及 含有所述基因標(biāo)記的載體同時(shí)導(dǎo)入的所謂的共轉(zhuǎn)型法。
[0157] 〈HRP多肽等的制造方法、HRP多肽等、含有HRP多肽等的制劑〉
[0158] 在本發(fā)明中，將所述形質(zhì)轉(zhuǎn)換體進(jìn)行培養(yǎng)，通過從培養(yǎng)的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體和/或該形 質(zhì)轉(zhuǎn)換體的培養(yǎng)物中提取表達(dá)的HRP多肽等，能夠制造編碼本發(fā)明的多核苷酸的多肽。通 過按照通常的方法，適當(dāng)?shù)剡x擇培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等能夠進(jìn)行本發(fā)明的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體培養(yǎng)。
[0159] 本發(fā)明中"培養(yǎng)物"是指含有通過將所述形質(zhì)轉(zhuǎn)換體在對絲狀菌適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中 進(jìn)行培養(yǎng)所得到的增殖的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體、該形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的分泌物及該形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的代謝產(chǎn)物 等的培養(yǎng)基，包括它們的稀釋物、濃縮物。
[0160] 作為該培養(yǎng)基，含有絲狀菌能夠同化的物質(zhì)即可，例如，作為含有物可列舉碳源、 氮源、硫源、無機(jī)鹽類、金屬、蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、酪蛋白水解物、血清等。此外， 在該培養(yǎng)基中，例如，也可以添加對應(yīng)于本發(fā)明的表達(dá)載體所編碼的抗藥性基因的抗生素 或?qū)?yīng)于補(bǔ)足本發(fā)明的表達(dá)載體所編碼的營養(yǎng)要求性的基因的營養(yǎng)物。
[0161] 作為本發(fā)明中該培養(yǎng)的條件，只要是本發(fā)明的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體能夠在所述培養(yǎng)基中分 泌產(chǎn)生HRP多肽等的條件即可，本領(lǐng)域技術(shù)人員可配合絲狀菌種類、使用的培養(yǎng)基等適當(dāng) 地調(diào)整溫度、有無空氣的添加、氧氣的濃度、二氧化碳的濃度、培養(yǎng)基的pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng) 時(shí)間、濕度等來進(jìn)行設(shè)定。
[0162] 此外，作為提取由培養(yǎng)的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體所表達(dá)的HRP多肽等方法，例如，可列舉回收 形質(zhì)轉(zhuǎn)換體（過濾，離心分離等），從回收的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體提?。ニ樘幚恚訅浩扑榈龋?，進(jìn) 一步純化（鹽析法、溶劑沉淀法等）的方法。
[0163] 另外，作為提取由形質(zhì)轉(zhuǎn)換體所表達(dá)的HRP多肽的方法，例如，可列舉用培養(yǎng)物過 濾器（例如，孔徑0.2 以下的過濾器）除去絲狀菌的方法或萃取過濾、離心分離、透析、 濃縮、干燥、冷凍、吸附，脫附、利用對各種溶液的溶解度的差的方法（例如，沉淀、鹽析、結(jié) 晶化、重結(jié)晶、溶解轉(zhuǎn)移、色譜法）等公知的方法。此外，也可單獨(dú)使用該方法或者也可以任 意順序組合或反復(fù)使用。
[0164] 此外，當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸所編碼的多肽含有用于純化所述的HRP的標(biāo)記時(shí)，能 夠使用吸附該標(biāo)記的基質(zhì)進(jìn)行純化。
[0165] 以該制造方法能夠得到HRP多肽、不含信號序列的HRP多肽、或在這些HRP多肽上 附加了所期望的多肽的多肽。因此，本發(fā)明提供這些HRP多肽等。
[0166] 此外，在從西洋山葵中提取的HRP Cla多肽中，由于糖鏈被附加約IOkDa左右，在 用SDS-PAGE等進(jìn)行的分析中，作為約40kDa的分子量的多肽被檢測出。另一方面，如后述 的實(shí)施例所示，通過本發(fā)明的制造方法所得的HRP Cla多肽，在用SDS-PAGE等進(jìn)行的分析 中，作為約32kDa的分子量的多肽被檢測出。另外，雖然沒在后述的實(shí)施例中示出，但是明 確地：從西洋山葵中所提取的HRP Cla多肽雖然不能用糖苷酶F切斷糖鏈，但是本
【發(fā)明者】發(fā) 現(xiàn)以本發(fā)明的制造方法所得的HRP Cla多肽的糖鏈可被該酶切斷，由此發(fā)現(xiàn)，雖然從西洋山 葵中提取的HRP Cla多肽的糖鏈中附加 a 1，3-鍵核巖藻糖殘基，但通過本發(fā)明的制造方法 所得的HRP Cla多肽的糖鏈中并沒有附加 a 1，3-鍵核巖藻糖殘基。
[0167] 因此，通過本發(fā)明的制造方法所得的HRP多肽等，由于實(shí)施了與在西洋山葵中所 產(chǎn)生的HRP多肽不同的糖鏈修飾，因此作為本發(fā)明的多肽，可以是以本發(fā)明的制造方法制 造的去除糖鏈的多肽?？墒褂脤⑻擎湻纸馊コ拿竵磉M(jìn)行糖鏈的去除。作為該酶，例如，可 列舉糖苷酶F (糖肽酶F)、內(nèi)切糖苷酶H。
[0168] 另外，本發(fā)明還提供一種含有以所述制造方法制造的HRP多肽等的制劑。作為本 發(fā)明的制劑，只要含有以所述制造方法制造的HRP多肽等即可，但除了本發(fā)明的HRP多肽等 以外，也可含有被允許作為HRP多肽等的制劑的其他成分。作為這種其他成分，例如，可列 舉載體、賦形劑、崩解劑、緩沖劑、乳化劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、保存劑、防腐劑、生理食鹽。作為 賦形劑可以使用乳糖、淀粉、山梨醇、D-甘露醇，白糖等。作為崩解劑可以使用淀粉、羧甲基 纖維素、碳酸鈣等。作為緩沖劑可以使用磷酸鹽、檸檬酸鹽，乙酸鹽等。作為乳化劑可以使 用阿拉伯膠、海藻酸鈉、黃蓍膠等。作為懸浮劑可以使用單硬脂酸甘油酯、單硬脂酸鋁、甲基 纖維素、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、十二烷基硫酸鈉等。作為穩(wěn)定劑可以使用丙二醇、二 亞乙基亞硫酸鹽、抗壞血酸等。作為保存劑可以使用酚、苯扎氯銨、苯甲醇、氯丁醇、尼泊金 甲酯等。作為防腐劑可以使用疊氮化鈉、苯扎氯銨、對羥基苯甲酸、氯丁醇等。
[0169] 〈HRP多肽等的使用方法〉
[0170] 已知的是通過使HRP多肽作為催化劑起作用，魯米諾或TMB(四甲基聯(lián)苯胺）等發(fā) 光、顯色基質(zhì)被氧化，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光或顯色。此外，通過使HRP多肽與目標(biāo)分子結(jié)合，以所述 化學(xué)發(fā)光等作為指標(biāo)能夠檢測出該目標(biāo)分子。因此，本發(fā)明提供一種方法，其是用于檢測出 目標(biāo)分子的方法，其特征在于：使通過本發(fā)明的制造方法所制造的多肽（本發(fā)明的多肽）結(jié) 合于所述目標(biāo)分子。
[0171] 作為通過本發(fā)明的方法檢測出的目標(biāo)分子無特別限制，例如，可列舉多肽、核酸、 糖、脂質(zhì)。
[0172] 在用于檢測本發(fā)明的目標(biāo)分子的方法中，為了使本發(fā)明的多肽與目標(biāo)分子結(jié)合， 在本發(fā)明的多肽中，優(yōu)選附加與該目標(biāo)分子特異性結(jié)合的分子（例如抗體）。此外，也適當(dāng) 地使用附加與該分子特異性結(jié)合的分子（該分子為抗體時(shí)，為識別該抗體的所謂的2次抗 體、蛋白A、蛋白G等）的本發(fā)明的多肽。
[0173] 作為該附加無特別限制，可以是在基因水平的附加，也可以是化學(xué)性的附加。如前 所述，基因水平的附加，可通過作為本發(fā)明的多核苷酸使用附加編碼所述抗體等的多核苷 酸的密碼子修飾HRP多核苷酸來實(shí)現(xiàn)。此外，化學(xué)性的附加可以是共價(jià)鍵，也可以是非共價(jià) 鍵。作為"共價(jià)鍵"無特別限制，例如，可列舉氨基與羧基的酰胺鍵、氨基與烷基鹵基的烷氨 基鍵、硫醇彼此之間的-硫鍵、硫醇基與順丁稀-醜亞胺基或燒基齒基的硫醋鍵。作為"非 共價(jià)鍵"，例如，可列舉生物素-卵白素間的鍵。
[0174] 作為用于檢測本發(fā)明的目標(biāo)分子的方法所使用的發(fā)光、顯色基質(zhì)，例如，可列舉魯 米諾、TMB、連苯三酚、愈創(chuàng)木酚、聯(lián)茴香胺。
[0175] 此外，如后述的實(shí)施例所示，用本發(fā)明的多肽能夠在過氧化氫的存在下使胭脂素 等色素脫色。因此，本發(fā)明提供一種方法，其是色素的脫色方法，其特征在于：使通過本發(fā)明 的方法制造的多肽在過氧化氫存在下對該色素進(jìn)行作用。
[0176] 作為通過本發(fā)明的方法而脫色的色素，可列舉例如，胭脂樹紅、橙黃II、茜素紅S、 金蓮橙〇、查爾酮。此外，對于在該色素脫色中的反應(yīng)條件，即，過氧化氫的濃度、溫度、使 HRP多肽與色素混合的體系（例如，緩沖液）的種類及pH等，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠配合需脫 色的色素種類等適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行設(shè)定。
[0177] 另外，通過以HRP多肽作為催化劑而起作用，在酚性化合物中的酚部分被氧化成 苯氧基自由基，且通過該苯氧基自由基自身聚合形成水不溶性的多聚體。然后，已知的是該 多聚體作為沉淀物能夠容易地除去。
[0178] 因此，本發(fā)明還提供一種方法，其是酚性化合物的去除方法，其特征在于使通過本 發(fā)明方法制造的多肽在過氧化氫存在下對該酚性化合物進(jìn)行作用。
[0179] 作為通過本發(fā)明的方法除去的酚性化合物，如前所述，只要是具有被過氧化物酶 氧化的酚部分的化合物即可，不特別限制，例如，可列舉對甲酚、對乙基苯酚、對正丙基苯 酚。此外，在該酚性化合物的去除中的反應(yīng)條件，即，過氧化氫的濃度、溫度、使HRP多肽與 酚性化合物混合的體系（例如，緩沖液）的種類及pH等，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠配合酚性化 合物的種類適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行設(shè)定。
[實(shí)施例]
[0180] 以下，基于實(shí)施例及比較例對本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明，但本發(fā)明不限定于下述 的實(shí)施例。
[0181] (比較例1)
[0182] 野生型來自西洋山葵的過氧化物酶（HRP)在絲狀菌中的表達(dá)研究
[0183] 首先，在下述方法中，使用編碼野生型HRP多肽的野生型堿基序列，將絲狀菌（綠 色木霉）進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)換，研究在所得的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體中HRP多肽的表達(dá)。
[0184] (1)野生型HRP Cla基因的制作
[0185] 作為野生型HRP Cla基因的序列，使用"Eur. J. Biochem.，1988年，173卷，3號， 681-687頁"中記載的堿基序列（序列編號：3中記載的堿基序列），并人工合成野生型HRP 基因。人工合成時(shí)，在起始密碼子的上游的序列中附加限制酶StuI識別位點(diǎn)，在終止密碼 子的下游中附加限制酶XhoI識別位點(diǎn)。然后，通過將合成所得的野生型HRP基因嵌入到用 限制酶SfiI處理的pMA-T中，得到質(zhì)粒"pHRP_Native"。
[0186] (2)野生型HRP表達(dá)質(zhì)粒"pCBl_HRP_Native"的構(gòu)筑
[0187] 用StuI及XhoI將質(zhì)粒"pHRP_Native"切斷，得到約Ikbp的基因片段"HRP_ Native"。另一方面，用StuI及XhoI將質(zhì)粒"pCBl_Eg3X_hphless"（參照國際公開第 2011/021616 號）切斷，回收約 6kbp 的片段。使用 TaKaRa DNA Ligation Kit Mighty Mix (寶酒造公司制）將"HRP_Native "連結(jié)于其上，制作質(zhì)粒"pCBI_HRP_Native "。關(guān)于 酶等反應(yīng)條件，依據(jù)試劑盒中所附的說明書的條件。使用Big Dye Terminator v3.1循環(huán) 測序試劑盒（Cycle Sequencing Kit)(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制）與ABI PRISM基因組分析 儀（Genetic Analyzer)(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制），按照附加的方案（protocol)決定在質(zhì)粒 "pCBl-HRP_NatiVe"中克隆的嵌入DNA片段的序列。以在宿主綠色木霉內(nèi)使用自身的起始 密碼子表達(dá)HRP多肽的方式構(gòu)筑質(zhì)粒"pCBl-HRP_Native"。
[0188] (3)介由質(zhì)粒"pCBl_HRP_Native"進(jìn)行的綠色木霉的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的制作
[0189] 根據(jù)國際公開第2005/056787號記載的方法實(shí)施介由質(zhì)粒"pCBl-HRP_NatiVe"的 綠色木霉的形質(zhì)轉(zhuǎn)換。以2株作為尿嘧啶生物合成基因（pyr4)缺失菌株的綠色木霉菌株作 為宿主，通過使用粗糙脈孢菌（Neurospora crassa)的pyr4基因作為選擇標(biāo)記的共轉(zhuǎn)型法 實(shí)施形質(zhì)轉(zhuǎn)換。將2株綠色木霉菌株在50mL的菌體形成培養(yǎng)基（1 %酵母提取物，1 %麥芽 提取物，2 %聚蛋白胨，2. 5 %葡萄糖，0. 1 %磷酸氫二鉀，0. 05 %七水合硫酸鎂，0. 0001 %尿 苷（pH7. 0))中，在28°C下培養(yǎng)24小時(shí)，以3000rpm離心分離10分鐘，收集菌。用0. 5mol/ L的蔗糖洗凈所得到的菌體，懸浮于經(jīng)棉過濾的原生質(zhì)體化酶溶液中（lmg/mL P -葡萄糖苷 酸酶，0. 3mg/mL幾丁質(zhì)酶，0. 3mg/mL酵母裂解酶，0. 5mol/L鹿糖）。在30°C振蕩60分鐘，使 菌絲進(jìn)行原生質(zhì)體化。將該懸浮液過濾后，以2500rpm離心分離10分鐘，回收原生質(zhì)體，并 用 SUTC 緩沖液（0.5mol/L 鹿糖，10 mmol/L 氯化Hl0mmol/L Tris-鹽酸（pH7.5))洗凈。
[0190] 將該原生質(zhì)體懸浮于100 U L的SUTC緩沖液中，向其中添加7 ii L加入了 7 ii g份量 的質(zhì)粒、〇81-111^_似丨1仰"的0嫩溶液與3111加入了？74基因的0嫩溶液，在冰中靜置5 分鐘。接著加入 400 ii L 的 PEG 溶液（60% PEG4000, lOmmol/L 氯化鈣，lOmmol/L Tris-鹽 酸（pH7. 5))，在冰中靜置20分鐘后，添加 IOmL的SUTC緩沖液，以2500rpm離心分離10分 鐘。使收集的原生質(zhì)體懸浮于ImL的SUTC緩沖液中，在每200 ii L中含有0. 5mol/L蔗糖的 基本培養(yǎng)基中與軟瓊脂重疊，在28°C下培養(yǎng)5天后，將繁殖的菌落再次移植到基本培養(yǎng)基 中，將在此形成的菌落作為形質(zhì)轉(zhuǎn)換體。
[0191] (4) "pCBl-HRP_Native"的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的培養(yǎng)及鑒定
[0192] 導(dǎo)入質(zhì)粒"pCBl-HRP_Native"，選擇在基本培養(yǎng)基中繁殖的菌株，根據(jù)國際公開第 98/11239號記載的方法，在P培養(yǎng)基（1. 0%葡萄糖，4. 0%乳糖，2. 0%大豆柏，1. 0%酵母提 取物，0. 5 %磷酸鉀，0. 2 %硫酸銨，0. 2 %碳酸鈣，0. 03 %硫酸鎂）中，使用燒瓶，在28 °C下培 養(yǎng)。然后，為了確認(rèn)HRP是否表達(dá)，使用12% gel SDS-PAGE mini (TEF⑶公司制）將所得 的培養(yǎng)上清液進(jìn)行電泳分離，在PVDF膜（Millipore公司制）上進(jìn)行點(diǎn)墨。對于點(diǎn)墨后的 PVDF膜，進(jìn)行使用了抗HRP抗體（JIRL公司制，制品編號：123-055-021)的西方墨點(diǎn)法。圖 1示出得到的結(jié)果。
[0193] 由圖1所示的結(jié)果明顯可知：在介由pCBl_HRP_Native的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的培養(yǎng)上清 液中，通過使用了抗HRP抗體的西方墨點(diǎn)法不能檢測出來自HRP的電泳帶。因此，明確了： 使用沒有與編碼HRP多肽的野生型堿基序列有任何差異的堿基序列的多核苷酸，即使將絲 狀菌進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)換，也不能由該形質(zhì)轉(zhuǎn)換體產(chǎn)生HRP。
[0194] (實(shí)施例1)
[0195] 考量腐質(zhì)霉、曲霉及木霉3種絲狀菌密碼子使用頻率并用被修飾的HRP多核苷酸 進(jìn)行的在腐質(zhì)霉中HRP多肽的表達(dá)的研究
[0196] 根據(jù)所述結(jié)果，在絲狀菌中為了使HRP多肽高表達(dá)，考量腐質(zhì)霉、曲霉及木霉3種 絲狀菌的密碼子使用頻率，為了提高在全部這3種中的翻譯效率，而制作具有與野生型HRP 基因的堿基序列不同的堿基序列的被修飾的多核苷酸。然后，首先，使用該多核苷酸，將腐 質(zhì)霉（特異腐質(zhì)霉）進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)換，研究在所得的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體中HRP多肽的表達(dá)。以下示 出這種方法及得到的結(jié)果。
[0197] (1)用于最適于腐質(zhì)霉、曲霉、木霉全部3種的表達(dá)的密碼子表的制作
[0198] 考慮到能夠在腐質(zhì)霉、曲霉、木霉中確認(rèn)表達(dá)的多肽的密碼子使用頻率，為了提高 在全部3種中的翻譯效率，作成表1中記載的密碼子使用頻率表。具體地，在所述3種菌中， 將即使在1種菌中使用頻率也極低（使用頻率不足5%)的密碼子使用頻率設(shè)定為"0%"。 此外，在全部所述3種菌中，對于使用頻率為5%以上的密碼子，通過算出3種或2種菌的 使用頻率的平均值，進(jìn)一步將該平均值改變?yōu)?的倍數(shù)，作成表1中記載的密碼子使用頻率 表。
[0199] [表 1]
[0200]

【權(quán)利要求】
1. 一種多核苷酸，其是在至少一個(gè)密碼子中具有與編碼來自西洋山葵的過氧化物酶多 肽的野生型堿基序列不同的堿基序列且被修飾的多核苷酸，其密碼子的使用頻率為下述百 分比，其在絲狀菌中能夠使編碼的多肽表達(dá)， 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為丙氨酸時(shí)，GCC的使用頻率為80%，GCT的使用頻率為 20% ； 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為精氨酸時(shí)，CGC的使用頻率為90%，CGT的使用頻率為 10% ； 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為天冬酰胺時(shí)，AAC的使用頻率為100% ; 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為天冬氨酸時(shí)，GAC的使用頻率為95 %，GAT的使用頻率 為5% ; 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為半胱氨酸時(shí)，TGC的使用頻率為100% ; 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為谷氨酰胺時(shí)，CAG的使用頻率為100% ; 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為谷氨酸時(shí)，GAG的使用頻率為100% ; 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為甘氨酸時(shí)，GGC的使用頻率為75%，GGT的使用頻率為 25% ； 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為組氨酸時(shí)，CAC的使用頻率為100% ; 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為異亮氨酸時(shí)，ATC的使用頻率為100% ; 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為亮氨酸時(shí)，CTC的使用頻率為80 %，CTG的使用頻率為 20% ； 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為賴氨酸時(shí)，AAG的使用頻率為100% ; 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為苯丙氨酸時(shí)，TTC的使用頻率為100% ; 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為脯氨酸時(shí)，CCC的使用頻率為80%，CCT的使用頻率為 20% ； 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為絲氨酸時(shí)，AGC的使用頻率為15%，TCC的使用頻率為 85% ； 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為蘇氨酸時(shí)，ACC的使用頻率為85 %，ACG的使用頻率為 15% ； 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為酪氨酸時(shí)，TAC的使用頻率為100% ; 經(jīng)修飾的密碼子編碼的氨基酸為纈氨酸時(shí)，GTC的使用頻率為85%，GTG的使用頻率為 5%，GTT的使用頻率為10%。
2. 權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中至少2個(gè)密碼子被修飾。
3. 權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸，其中至少10%的密碼子被修飾。
4. 權(quán)利要求1-3項(xiàng)中任意一項(xiàng)所述的多核苷酸，其編碼來自西洋山葵的過氧化物酶 Cla多肽且具有選自下述（i)-(ii)中的至少1個(gè)特征， (i) 含有序列編號：1中記載的喊基序列的編碼區(qū) (ii) 與序列編號：1中記載的91-1017位組成的堿基序列有95%以上的相同性。
5. 權(quán)利要求1-3項(xiàng)中任意一項(xiàng)所述的多核苷酸，其編碼來自西洋山葵的過氧化物酶 Cla多肽且具有選自下述（i)-(ii)中的至少1個(gè)特征， (i)含有序列編號：26中記載的堿基序列的編碼區(qū) (ii)與序列編號：26中記載的91-1017位組成的堿基序列有95%以上的相同性。
6. -種多核苷酸，其在權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的多核苷酸中進(jìn)一步附加編碼所 期望的多肽的多核苷酸。
7. -種表達(dá)載體，其含有權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的多核苷酸。
8. 形質(zhì)轉(zhuǎn)換體，其通過將權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體導(dǎo)入到絲狀菌中而形成。
9. 權(quán)利要求8所述的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體，其中所述絲狀菌為木霉屬菌或曲霉屬菌。
10. 權(quán)利要求8所述的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體，其中所述絲狀菌為綠色木霉或黑曲霉。
11. 權(quán)利要求8所述的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體，其中所述絲狀菌為綠色木霉。
12. -種多肽的制造方法，該多肽由權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的多核苷酸編碼，該 制造方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求8-11中任意一項(xiàng)所述的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體，從培養(yǎng)的形質(zhì)轉(zhuǎn)換體和/ 或該形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的培養(yǎng)物中提取表達(dá)的多肽的步驟。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12的方法制造的多肽。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12的方法制造的、糖鏈被去除的多肽。
15. -種制劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求12的方法制造的多肽。
16. -種用于檢測目標(biāo)分子的方法，其特征在于使根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法制造的 多肽結(jié)合于所述目標(biāo)分子。
17. -種色素的脫色方法，其特征在于使根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法制造的多肽在過 氧化氫存在下對該色素作用。
18. -種是酚性化合物的去除方法，其特征在于使根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法制造的 多肽在過氧化氫存在下對該酚性化合物作用。
【文檔編號】C12N1/15GK104334723SQ201380029041
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2013年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月31日
【發(fā)明者】橫山史和, 岡倉薰, 井上敦, 村島弘一郎, 永里敏秋, 矢內(nèi)耕二, 中根公隆 申請人:明治制果藥業(yè)株式會社