專利名稱：給予體外部分成熟的樹突細(xì)胞治療腫瘤的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求于2002年12月6日申請(qǐng)的美國臨時(shí)申請(qǐng)60/431,267的優(yōu)先權(quán)，此處引入其全部?jī)?nèi)容作為參考。
背景技術(shù)：
樹突細(xì)胞(DCs)被認(rèn)為是腫瘤主動(dòng)免疫療法的首選載體。動(dòng)物試驗(yàn)表明，基于DC的免疫療法具有保護(hù)小鼠免于生成腫瘤和消除已形成腫瘤的潛力。這種成功至少部分地重現(xiàn)于小規(guī)模的人體臨床試驗(yàn)中。從小規(guī)模的安全性或理論驗(yàn)證試驗(yàn)，向闡明活性或有效性的大規(guī)模試驗(yàn)的過渡，由于DC制備的艱巨和繁重而停滯不前(見下文)。因此，盡管這種產(chǎn)品具有很大的治療潛在性，很少有公司對(duì)開發(fā)基于DC的腫瘤疫苗感興趣。
腫瘤內(nèi)(IT)注射DCs是一種特殊形式的基于DC的免疫療法。注射后，DCs從凋亡或垂死的腫瘤細(xì)胞中攝取抗原，并遷移到淋巴結(jié)將抗原提呈給T細(xì)胞。實(shí)際上在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)這種治療的有效性與腫瘤的凋亡程度相關(guān)(Candido等人，Cancer Res.61228-236，2001)，其表明這種方法與注射DCs前采用化學(xué)療法或放射療法治療腫瘤完全相容。此外，已有好幾個(gè)小組證明，這種聯(lián)合治療對(duì)已經(jīng)形成的腫瘤特別有效(Nikitina等人，Int.J.Cancer 94825-833，2001；Tanaka等人，Int.J.Cancer 101265-269，2002；Tong等人，CancerRes.617530-7535，2001)。
由于腫瘤細(xì)胞是抗原的來源，在腫瘤內(nèi)注射前需要選擇和制備腫瘤抗原，就像目前它們?cè)诖蠖鄶?shù)體外基于DC治療的方法中應(yīng)用的那樣。腫瘤抗原的選擇常常受公司對(duì)專有地位的要求所驅(qū)動(dòng)，而迄今為止已鑒別的少數(shù)腫瘤抗原是否能提供顯著的臨床療效還有待證明。此外，使用這種腫瘤抗原通常產(chǎn)生單價(jià)疫苗，如果腫瘤細(xì)胞下調(diào)免疫抗原的表達(dá)水平，單價(jià)疫苗可能會(huì)失去其效力。當(dāng)然，在符合優(yōu)良制造規(guī)范(GMP)要求的條件下制造腫瘤抗原的要求在傳統(tǒng)的基于DC免疫方法上增加了額外的費(fèi)用。
DCs的腫瘤內(nèi)注射使樹突細(xì)胞處于免疫抑制的腫瘤環(huán)境中。已知腫瘤產(chǎn)生細(xì)胞因子，其滅活DCs或能夠使T細(xì)胞反應(yīng)偏向效應(yīng)較小的Th2-型反應(yīng)。幾個(gè)研究小組使用遺傳修飾的DCs，以期克服這些抑制性影響，具體是通過產(chǎn)生細(xì)胞因子白介素12(IL-12；Nishioka等人，CancerRes.594035-4041，1999；Melero等，Gene Therapy 61779-1784，1999)或表達(dá)CD40配基(Kikuchi等人，Blood 9691-99，2000)。這些小組描述的結(jié)果令人鼓舞，進(jìn)一步表明了腫瘤內(nèi)注射DCs作為一種治療方法的可行性。
Triozzi等人(Cancer 892647-2654，2000)描述了轉(zhuǎn)移性黑色素瘤或乳腺癌患者的DCs IT注射。他們?cè)?名黑色素瘤患者和2名乳癌患者中獲得了腫瘤消退的結(jié)果。消退病灶活組織檢查顯示浸潤(rùn)的T細(xì)胞，表明DC實(shí)際已經(jīng)激活了針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)。所有這些數(shù)據(jù)表明人體腫瘤內(nèi)注射DCs是可行的，可以提供顯著的臨床療效。然而，已觀察到MHC II類抗原和B7-2共刺激分子對(duì)注射的DCs有明顯的下調(diào)。這些關(guān)鍵性分子的下調(diào)將會(huì)降低DCs的免疫刺激潛力，但如本發(fā)明所提供的，這可以通過給藥前DCs的部分成熟而避免。
DCs以未成熟形式存在于外周組織中，準(zhǔn)備攝取和加工抗原。正是這些未成熟細(xì)胞，在GM-CSF和IL-4存在時(shí)，被單核細(xì)胞所產(chǎn)生的DCs最接近地模擬。多種刺激可啟動(dòng)DCs的成熟，成熟過程中細(xì)胞失去其有效攝取抗原的能力，而獲得其T細(xì)胞刺激功能。這一過程是復(fù)雜的，至少在體外要持續(xù)48小時(shí)才能完成。成熟的另一個(gè)結(jié)果是細(xì)胞遷移性質(zhì)方面發(fā)生變化。例如，成熟誘導(dǎo)若干趨化因子受體，包括CCR7，CCR7引導(dǎo)細(xì)胞至流向淋巴結(jié)的T細(xì)胞區(qū)域，在該區(qū)域內(nèi)成熟的DCs激活T細(xì)胞，抵抗I類和II類MHC分子提呈至DC表面的抗原。
誘導(dǎo)耐受性與DCs交叉提呈的(自身)抗原有關(guān)(Kurts等人，J.Exp.Med.186239-245，1997)，現(xiàn)在主要的假說假定未成熟DC不斷把抗原提呈給免疫系統(tǒng)，以維持耐受性(Kurts等人，J.Exp.Med.184923-930，1996)，認(rèn)為需要體內(nèi)成熟DCs以產(chǎn)生有效的免疫刺激?，F(xiàn)已明確DC成熟可能產(chǎn)生免疫刺激或免疫抑制性DCs(Chakraborty等人，Clin.Immunol.9488-98，1999)?，F(xiàn)今尚未闡明導(dǎo)致兩種結(jié)果中任何一種的成熟刺激物的確切性質(zhì)，但普遍接受免疫刺激DCs產(chǎn)生IL-12并表達(dá)CD40配基(Albert等人，Nature Immunol.2988-989，2001；Lanzavecchia，Haematologica 84 Suppl.EHA 423-25，1999)。因此，部分成熟的DC應(yīng)可用于IT注射，特別是當(dāng)已知使未成熟樹突狀細(xì)胞成熟的刺激物可導(dǎo)致CD40配基表達(dá)和IL-12的產(chǎn)生時(shí)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種方法，用于產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答，包括給予含有已經(jīng)體外部分成熟的樹突細(xì)胞的細(xì)胞群體，以使個(gè)體在給藥后，部分成熟的樹突細(xì)胞保留攝取腫瘤抗原的能力并能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。盡管腫瘤內(nèi)整體的免疫抑制環(huán)境，本方法允許在腫瘤和腫瘤基床(bed)內(nèi)對(duì)腫瘤抗原的有效攝取和加工。由于對(duì)樹突細(xì)胞免疫刺激性的負(fù)面影響，這種免疫抑制環(huán)境會(huì)妨礙樹突細(xì)胞的功能。而且，不能給予腫瘤成熟的樹突細(xì)胞，因?yàn)樵摷?xì)胞不能有效地加工抗原。
部分成熟的樹突細(xì)胞可直接給藥至已存在的腫瘤內(nèi)。而且，可給藥至腫瘤基床、腫瘤內(nèi)部和周圍的組織區(qū)域，可在治療即外科手術(shù)除去或切除腫瘤之前或之后進(jìn)行，在化療、放療或其組合治療之前、同時(shí)或之后進(jìn)行，等等。部分成熟的樹突細(xì)胞還可以給藥至直接流向腫瘤或腫瘤周圍區(qū)域的淋巴結(jié)或淋巴區(qū)域。此外，部分成熟的樹突細(xì)胞可給藥至直接為腫瘤或腫瘤基床或腫瘤侵襲器官或具有腫瘤的器官輸送血液或淋巴液的循環(huán)血管或淋巴區(qū)域內(nèi)。更進(jìn)一步，部分成熟的樹突細(xì)胞通?？山o藥至循環(huán)或淋巴系統(tǒng)，以便細(xì)胞能被運(yùn)送到腫瘤區(qū)域。
本發(fā)明可用的樹突細(xì)胞或其前體，可從例如皮膚、脾臟、骨髓、胸腺、淋巴結(jié)、臍帶血或外周血等中獲得。此外，樹突細(xì)胞可從待治療個(gè)體或與待治療個(gè)體HLA相匹配的健康個(gè)體獲得。在與成熟劑接觸并配制成用于個(gè)體給藥的組合物之前，樹突細(xì)胞或其前體可以冷凍保存。
用于本發(fā)明方法的樹突細(xì)胞是在體外部分成熟的。用于誘導(dǎo)樹突細(xì)胞成熟的適當(dāng)試劑包括，例如但不限于，卡介苗(BCG)、干擾素γ(IFNγ)、脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子α(TNFα)；咪唑并喹啉化合物，例如咪唑并喹啉-4-胺化合物，如4-氨基-2-乙氧基甲基-α，α-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]-1-乙醇(命名為R848)或1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺，及其衍生物(WO00/47719，此處全部引用作為參考)，合成的雙鏈多核糖核苷酸，例如聚[I]聚[C(12)U]，等等；Toll-樣受體(TLR)激動(dòng)劑，例如TLR-3，TLR-4，TLR-7和/或TLR-9；含有已知誘導(dǎo)DC成熟的非甲基化CpG基序的核酸序列等，或其組合。
用于本發(fā)明的BCG可包括完整BCG，BCG細(xì)胞壁成分，BCG-來源的lipoarabidomannans，或BCG任何其它組分。在某些實(shí)施方案中，BCG為熱滅活BCG或福爾馬林處理BCG。雖然作為選擇BCG可單獨(dú)使用，但一般BCG和IFNγ聯(lián)合使用來誘導(dǎo)樹突細(xì)胞的部分成熟。BCG的有效量一般每毫升組織培養(yǎng)基約為105-107cfu，IFNγ的有效量一般每毫升組織培養(yǎng)基約為100-1000單位。在另一個(gè)實(shí)施方案中樹突細(xì)胞活化劑為咪唑并喹啉R898。TLR-4激動(dòng)劑R898的有效劑量通常使用大約1-50μg/ml，更常用每毫升組織培養(yǎng)基為5-10μg?？蓡为?dú)使用咪唑并喹啉，也可將其與例如有效量的BCG和/或IFNγ聯(lián)合使用。
本發(fā)明還包括組合物，該復(fù)合物包含，在樹突細(xì)胞成熟劑存在條件下體外部分成熟的樹突細(xì)胞，與之結(jié)合的生理可接受的載體、緩沖液和/或賦形劑，用于患腫瘤個(gè)體給藥。本發(fā)明中組合物所用的部分成熟樹突細(xì)胞通常上調(diào)共刺激分子例如，但不限于CD80、CD86或CD54的表達(dá)。所述細(xì)胞可表達(dá)或不表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)志CD83，但仍能攝取和加工抗原。所述組合物通常包括約102-1010，也可包括更多部分成熟的樹突細(xì)胞。給藥個(gè)體前，樹突細(xì)胞部分成熟后可冷凍保存一段時(shí)間?？蓮哪[瘤患者體內(nèi)分離細(xì)胞，用于制備本發(fā)明組合物包含的部分成熟樹突狀細(xì)胞，或從與患者HLA相匹配的個(gè)體分離細(xì)胞，用于制備部分成熟的樹突細(xì)胞。
發(fā)明詳述樹突細(xì)胞是在多種淋巴和非-淋巴組織中發(fā)現(xiàn)的多種抗原提呈細(xì)胞。(見Liu，Cell，106259-62(2001)；Steinman，Ann.Rev.Immunol.9271-96(1991))。樹突細(xì)胞包括脾淋巴樹突細(xì)胞、表皮郎格罕氏細(xì)胞以及血液循環(huán)中的遮蔽(veiled)細(xì)胞?？偲饋碚f，根據(jù)其形態(tài)、表面II類MHC的高水平表達(dá)和缺少某些其它T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞表達(dá)的表面標(biāo)志來劃分樹突細(xì)胞群。具體而言，單核細(xì)胞-來源的樹突細(xì)胞(也稱為單核細(xì)胞樹突細(xì)胞)通常表達(dá)CD11c、CD80、CD86，為HLA-DR+，但為CD14-。
相反，單核細(xì)胞樹突細(xì)胞的前體(一般為單核細(xì)胞)通常為CD14+。單核細(xì)胞樹突細(xì)胞的前體可從任何存在它們的組織，具體而言淋巴組織，例如脾、骨髓、淋巴結(jié)和胸腺中獲得。單核細(xì)胞樹突細(xì)胞的前體也可從循環(huán)系統(tǒng)中分離。外周血也是單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體的易得來源。臍帶血是單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體的另一個(gè)來源。可從多種有機(jī)體中分離單核細(xì)胞樹突細(xì)胞的前體，其中有機(jī)體內(nèi)的免疫應(yīng)答是可引發(fā)的。這類有機(jī)體包括動(dòng)物，例如包括人類和非人類動(dòng)物，例如靈長(zhǎng)類動(dòng)物、哺乳動(dòng)物(包括犬、貓、小鼠和大鼠)、鳥類(包括雞)以及其轉(zhuǎn)基因物種。
在某些實(shí)施方案中，可從健康受試者或需要免疫刺激的受試者體內(nèi)，分離單核細(xì)胞樹突細(xì)胞的前體和/或未成熟的樹突細(xì)胞，例如如腫瘤患者或可能受益于或需要細(xì)胞免疫刺激的其它受試者(即細(xì)菌或病毒感染等等的受試者)。樹突細(xì)胞前體和/或未成熟的樹突細(xì)胞也可從HLA-匹配的健康個(gè)體獲得，用于部分活化和給藥至需要免疫刺激的HLA-匹配受試者。
樹突細(xì)胞前體和未成熟的樹突細(xì)胞本領(lǐng)域已知從多種來源包括血液和骨髓中分離富含樹突細(xì)胞前體和未成熟樹突細(xì)胞的細(xì)胞群體的方法。例如，可通過收集肝素抗凝血液、單采血液成分術(shù)或白細(xì)胞除去法、制備血沉棕黃層、形成玫瑰花結(jié)、離心、密度梯度離心(例如使用Ficoll(例如FICOLL-PAQUE)、PERCOLL(膠體硅粒子(直徑15-30nm)包被非解析聚乙烯吡咯烷酮(PVP))、蔗糖等)、細(xì)胞差速裂解、過濾等，分離樹突細(xì)胞前體和未成熟樹突細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，可通過例如收集受試者血液，去纖維蛋白原以除去血小板并裂解紅細(xì)胞，制備白細(xì)胞群。可通過例如PERCOLL梯度離心、抗體淘選(panning)等方法，任選性地對(duì)于單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體而富集樹突細(xì)胞前體和未成熟樹突細(xì)胞。
任選性地可在密閉的無菌體系內(nèi)制備樹突細(xì)胞前體和未成熟樹突細(xì)胞。此處所用術(shù)語″密閉的無菌體系″或″密閉系統(tǒng)″是指減少或消除其暴露于非無菌環(huán)境或循環(huán)空氣或其它非無菌情況。用于分離樹突細(xì)胞前體和未成熟樹突細(xì)胞的密閉系統(tǒng)，通常不包括在頂部開口試管中的密度梯度離心、室外細(xì)胞轉(zhuǎn)移、在組織培養(yǎng)平板或未密封搖瓶中細(xì)胞的培養(yǎng)等等。在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，密閉系統(tǒng)容許在不暴露于非無菌空氣的情況下，將樹突細(xì)胞前體和未成熟樹突細(xì)胞從起始收集器中無菌轉(zhuǎn)移到可密封的組織培養(yǎng)皿內(nèi)。
另一個(gè)報(bào)導(dǎo)用于分離樹突細(xì)胞前體的方法是，采用商品化的處理塑料基質(zhì)(例如小珠或磁性小珠)，選擇性去除附著的單核細(xì)胞及其它″非樹突細(xì)胞前體″(見例如美國專利號(hào)5,994,126和5,851,756)。棄去附著的單核細(xì)胞和非樹突細(xì)胞前體，保留非粘附細(xì)胞，用于體外培養(yǎng)和成熟。在另一方法中，單采血液成分術(shù)的細(xì)胞培養(yǎng)于塑料培養(yǎng)袋中，向其中加入塑料即聚苯乙烯或苯乙烯微載體珠以提高袋子的表面面積。細(xì)胞充分培養(yǎng)一段時(shí)間，至某些細(xì)胞粘附于珠上，而將非粘附細(xì)胞從袋中洗去。(Maffei等人，Transfusion 401419-1420(2000)；WO 02/44338，在此引入作為參考)。
在某些其它實(shí)施方案中，單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體通過與單核細(xì)胞結(jié)合基質(zhì)粘附而分離，如WO 03/010292所述，在此引入其公開內(nèi)容作為參考。例如，白細(xì)胞群(例如通過白細(xì)胞除去法分離的)可與單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體的粘附基質(zhì)接觸。當(dāng)白細(xì)胞群與基質(zhì)接觸時(shí)，白細(xì)胞群體中的單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體優(yōu)先粘附于基質(zhì)上。其它白細(xì)胞(包括其它潛在性樹突細(xì)胞前體)結(jié)合基質(zhì)親合力降低，從而容許單核細(xì)胞的樹突細(xì)胞前體優(yōu)先富集在基質(zhì)表面上。
適當(dāng)?shù)幕|(zhì)包括，例如表面面積與體積之比較大的那些基質(zhì)?；|(zhì)可以是例如微?；蚶w維狀基質(zhì)。適當(dāng)?shù)奈⒘；|(zhì)包括，例如玻璃微粒、塑料微粒、玻璃包被的塑料微粒、玻璃包被的聚苯乙烯微粒及其他適于吸附蛋白質(zhì)的珠粒。適于本發(fā)明使用的纖維狀基質(zhì)包括微毛細(xì)管和微絨毛膜等等。微?；蚶w維狀基質(zhì)通常在基本不降低粘附細(xì)胞存活力的情況下，容許將粘附的單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體洗脫下來。微?；蚶w維狀基質(zhì)可以是基本無孔的，以便從基質(zhì)上洗脫單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體或樹突細(xì)胞。″基本無孔的″基質(zhì)是指至少存在于基質(zhì)中的大部分氣孔比細(xì)胞小，以使基質(zhì)內(nèi)誘捕的細(xì)胞減至最少。
通過加入結(jié)合介質(zhì)，可任選地增強(qiáng)單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體與基質(zhì)的粘附。適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合介質(zhì)包括單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體培養(yǎng)基(例如AIM-V，RPMI 1640，DMEM，X-VIVO 15，等等)，單獨(dú)或以任意組合補(bǔ)充例如細(xì)胞因子(例如粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細(xì)胞介素4(IL-4)，或白細(xì)胞介素13(IL-13))；血漿、血清(例如人血清，如自體的或異源血清)；純化的蛋白質(zhì)，如血清白蛋白；二價(jià)陽離子(例如鈣和/或鎂離子)；以及其它有助于單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體與基質(zhì)特異性粘附的分子，或阻止非單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體與基質(zhì)粘附的分子。在某些實(shí)施方案中，血漿或血清可經(jīng)加熱滅活。加熱滅活的血漿既可以是與白細(xì)胞同體的也可以是異體的。
單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體粘附到基質(zhì)上后，非粘附白細(xì)胞與單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體/基質(zhì)復(fù)合物分開。任何適當(dāng)?shù)姆椒ň捎糜诜钦掣郊?xì)胞與復(fù)合物的分離。例如，可以沉淀非粘附白細(xì)胞和復(fù)合物的混合物，去除或排干非粘附白細(xì)胞和培養(yǎng)基上清液。作為選擇，可以離心混合物，去除或排干包含非粘附白細(xì)胞的上清液，使其與沉淀復(fù)合物分開。
在另一方法中，可從富含白細(xì)胞的細(xì)胞群中分離單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體，其中白細(xì)胞利用切向流過濾裝置制備(如2003年6月19日申請(qǐng)，國際專利號(hào)PCT/US03/19428所述，此處引入作為參考)。用于分離富含單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體的細(xì)胞群體的切向流過濾裝置，可包含具有交互流動(dòng)(cross-flow)室的移除單元、濾液室和位于二者之間的濾器。濾器在一側(cè)截留表面和交互流動(dòng)室進(jìn)行流體交流，在另一側(cè)濾過表面和濾液室進(jìn)行流體交流。交互流動(dòng)室具有入口，適于將包括白細(xì)胞的血液成分樣品導(dǎo)入交互流動(dòng)室，與濾器截留面平行。同時(shí)，交互流動(dòng)室提供出口，居中置于槽內(nèi)正對(duì)著濾器截留表面的部分。適合用于切向流過濾裝置的濾器平均孔徑通常約1-10微米。濾器平均孔徑可為約3-7微米。還可包括以設(shè)定樣品進(jìn)入速率提供進(jìn)入交叉流動(dòng)室入口的裝置，以及控制濾液通過濾器進(jìn)入濾液室的過濾速度的裝置。過濾速度控制裝置限制過濾速度低于濾器的非對(duì)抗過濾速度。包括血液組分在內(nèi)的樣品，可由源裝置例如白細(xì)胞除去法裝置，或含有從白細(xì)胞除去法裝置收集的樣品的容器提供。
單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體和用于前體富集的細(xì)胞群，可離體培養(yǎng)以分化、部分成熟和/或擴(kuò)增。此處所用分離的未成熟樹突細(xì)胞、樹突細(xì)胞前體以及其它細(xì)胞，是指經(jīng)手工處理與其天然環(huán)境分開存在的細(xì)胞，而非天然產(chǎn)物。分離的細(xì)胞可以純化、半純化的形式存在，或處于非天然環(huán)境下。簡(jiǎn)言之，離體分化一般包括在一種或多種分化劑存在的情況下，培養(yǎng)單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體、或具有樹突細(xì)胞前體的細(xì)胞群。適當(dāng)?shù)姆只瘎┛砂?，例如?xì)胞生長(zhǎng)因子(例如細(xì)胞因子如(GM-CSF)、白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素7(IL-7)、白細(xì)胞介素13(IL-13)和/或其組合)。在某些實(shí)施方案中，單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體分化形成單核細(xì)胞來源的未成熟樹突細(xì)胞。
樹突細(xì)胞前體可在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)和分化。適當(dāng)?shù)慕M織培養(yǎng)基包括，但不限于，AIM-V，RPMI 1640，DMEM，X-VIVO15等等?？上蚪M織培養(yǎng)基中補(bǔ)充血清、氨基酸、維生素、細(xì)胞因子如GM-CSF和/或IL-4、IL-7、IL-13、二價(jià)陽離子等等，以促進(jìn)細(xì)胞的分化。在某些實(shí)施方案中，樹突細(xì)胞前體可培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件可任選排除任何動(dòng)物來源的產(chǎn)物。典型的用于樹突細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)胞因子組合包括GM-CSF和IL-4、IL-7或IL-13，每種約500單位/ml。樹突細(xì)胞前體分化形成未成熟的樹突細(xì)胞時(shí)，表型類似于皮膚郎格罕氏細(xì)胞。未成熟的樹突細(xì)胞一般為CD14-和CD11c+，低水平表達(dá)CD86和CD83，并能通過特異的細(xì)胞內(nèi)吞作用俘獲可溶性抗原。
樹突細(xì)胞成熟劑可包括，例如但不限于，BCG、IFNγ、LPS、TNFα、咪唑并喹啉化合物，例如咪唑并喹啉-4-胺化合物如4-氨基-2-乙氧基甲基-α，α-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇(稱為R848)或1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺，以及它們的衍生物(WO00/47719，此處引入作為參考)；合成的雙鏈多核糖核苷酸，例如聚[I]聚[C(12)U]等；Toll-樣受體(TLR)激動(dòng)劑，如TLR-3、TLR-4、TLR-7和/或TLR-9；包含已知誘導(dǎo)DC成熟的未甲基化CpG基序的核酸序列等，或其任意組合。BCG有效劑量一般為每毫升組織培養(yǎng)基大約105-107cfu。IFNγ有效劑量一般為每毫升組織培養(yǎng)基約100-1000U?？ń槊?BCG)為M.bovis的無毒株。用于此處的BCG指完整BCG以及細(xì)胞壁組分、BCG來源的lipoarabidomannans以及其它BCG組分。BCG任選是滅活的，例如加熱滅活BCG、福爾馬林處理BCG等。咪唑并喹啉化合物例如咪唑并喹啉-4-胺化合物，如4-氨基-2-乙氧基甲基-α，α-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇(稱為R848)的使用有效劑量為每毫升培養(yǎng)基約1-50μg，更典型地，每毫升培養(yǎng)基使用大約5-10μg。咪唑并喹啉化合物可單獨(dú)使用，或與例如BCG和/或IFNγ或其它TLR激動(dòng)劑組合使用。
一般未成熟DCs與有效劑量的樹突細(xì)胞成熟劑，例如BCG和IFNγ作用大約1-10小時(shí)。完全成熟一般至少需要溫育24小時(shí)，更典型地溫育大約48-72小時(shí)。未成熟的樹突細(xì)胞可在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)和部分成熟。適當(dāng)?shù)慕M織培養(yǎng)基包括AIM-V、RPMI 1640、DMEM、X-VIVO15等等?？上蚪M織培養(yǎng)基中補(bǔ)充氨基酸、維生素、細(xì)胞因子如GM-CSF和/或IL-15、二價(jià)陽離子等，以促進(jìn)細(xì)胞的成熟。典型的細(xì)胞因子組合為500單位/ml的GM-CSF和100ng/ml的IL-15。
可采用本領(lǐng)域針對(duì)樹突細(xì)胞已知的方法來監(jiān)控未成熟樹突細(xì)胞的部分成熟?？刹捎帽绢I(lǐng)域熟知技術(shù)，如流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)等，來檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物。還可以通過細(xì)胞因子的產(chǎn)生(例如通過ELISA、其它免疫測(cè)定法或利用寡核苷酸陣列方法)來監(jiān)控細(xì)胞。在樹突細(xì)胞成熟劑，例如GM-CSF和IL-4存在情況下，根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)和部分成熟的DCs中，可采用本領(lǐng)域熟知方法測(cè)定磷酸化JAK2(janus激活激酶2)的水平，以指示成熟的啟始。細(xì)胞表面標(biāo)記物和細(xì)胞因子的誘導(dǎo)表達(dá)，以及信號(hào)分子磷酸化作用，例如jak2，也被看作樹突細(xì)胞適于給予個(gè)體以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的指示劑。
未成熟的樹突細(xì)胞僅成熟一段時(shí)間，以使樹突細(xì)胞部分成熟。完全成熟的DCs失去了攝取抗原的能力并上調(diào)共刺激性細(xì)胞表面分子以及多種細(xì)胞因子的表達(dá)。具體而言，成熟DCs MHC I類和II類抗原的表達(dá)水平高于未成熟的樹突細(xì)胞，成熟的樹突細(xì)胞通常鑒定為CD80+、CD83+、CD86-和CD14-。MHC高表達(dá)導(dǎo)致DC表面抗原密度增加，而共刺激分子CD80和CD86的上調(diào)，通過共刺激分子的對(duì)應(yīng)物(counterpart)，例如T細(xì)胞上的CD28，使T細(xì)胞活化信號(hào)得以加強(qiáng)。用于本發(fā)明的部分成熟的樹突細(xì)胞，一般包括曾暴露于樹突細(xì)胞成熟劑，表現(xiàn)出共刺激分子——包括但不限于CD80、CD86和/或CD54的表達(dá)上調(diào)的樹突細(xì)胞。該細(xì)胞可表達(dá)或不表達(dá)CD83，但保持?jǐn)z取和加工抗原的能力。此外，部分成熟的樹突細(xì)胞可產(chǎn)生TNF-α、IL-6、IL-10和/或IL-12，一般未成熟樹突細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生這些分子。
完全成熟的樹突細(xì)胞不是本發(fā)明的優(yōu)選，因?yàn)樗鼈儾荒苡行Ъ庸た乖４送?，用于現(xiàn)有方法中的未成熟樹突細(xì)胞也不是所需的，因?yàn)槟[瘤內(nèi)一般自然形成免疫抑制環(huán)境，包括已知會(huì)防止未成熟樹突細(xì)胞抗原加工的較大濃度的細(xì)胞因子。在本發(fā)明中，部分成熟的未成熟樹突細(xì)胞下調(diào)細(xì)胞表面上的細(xì)胞因子受體，降低它們對(duì)存在于腫瘤內(nèi)部空間的細(xì)胞因子的免疫抑制影響的敏感性或反應(yīng)性，使細(xì)胞可有效加工存在于腫瘤內(nèi)的腫瘤抗原。一旦部分成熟的樹突細(xì)胞在腫瘤內(nèi)成熟，其通過例如TNF-α和IL-12的產(chǎn)生、趨化因子受體CCR7的表達(dá)進(jìn)行確定，細(xì)胞可遷移到淋巴結(jié)處，在那里細(xì)胞將與T細(xì)胞接觸，上調(diào)對(duì)腫瘤抗原的免疫應(yīng)答。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，在成熟之前或部分成熟后給予患者之前，DCs可以保存，例如低溫保存。可以使用的低溫保存劑，包括但不限于，二甲亞砜(DMSO)、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、白蛋白、葡聚糖、蔗糖、乙二醇(ethylene glycol)、i-赤蘚醇、D-核糖醇、D-甘露醇、D-山梨糖醇、i-肌醇、D-乳糖、氯化膽堿、氨基酸、甲醇、乙酰胺、單乙酸甘油酯和無機(jī)鹽?？刂坡倮鋮s是非常關(guān)鍵的。不同的防冷凍劑和不同的細(xì)胞類型一般采用不同的最佳冷卻速率。一般應(yīng)使水結(jié)成冰的融結(jié)(fusion)階段的熱減至最少。冷卻過程可利用，例如可程序控制的冷凍裝置或甲醇浴方法來完成。程序化冷凍裝置容許確定最佳冷卻速率，便于標(biāo)準(zhǔn)化并可以重復(fù)的冷卻。程序化控制速率冷凍器，例如Cryomed或Planar，可以將冷凍方式調(diào)整至所需的冷卻速率曲線。
在徹底冷凍后，單核細(xì)胞前體細(xì)胞、未成熟的DCs或部分成熟的DCs，可迅速轉(zhuǎn)入長(zhǎng)期的低溫保存容器內(nèi)。在一個(gè)典型的實(shí)施方案中，樣品可低溫保存于液氮(-196℃)或其蒸氣(-165℃)內(nèi)。對(duì)于造血干細(xì)胞，具體而言自骨髓或外周血的造血干細(xì)胞，所述原則、操作、冷凍保存和長(zhǎng)期保存，非常適合于本發(fā)明的細(xì)胞。其論述可參見，例如下面的參考文獻(xiàn)，在此引入作為參考Taylor等人，Cryobiology27269-78(1990)；Gorin，Clinics in Haematology 1519-48(1986)；Bone-Marrow Conservation，Culture andTransplantation，Proceedings of a Panel，Moscow，Jul.22-26，1968，International Atomic Energy Agency，Vienna，pp.107-186。
優(yōu)選地，冷凍細(xì)胞迅速解凍(例如保持于37-41℃的水浴中)，解凍后立即冷卻。可能需要處理細(xì)胞以免解凍后細(xì)胞凝集?？墒褂枚喾N方法阻止凝集，包括但不限于，冷凍之前和/或之后加入DNase(Spitzer等Cancer 453075-85(1980))、低分子量葡聚糖和檸檬酸鹽、羥乙基淀粉(Stiff等，Cryobiology 2017-24(1983))，等等。如果防冷凍劑對(duì)人體有毒性，應(yīng)在治療應(yīng)用之前將其從解凍的部分成熟DCs中除去。一種除去防冷凍劑的方法是將其稀釋至極微濃度。冷凍的部分成熟DCs一經(jīng)解凍和恢復(fù)，即可按照本文關(guān)于非冷凍的部分成熟DCs的描述進(jìn)行給藥。
體內(nèi)給予部分成熟的樹突細(xì)胞本發(fā)明提供了給予腫瘤患者部分成熟樹突細(xì)胞或富含這種細(xì)胞的細(xì)胞群體的方法。在某些實(shí)施方案中，通過獲得樹突細(xì)胞前體或未成熟的樹突細(xì)胞，在樹突細(xì)胞成熟劑，例如BCG和IFNγ，或任一其它如上文列舉的成熟劑存在的情況下，分化和部分成熟這些細(xì)胞，來實(shí)現(xiàn)上述方法。部分成熟的樹突細(xì)胞可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法和組合物與生理學(xué)可接受的載體、賦形劑、緩沖液或稀釋劑一起配制。部分成熟的樹突細(xì)胞可直接給與需要免疫刺激的患者。一般大約102-1010的細(xì)胞懸浮于藥物可接受的載體中。細(xì)胞直接注射入腫瘤，或注射入腫瘤或腫瘤基床近旁、鄰近或與腫瘤或腫瘤基床相接觸的循環(huán)或淋巴區(qū)域，以保證細(xì)胞可以接近腫瘤抗原。
例如但不限于，細(xì)胞可直接給藥至腫瘤內(nèi)、在外科手術(shù)除去或切除腫瘤后的腫瘤基床、腫瘤周圍、與腫瘤直接接觸的引流(draining)淋巴結(jié)、流向或供給腫瘤或腫瘤侵襲器官的血管或淋巴管內(nèi)，例如門靜脈或肺靜脈或動(dòng)脈等等。可在其它腫瘤治療，例如化療或放療的同時(shí)或之后，給予本發(fā)明的部分成熟的樹突細(xì)胞。此外，本發(fā)明部分成熟的樹突細(xì)胞可與其它試劑共同給藥，所述試劑起助劑作用，使樹突狀細(xì)胞成熟，和/或?qū)δ[瘤或靠近或鄰近腫瘤區(qū)域內(nèi)的抗原進(jìn)行加工。此外，樹突細(xì)胞還可以配制或混合到緩釋基質(zhì)內(nèi)，植入腫瘤或腫瘤基床內(nèi)部或周圍區(qū)域，以便細(xì)胞緩慢釋放到腫瘤或腫瘤基床內(nèi)部，與腫瘤抗原接觸。
可采用任何適于給藥的劑型和方式給予本發(fā)明部分成熟的樹突細(xì)胞。例如，細(xì)胞可與藥物可接受的載體結(jié)合，可采用注射器、導(dǎo)管、插管等等給藥。如上所述，細(xì)胞可配制于緩釋基質(zhì)內(nèi)。當(dāng)以這種方式給藥時(shí)，制劑可通過適于使用的基質(zhì)的方法給藥。其它適用于本發(fā)明的給藥方法和方式為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
本發(fā)明的組合物可本身用于個(gè)體治療。此外，也可將組合物與任何其它方法組合使用來治療腫瘤。例如，本發(fā)明方法可與腫瘤外科手術(shù)切除術(shù)、化療(細(xì)胞毒性藥物，凋亡試劑，抗體等等)、放射療法、冷凍療法、近距療法、免疫療法(給予抗原特異性成熟的活化樹突細(xì)胞、NK細(xì)胞，腫瘤抗原特異性抗體等)等等組合使用。這些方法中的任一種或全部也可以任意組合使用。組合治療可以同時(shí)或順次進(jìn)行，由治療醫(yī)師所確定的任何順序給藥。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，樹突細(xì)胞與受體受試者具有相同的MHC(HLA)單倍型。確定受試者HLA單倍型的方法為本領(lǐng)域已知。在相關(guān)實(shí)施方案中，部分成熟的樹突細(xì)胞與受體受試者是異體的。異體細(xì)胞一般與至少一個(gè)MHC等位基因相匹配(例如共有至少一個(gè)但并非所有MHC等位基因)。在一個(gè)不太典型的實(shí)施方案中，樹突細(xì)胞和受體受試者彼此完全是異體的，但都至少有一個(gè)共同的MHC等位基因。
實(shí)施例下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的各個(gè)方面，而不應(yīng)以任何方式解釋為對(duì)本發(fā)明的限定。
實(shí)施例1在本實(shí)例中，通過切向流過濾分離的單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體，用補(bǔ)充有2％人血清白蛋白(HSA)和500U/ml GM-CSF的X-VIVO15，在培養(yǎng)瓶或細(xì)胞袋中以濃度為每毫升106的單核細(xì)胞培養(yǎng)。5天后，來自培養(yǎng)瓶和細(xì)胞袋的DCs，或者留下不處理(iDCs)，或者在BCG(1∶400稀釋)和干擾素γ(IFNγ，500U/ml)(pmDCs)存在條件下部分成熟4小時(shí)。收集細(xì)胞，洗滌并與等量放射熒光標(biāo)記的PKH67-A549腫瘤細(xì)胞混合48小時(shí)。孵育后，洗滌細(xì)胞，用藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的CD11c特異性單克隆抗體進(jìn)行染色，并經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析。提供于表1的數(shù)值表示DC內(nèi)的CD11c+細(xì)胞，也即標(biāo)記的PKH67抗原陽性細(xì)胞(MFI＝平均熒光強(qiáng)度)的百分比。對(duì)照包括分析前剛與PKH67-A549細(xì)胞混合的DCs。
表1.
這些數(shù)據(jù)表明，如攝取抗原的細(xì)胞百分比或腫瘤細(xì)胞吸收物質(zhì)的數(shù)值所測(cè)量的，在本實(shí)驗(yàn)中，部分成熟的DCs與未成熟的樹突細(xì)胞相比，在抗原攝取方面更好。
在另一個(gè)實(shí)例中，經(jīng)外科手術(shù)除去生長(zhǎng)腫瘤后，對(duì)患者進(jìn)行了白細(xì)胞除去法。通過切向流過濾從白細(xì)胞除去法產(chǎn)物中純化單核細(xì)胞。純化的單核細(xì)胞如上所述進(jìn)行分化和通過暴露于熱滅活和福爾馬林固定的BCG(5×106cfu/ml)IFNγ(500U/ml)部分成熟。配制用于給藥的部分成熟的樹突細(xì)胞，并在超聲引導(dǎo)下注射入個(gè)體腫瘤基床。體外測(cè)定發(fā)現(xiàn)，從個(gè)體分離的樹突細(xì)胞，能誘導(dǎo)腫瘤異性的細(xì)胞毒T細(xì)胞應(yīng)答。此外，還發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間被阻滯或在很大程度是被推遲。
實(shí)施例2在本實(shí)施例中，采用熟知方法將人結(jié)腸癌細(xì)胞移植給小鼠，使之產(chǎn)生異種移植腫瘤。腫瘤形成后，將動(dòng)物分組，向每組動(dòng)物腫瘤內(nèi)給予安慰劑、未成熟的樹突細(xì)胞或者部分成熟的樹突細(xì)胞。隨后測(cè)定各組腫瘤的大小并進(jìn)行比較。
簡(jiǎn)言之，通過向右肋腹皮下注射100,000個(gè)腫瘤細(xì)胞，在雌性Balb/c小鼠身上生成人CT26結(jié)腸癌腫瘤。治療開始于第15天，此時(shí)所有小鼠均已明顯帶有腫瘤，腫瘤大小為10mm2-45mm2。
按照標(biāo)準(zhǔn)方案從雌性Balb/c小鼠股骨髓制備樹突細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，紅細(xì)胞裂解后的骨髓細(xì)胞與鼠GM-CSF(200U/ml)和IL-4(200U/ml)，在補(bǔ)充有10％胎牛血清的RPMI 1640中孵育13-14天，在第3和第7天后加入含細(xì)胞因子的新鮮培養(yǎng)基。為獲得部分成熟的樹突細(xì)胞，將細(xì)胞暴露于稀釋400倍的滅活卡介苗(BCG)和每毫升500單位的鼠γ干擾素(IFNγ)中，其中滅活前BCG活性為每毫升0.5-1×106菌落形成單位。細(xì)胞孵育8小時(shí)，然后用14.5％的甲泛葡胺(metrizamide)分層并于4℃，1750rpm離心15分鐘。收集交界面細(xì)胞，洗滌，在10％二甲亞砜(DMSO)中可存活地凍存于液氮內(nèi)。在37℃下解凍后，細(xì)胞洗滌兩次，重懸，濃度為每50微升1百萬個(gè)細(xì)胞。
在第15和17天腹膜內(nèi)給予環(huán)磷酰胺處理荷瘤小鼠(50mg/kg)。在第16，17，18和21天將樹突狀細(xì)胞注射到腫瘤內(nèi)(模擬注射50μl的磷酸鹽緩沖鹽水、未成熟的DC或者成熟8小時(shí)的DC)。隔日測(cè)定腫瘤的生長(zhǎng)，測(cè)60天。
在磷酸鹽緩沖鹽水腫瘤內(nèi)處理組中，第40天或之前全部4只小鼠腫瘤均大于100mm2。相反，腫瘤內(nèi)用未成熟DC處理的小鼠腫瘤生長(zhǎng)減緩，第40天4只小鼠中有2只腫瘤小于100mm2。第40天用部分成熟DC處理的4只小鼠中有3只腫瘤小于100mm2，并且這些動(dòng)物中有2只在第50天仍沒有明顯的腫瘤。
實(shí)施例3在本實(shí)施例中，采用熟知方法將人結(jié)腸癌細(xì)胞注射給小鼠，使之產(chǎn)生異種移植腫瘤。在第一次注射腫瘤細(xì)胞后，再給予動(dòng)物一個(gè)劑量的腫瘤細(xì)胞。15天后，將動(dòng)物分組，向每組動(dòng)物腫瘤內(nèi)給予安慰劑、未成熟的樹突細(xì)胞或者部分成熟的樹突細(xì)胞。隨后測(cè)定各組腫瘤的大小并進(jìn)行比較。
簡(jiǎn)言之，通過向右肋腹皮下注射100,000個(gè)腫瘤細(xì)胞，在雌性Balb/c小鼠身上生成人CT26結(jié)腸癌腫瘤。隨后在第3天向左肋注射100,000個(gè)腫瘤細(xì)胞。治療開始于第15天，此時(shí)所有小鼠右肋腹均已明顯帶有腫瘤，腫瘤大小為10mm2-45mm2。
按照標(biāo)準(zhǔn)方案從雌性Balb/c小鼠股骨髓制備樹突細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，紅細(xì)胞裂解后的骨髓細(xì)胞與鼠GM-CSF(200U/ml)和IL-4(200U/ml)，在補(bǔ)充有10％胎牛血清的RPMI 1640中孵育13-14天，在第3和第7天后加入含細(xì)胞因子的新鮮培養(yǎng)基。為獲得部分成熟的樹突細(xì)胞，將細(xì)胞暴露于400倍稀釋的滅活卡介苗(BCG)和每毫升500單位的鼠γ干擾素(IFNγ)中，其中滅活前BCG活性為每毫升0.5-1×106集落形成單位。細(xì)胞然后用14.5％的甲泛葡胺分層并于4℃，每分鐘1750rpm離心15分鐘。收集交界面細(xì)胞，洗滌，并在10％二甲亞砜(DMSO)中可存活地凍存于液氮內(nèi)。在37℃下解凍后，細(xì)胞洗滌兩次，重懸，濃度為每50微升1百萬個(gè)細(xì)胞。
在第15和17天腹膜內(nèi)給予環(huán)磷酰胺處理荷瘤小鼠(50mg/kg)。在第16，17，18和21天，將樹突細(xì)胞注射到右肋腹腫瘤內(nèi)(或者模擬注射50μl的磷酸鹽緩沖鹽水、未成熟的DC、成熟8小時(shí)的DC或者成熟24小時(shí)的DC)。隔日測(cè)定腫瘤的生長(zhǎng)，測(cè)60天。
在磷酸鹽緩沖鹽水腫瘤內(nèi)處理組中，全部5只小鼠在第35天之前右肋腹腫瘤大于100mm2，3/5的動(dòng)物在第40天或之前左肋腹腫瘤大于100mm2。相反，用未成熟DC治療腫瘤內(nèi)(僅右側(cè))的小鼠腫瘤生長(zhǎng)減緩一只小鼠在第60天雙側(cè)均無明顯腫瘤，并且5只小鼠中的4只在第40天雙側(cè)腫瘤均小于100mm2。用8小時(shí)部分成熟DC處理的5只小鼠中有3只到第50天時(shí)腫瘤完全消解。用24小時(shí)部分成熟DC處理的組中腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)一步下降。5只小鼠中的3只在第50天雙側(cè)腫瘤完全消解，一只動(dòng)物左肋腹腫瘤完全消解，右肋腹腫瘤部分控制(第40天＜100mm2)，一只動(dòng)物兩側(cè)腫瘤部分控制(第40天兩側(cè)都＜50mm2)。
實(shí)施例4在本實(shí)施例中，如上所述用人腫瘤細(xì)胞在小鼠腫瘤身上產(chǎn)生異源腫瘤。通過將細(xì)胞暴露于咪唑并喹啉R898或R898聯(lián)合BCG和IFNγ的樹突細(xì)胞成熟劑，使分化的未成熟的樹突細(xì)胞部分成熟。向腫瘤內(nèi)給予部分成熟的樹突細(xì)胞、未成熟的樹突細(xì)胞和安慰劑，比較各組腫瘤的大小。
簡(jiǎn)言之，按照實(shí)施例2在小鼠身上形成腫瘤。按照實(shí)施例2和3制備樹突細(xì)胞，不過部分成熟細(xì)胞是通過將細(xì)胞暴露于5μg/ml的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(樹突細(xì)胞成熟劑)R848，或5μg/ml的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)劑R848與實(shí)施例2和3所述濃度的BCG和干擾素γ中8小時(shí)而獲得。
處理方法同實(shí)施例3。磷酸鹽緩沖鹽水腫瘤內(nèi)注射的小鼠的腫瘤生長(zhǎng)未得到控制。單獨(dú)用R848部分成熟DC處理的5只小鼠中，有一只腫瘤生長(zhǎng)完全消解，而聯(lián)合用R848與BCG和IFNγ部分成熟DC腫瘤內(nèi)處理的5只小鼠中，有3只腫瘤生長(zhǎng)完全消解。來自實(shí)施例3和4中腫瘤完全消解的9只小鼠，在腫瘤消退后約30天用1百萬個(gè)腫瘤細(xì)胞在右肋腹攻擊。沒有動(dòng)物出現(xiàn)可檢測(cè)的腫瘤生長(zhǎng)，表現(xiàn)出對(duì)CT26腫瘤細(xì)胞的免疫保護(hù)作用。
實(shí)施例5本實(shí)施例中，對(duì)以上實(shí)施例中制備的樹突細(xì)胞進(jìn)行表面分子的表達(dá)檢定。簡(jiǎn)言之，實(shí)驗(yàn)2-4制備的小鼠樹突細(xì)胞，通過熒光抗體染色后流式細(xì)胞術(shù)分析，來檢定細(xì)胞表面分子的表達(dá)。結(jié)果以表面標(biāo)志表型陽性細(xì)胞的百分比和某表面標(biāo)志的平均熒光強(qiáng)度表示，如表2和3。
表2
表3
實(shí)施例7診斷患有實(shí)體瘤的患者采用化療、放射療法、冷凍療法或近距療法治療后，腫瘤內(nèi)給予部分成熟的樹突細(xì)胞。治療后，腫瘤消退且可防止患者腫瘤復(fù)發(fā)。
上述實(shí)施例僅供說明，而非限制本發(fā)明要求權(quán)項(xiàng)的范圍。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言本發(fā)明的其它變化顯而易見，并包含于附加權(quán)利要求中。此處引用的所有發(fā)表物、專利、專利申請(qǐng)及其它參考文獻(xiàn)，其內(nèi)容也全部引入作為參考。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答的方法，包括給予具有腫瘤的個(gè)體含有已經(jīng)體外部分成熟的樹突細(xì)胞的細(xì)胞群，其中在個(gè)體給藥后，所述部分成熟的樹突細(xì)胞能夠攝取和加工抗原，并能夠誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中樹突細(xì)胞從皮膚、脾臟、骨髓、胸腺、淋巴結(jié)、臍帶血或外周血中獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中樹突細(xì)胞從待治療個(gè)體獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中樹突細(xì)胞從與待治療個(gè)體HLA相匹配的健康個(gè)體獲得。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中樹突細(xì)胞在樹突細(xì)胞成熟劑存在的條件下部分成熟。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中樹突細(xì)胞成熟劑為卡介苗(BCG)、干擾素γ(IFNγ)、脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、咪唑并喹啉化合物、合成的雙鏈多核糖核苷酸、Toll-樣受體激動(dòng)劑(TLR)，含有已知誘導(dǎo)DC成熟的未甲基化CpG基序的核酸序列，或其任意組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中BCG可包括完整BCG，BCG細(xì)胞壁成分，BCG-來源的lipoarabidomannans，或BCG組分。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中BCG為熱滅活BCG或福爾馬林-處理的BCG。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中有效劑量的BCG為每毫升組織培養(yǎng)基約105-107cfu，有效劑量的IFNγ為每毫升組織培養(yǎng)基大約100-大約1000單位。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中咪唑喹啉化合物為咪唑并喹啉-4-胺化合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中咪唑并喹啉-4-胺化合物為4-氨基-2-乙氧基甲基-α，α-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇，或1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺，或其衍生物。
12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中合成的雙鏈多核糖核苷酸為聚[I]∶聚[C(12)U]。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中部分成熟的樹突細(xì)胞直接給藥至腫瘤內(nèi)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中部分成熟的樹突細(xì)胞給藥至外科手術(shù)除去或切除腫瘤后的腫瘤基床內(nèi)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中部分成熟的樹突細(xì)胞給藥至腫瘤周圍的組織區(qū)域。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中部分成熟的樹突狀細(xì)胞給藥至直接引流腫瘤區(qū)域的淋巴結(jié)內(nèi)。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中部分成熟樹突細(xì)胞直接給藥至為腫瘤或腫瘤侵襲器官輸送血液或淋巴液的循環(huán)脈管內(nèi)。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中部分成熟的樹突細(xì)胞給藥至循環(huán)系統(tǒng)，以便細(xì)胞可以輸送到腫瘤或腫瘤侵襲器官。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中給予部分成熟樹突細(xì)胞作為放療、化療或其組合的輔劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中在放療、化療或其組合治療之前、同時(shí)或之后給予部分成熟的樹突細(xì)胞。
21.一種組合物，包含在樹突細(xì)胞成熟劑存在條件下體外部分成熟的樹突細(xì)胞，與用于體內(nèi)給藥的藥物可接受載體相結(jié)合。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中部分成熟的樹突細(xì)胞上調(diào)共刺激分子CD80、CD86和/或CD54，并保留攝取和加工抗原的能力。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中組合物包含大約102-大約1010的部分成熟樹突細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中部分成熟樹突細(xì)胞在部分成熟之后冷凍保存。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中部分成熟樹突細(xì)胞從待給藥患者體內(nèi)分離。
26.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中部分成熟樹突細(xì)胞與待給藥患者HLA相匹配。
27.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中部分成熟的樹突細(xì)胞直接給藥至腫瘤內(nèi)。
28.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中部分成熟的樹突細(xì)胞給藥至外科手術(shù)除去或切除腫瘤后的腫瘤基床內(nèi)。
29.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中部分成熟的樹突細(xì)胞給藥至腫瘤周圍的組織區(qū)域。
30.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中部分成熟的樹突細(xì)胞給藥至直接引流腫瘤區(qū)域的淋巴結(jié)內(nèi)。
31.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中部分成熟樹突細(xì)胞直接給藥至為腫瘤、腫瘤基床或腫瘤侵襲器官輸送血液或淋巴液的循環(huán)脈管內(nèi)。
32.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中部分成熟的樹突細(xì)胞給藥至循環(huán)系統(tǒng)，以便細(xì)胞可以輸送到腫瘤、腫瘤基床或腫瘤侵襲器官。
全文摘要
本發(fā)明提供可用于腫瘤個(gè)體給藥的包含部分成熟樹突細(xì)胞的細(xì)胞群體。與樹突細(xì)胞成熟試劑作用約1－約10小時(shí)或更久的部分成熟的樹突細(xì)胞，可在腫瘤部位有效攝取和加工腫瘤抗原，并完全成熟，隨后可遷移至治療個(gè)體的淋巴結(jié)處。一旦到達(dá)淋巴結(jié)內(nèi)，已完全成熟的抗原提呈樹突細(xì)胞分泌適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子(例如TNFα和IL－12)，與T細(xì)胞作用誘導(dǎo)后續(xù)的抗腫瘤免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)C12N5/02GK1738619SQ200380108975
公開日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2003年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月6日
發(fā)明者M·L·博希 申請(qǐng)人:西北生物治療藥物公司