專利名稱：：用于誘導(dǎo)未成熟單核細(xì)胞的樹突細(xì)胞的激活的組合物和方法用于誘導(dǎo)未成熟單核細(xì)胞的樹突細(xì)胞的激活的組合物和方法相關(guān)應(yīng)用本申請(qǐng)要求2005年12月8日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/748,885的優(yōu)先權(quán)，通過(guò)引用將其包含入本文。發(fā)明背景抗原遞呈細(xì)胞(APC)在引發(fā)有效的免疫反應(yīng)中是非常重要的。它們不僅將抗原呈遞至具有抗原特異性T細(xì)胞受體的T細(xì)胞，而且還提供了T細(xì)胞激活所必需的信號(hào)。這些信號(hào)仍未完全確定，但牽涉許多細(xì)胞表面分子和細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子。幼稚型T細(xì)胞的激活和極化所必需的因子可以與記憶性T細(xì)胞的再激活所需的因子不同。APC為T細(xì)胞提供抗原和遞送信號(hào)的能力通常稱為輔助細(xì)胞功能(accessorycellfunction)。盡管已顯示單核細(xì)胞和B細(xì)胞是感受態(tài)(competent)APC，但它們的體外抗原呈遞能力似乎限于之前致敏的T細(xì)胞的再激活。因此，單核細(xì)胞和B細(xì)胞不能直接功能性激活幼稚型或未接觸抗原的T細(xì)胞群體。它們也不能遞送可極化誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)或當(dāng)其被誘導(dǎo)的時(shí)的免疫反應(yīng)的信號(hào)。樹突細(xì)胞(DC)是免疫系統(tǒng)的據(jù)認(rèn)為能夠激活幼稚型和記憶性T細(xì)胞的專職抗原遞呈細(xì)胞。日益增多地離體制備樹突細(xì)胞以用于免疫治療，特別是癌癥的免疫治療。具有最佳免疫刺激性質(zhì)的樹突細(xì)胞的制備需要理解和利用這些細(xì)胞的生物學(xué)知識(shí)以用于進(jìn)行離體培養(yǎng)。已描述了用于這些細(xì)胞培養(yǎng)的各種方案，所述方案具有歸于各方案的不同有利方面。最近的方案包括無(wú)血清培養(yǎng)基的使用，賦予培養(yǎng)的細(xì)胞以希望的免疫刺激性質(zhì)的成熟條件的應(yīng)用。樹突細(xì)胞的激活起始了將未成熟DC(其表型與皮膚郎格漢斯細(xì)胞相似)轉(zhuǎn)變成成熟的、能夠遷移至淋巴結(jié)的抗原遞呈細(xì)胞的過(guò)程。該過(guò)程導(dǎo)致表征未成熟樹突細(xì)胞的強(qiáng)抗原攝取能力的漸近和累進(jìn)丟失以及導(dǎo)致共刺激細(xì)胞表面分子和各種細(xì)胞因子的表達(dá)上調(diào)。不同的剌激物可起始DC的成熟。該過(guò)程非常復(fù)雜且在體外至少可花費(fèi)48小時(shí)才能完成。成熟的一個(gè)其他結(jié)果是細(xì)胞的體內(nèi)遷移性質(zhì)的改變。例如，成熟誘導(dǎo)幾個(gè)趨化因子受體，包括CCR7，所述受體指導(dǎo)細(xì)胞至引流淋巴結(jié)的T細(xì)胞區(qū)域，在該區(qū)域成熟DC激活T細(xì)胞，所述T細(xì)胞抗DC表面呈遞的I類和II類MHC分子背景中的抗原。術(shù)語(yǔ)"激活"和"成熟"以及"激活的"和"使成熟"描述了誘導(dǎo)和完成從未成熟DC(部分特征在于攝取抗原的能力)至成熟DC(部分特征在于有效地刺激從新形成的T細(xì)胞反應(yīng)的能力)的轉(zhuǎn)變。所這術(shù)語(yǔ)在本領(lǐng)域內(nèi)通?？苫Q使用。已知的成熟方案基于據(jù)認(rèn)為DC在暴露于抗原期間或之后遇到的體內(nèi)環(huán)境。該方法的最佳實(shí)例是將單核細(xì)胞條件化的培養(yǎng)基(MCM)用作細(xì)胞培養(yǎng)基。通過(guò)培養(yǎng)單核細(xì)胞在體外產(chǎn)生MCM，并且將其用作成熟因子的來(lái)源。(參見例如，美國(guó)2002/0160430，通過(guò)引用包含入本文)。MCM中負(fù)責(zé)成熟的主要成分據(jù)報(bào)導(dǎo)為(促)炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素lP(IL-1P)、白細(xì)胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子oc(TNFoc)。因此可通過(guò)許多不同的因子觸發(fā)DC的成熟，所述因子通過(guò)宿主參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。作為結(jié)果，不存在單一的成熟途徑或結(jié)果，但事實(shí)上存在許多成熟DC策略，其各自具有它們自身的獨(dú)特的功能特征。從概念上來(lái)說(shuō)這是這個(gè)道理，因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)必須對(duì)其作出反應(yīng)的對(duì)身體的各種威脅是多方面的，因此這需要不同的攻擊策略。例如，在通過(guò)補(bǔ)充以特定抗體的、激活的巨噬細(xì)胞充分清除細(xì)菌感染，通過(guò)有效地殺死病毒感染的細(xì)胞的細(xì)胞毒性T細(xì)胞充分攻擊病毒感染的時(shí)候。癌細(xì)胞的殺死通常牽涉細(xì)胞毒性T細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞和抗體的結(jié)合。因此可設(shè)計(jì)DC的體外成熟，以誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)趨向于一種類型的免疫反應(yīng)而非另一種免疫反應(yīng)，即，極化免疫反應(yīng)。DC的定向成熟描述了概念，即成熟過(guò)程的結(jié)果規(guī)定了由使用成熟DC的處理引起的跟著發(fā)生的免疫反應(yīng)的類型。以其最簡(jiǎn)單的形式，定向成熟導(dǎo)致產(chǎn)生DC群體，該DC群體產(chǎn)生指導(dǎo)對(duì)Thl型或Th2型反應(yīng)極化的T細(xì)胞反應(yīng)的細(xì)胞因子。DC表達(dá)多至9種不同的Toll樣受體(TLRl至TLR9)，所述受體中的各受體可用于觸發(fā)成熟。毫不驚奇的是，細(xì)菌產(chǎn)物與TLR2和TLR4的相互作用導(dǎo)致DC的定向成熟，從而導(dǎo)致最適合于處理細(xì)菌感染的極化反應(yīng)。相反地，通過(guò)TLR7或TLR9觸發(fā)的成熟似乎更傾向于導(dǎo)致抗病毒類型的反應(yīng)。作為另一個(gè)的例子，向最成熟的方案加入干擾素y(IFN-y)導(dǎo)致成熟dc產(chǎn)生白細(xì)胞介素12,這規(guī)定了Thl類型反應(yīng)。相反地，前列腺素E2的加入具有相反的效應(yīng)。因此可用于激活的DC的定向成熟的因子可包括例如白細(xì)胞介素IP(IL-1P)、白細(xì)胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子a(TNFoc)。其他成熟因子包括前列腺素E2(PGE2)、poly-dldC、血管腸肽(VIP)、細(xì)菌脂多糖(LPS)以及分枝桿菌或分枝桿菌的組分例如特定的細(xì)胞壁成分。其他成熟因子包括例如咪唑喹啉化合物，例如咪唑喹啉-4-胺化合物，例如4-氨基-2-乙氧基甲基-ot，cx-二甲基-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-l-乙醇(稱為R848)或1-(2-甲丙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺，以及它們的衍生物(WO00/47719，其全文通過(guò)引用包含入本文)、合成的雙鏈多核苷酸例如poly[I]:poly[C(12)U〗等、To11樣受體(TLR)例如TLR3、TLR4、TLR7和/或TLR9的激動(dòng)劑、包含已知誘導(dǎo)DC的成熟的未甲基化的CpG基序的核酸的序列等。此外，上述試劑的任何組合可用于誘導(dǎo)樹突前體細(xì)胞的成熟。完全成熟的樹突細(xì)胞在質(zhì)量上和數(shù)量上與未成熟的DC不同。一旦完全成熟，DC表達(dá)更高水平的MHCI類和II類抗原，以及更高水平的T細(xì)胞共刺激分子，即CD80和CD86。這些變化增加了樹突細(xì)胞激活T細(xì)胞的能力，因?yàn)樗鼈兺ㄟ^(guò)T細(xì)胞例如CD28等上的共刺激分子的相應(yīng)物(counterpart)增加了細(xì)胞表面的抗原密度和T細(xì)胞激活信號(hào)的強(qiáng)度。此外，成熟DC產(chǎn)生大量刺激和極化T細(xì)胞反應(yīng)的細(xì)胞因子。通常，用于離體DC產(chǎn)生的方法包括從患者獲得就DC前體細(xì)胞而富集的細(xì)胞群體，然后在導(dǎo)回患者之前，在體外將DC前體細(xì)胞分化成成熟DC。一些人認(rèn)為DC必須完全分化，或它們將去分化回到單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和失去許多它們的免疫增強(qiáng)能力。已使用上面列出的方法和試劑成功地實(shí)現(xiàn)了從單核細(xì)胞產(chǎn)生的DC的離體成熟。一般地，為產(chǎn)生未成熟樹突細(xì)胞(DC)，人們必須首先從其他污染細(xì)胞類型純化或富集單核細(xì)胞前體。通常通過(guò)將單核細(xì)胞前體附著至塑料(聚苯乙烯)表面來(lái)進(jìn)行所述純化或富集，因?yàn)閱魏思?xì)胞對(duì)塑料細(xì)胞更大的依附;向。在通過(guò)強(qiáng)力清洗基本上除去污染細(xì);后，將單核細(xì)胞與將單核細(xì)胞前體轉(zhuǎn)化成未成熟DC或直接轉(zhuǎn)化成成熟DC的細(xì)胞因子一起培養(yǎng)。用于區(qū)分單核細(xì)胞前體細(xì)胞和未成熟DC的方法最早由Sallusto和Lanzavecchia(J.Exp.Med.，179:1109-1118，1994，通過(guò)引用將其包含入本文)描述，他們使用細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)單核細(xì)胞至未成熟DC的分化。盡管最常使用細(xì)胞因子的該組合，但已描述了不同的其他組合實(shí)現(xiàn)了相同的目的，例如用IL-13或IL-15取代IL-4。該過(guò)程的最終結(jié)果是"面紗"細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)T細(xì)胞共刺激分子以及高水平的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的分子，但不表達(dá)樹突細(xì)胞成熟標(biāo)記CD83。這些細(xì)胞類似于皮膚中的朗格漢斯細(xì)胞，且它們的主要生理功能是捕獲入侵的微生物。該方法的變型包括純化單核細(xì)胞的不同方法，包括例如，正切流動(dòng)過(guò)濾(TFF)，或通過(guò)將附著至小珠的抗體與單核細(xì)胞上的表面分子結(jié)合。然后將具有結(jié)合細(xì)胞的小珠濃集在柱子中或磁性表面上，這樣可在將單核細(xì)胞從小珠洗脫后將污染細(xì)胞洗掉。在獲得樹突細(xì)胞前體的另一個(gè)方法中，純化來(lái)自血液(美國(guó)專利5,994,126，通過(guò)引用包含入本文)或來(lái)自骨髓的表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記CD34的細(xì)胞?？蓪⑦@些細(xì)胞與必需細(xì)胞因子GM-CSF—起培養(yǎng)以分化成成熟的DC。這些DC似乎具有與從單核細(xì)胞產(chǎn)生的未成熟DC非常相似的特征和功能性質(zhì)。未成熟DC具有攝取和加工抗原的高容量，但具有有限的起始免疫反應(yīng)的能力。通過(guò)未成熟DC的成熟獲得引起免疫反應(yīng)的能力。該成熟也稱為激活DC或DC的激活。通過(guò)與上面所示的誘導(dǎo)成熟的細(xì)胞因子、細(xì)菌產(chǎn)物或病毒組分等接觸來(lái)啟動(dòng)成熟過(guò)程。盡管這些方法能夠產(chǎn)生成熟DC，但使用重組分子和細(xì)胞上清液進(jìn)行DC成熟具有不利方面。這些方面包括這些試劑的批次與批次之間質(zhì)量和產(chǎn)量不一致以及引入了大量外源蛋白，所述外源蛋白可與目的抗原竟?fàn)庍\(yùn)輸入單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體以進(jìn)行加工。外源蛋白也可以是有毒性的或如果給患者施用則導(dǎo)致自身免疫。這樣的試劑的生產(chǎn)成本也可以很昂貴，從而使得免疫治療的費(fèi)用昂貴得讓人不敢問(wèn)津。發(fā)明概述目前描述的方法和組合物提供了未成熟樹突細(xì)胞(DC)的激活的誘導(dǎo)，和引發(fā)這些細(xì)胞進(jìn)行抗原特異性免疫反應(yīng)。在一個(gè)方面，提供來(lái)產(chǎn)生就激活的樹突細(xì)胞而富集的細(xì)胞群體的方法，所述培養(yǎng)條件適合于樹突細(xì)胞附著組織培養(yǎng)基質(zhì)和適合于在足以形成就激活的樹突細(xì)胞而富集的細(xì)胞群體的時(shí)間內(nèi)體外培養(yǎng)未成熟的樹突細(xì)胞。在所述方法中，不必加入樹突細(xì)胞成熟劑來(lái)誘導(dǎo)樹突細(xì)胞群體的激活?？稍趯⑽闯墒鞓渫患?xì)胞與組織培養(yǎng)表面接觸前、接觸過(guò)程中或接觸后將未成熟樹突細(xì)胞與預(yù)先確定的抗原接觸。預(yù)先確定的抗原可以是例如胂瘤特異性抗原、腫瘤相關(guān)抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、腫瘤細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、表達(dá)抗原的重組細(xì)胞、細(xì)胞裂解物、膜制劑、重組產(chǎn)生的抗原、肽抗原(例如，合成的肽抗原)或分離的抗原。此外，抗原可以是可溶性抗原或顆?？乖?。在特定的實(shí)施方案中，抗原可以是來(lái)源于患者腫瘤或腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞裂解物或膜制劑。在某些實(shí)施方案中，方法還可任意地包括獲得就單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體而富集的細(xì)胞群體；和在試劑存在的情況下培養(yǎng)前體，所述試適的樹突細(xì)胞分化試劑包括，例如，GM-CSF、白細(xì)胞介素4、GM-CSF和白細(xì)胞介素4的、或GM-CSF和白細(xì)胞介素13或白細(xì)胞介素15的混合物?？梢砸詮娜耸茉囌叻蛛x的細(xì)胞的形式獲得單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體。在另一個(gè)方面，提供了用于產(chǎn)生就激活的樹突細(xì)胞而富集的細(xì)胞群體的方法。方法通常包括提供就未成熟樹突細(xì)胞而富集的細(xì)胞群體；培養(yǎng):質(zhì)和培養(yǎng)基接觸，'、所述培養(yǎng)l件適合于樹突細(xì)胞與組織培養(yǎng)基質(zhì)的附著和適合于未成熟樹突細(xì)胞的體外培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行足以形成就激活的成熟樹突細(xì)胞而富集的細(xì)胞群體的時(shí)間。當(dāng)給哺乳動(dòng)物施用時(shí)，所得的激活的成熟樹突細(xì)胞群體在該哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生抗原特異性免疫反應(yīng)?？稍谶m合于附著的條件下，在與組織培養(yǎng)基質(zhì)接觸之預(yù)先確定的抗原可以是例如肺瘤特異性抗原、腫瘤相關(guān)抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、腫瘤細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、表達(dá)抗原的重組細(xì)胞、細(xì)胞裂解物、膜制劑、重組產(chǎn)生的抗原、肽抗原(即，合成的肽)或分離的抗原?？乖梢允强扇苄钥乖蝾w?？乖Ｔ谔囟ǖ膶?shí)施方案中，抗原是來(lái)源于患者腫瘤或腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞裂解物或膜制劑。也可加入可指導(dǎo)DC的成熟傾向?qū)hl和/或Th2反應(yīng)的反應(yīng)的試劑，例如干擾素y(IFNy)。在某些實(shí)施方案中，方法還可任意地包括獲得單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體；和在分化劑存在的情況下體外培養(yǎng)前體，從而形成未成熟樹突細(xì)胞。合適的分化劑包括例如GM-CSF、白細(xì)胞介素4、白細(xì)胞介素13、白細(xì)胞介素15或其混合物?？蓮男柚委煹娜耸茉囌呋驈慕M織相容性匹配的個(gè)體分離單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體。在另一個(gè)實(shí)施方面，提供了用于激活T細(xì)胞的組合物。組合物可包含通過(guò)在適合于樹突細(xì)胞附著組織培養(yǎng)基質(zhì)和適合于激活的條件下細(xì)胞群體；和預(yù)先確定的抗原。樹突細(xì)胞群體可產(chǎn)生與通過(guò)前述方法應(yīng)。通過(guò)將未成熟樹突細(xì)胞與之前的培養(yǎng)基和加入的細(xì)胞因子分離，然后在不加入樹突細(xì)胞成熟劑的情況下，在適合于DC附著至組織培養(yǎng)基質(zhì)的條件下將分離的未成熟樹突細(xì)胞與組織培養(yǎng)基質(zhì)接觸來(lái)產(chǎn)生樹突細(xì)胞群體。樹突細(xì)胞，一旦在適合于樹突細(xì)胞附著至組織培養(yǎng)基質(zhì)的條件下與組織培養(yǎng)基質(zhì)接觸后，立即被觸發(fā)進(jìn)行通過(guò)激活和成熟，形成活性成熟樹突細(xì)胞。與未成熟樹突細(xì)胞同時(shí)加入組織培養(yǎng)基質(zhì)的或在成熟過(guò)程中(即在激活后但在完全成熟之前)加入的預(yù)先確定的可溶性抗原或顆?？乖軌虮粯渫患?xì)胞攝取和加工，并且在合適的細(xì)胞表面受體(與T細(xì)胞接觸后可獲得的)的背景下被呈遞，從而誘導(dǎo)抗原特異性免疫反應(yīng)。在另一個(gè)方面，提供了分離的、激活的樹突細(xì)胞群體。細(xì)胞群體包括和富集之前在有助于樹突細(xì)胞附著至組織培養(yǎng)基質(zhì)的條件下與組;得的激活的樹突細(xì)胞可攝取和加工S原，且在體,"續(xù)培養(yǎng)后，可獲得成熟樹突細(xì)胞的細(xì)胞表面表型。細(xì)胞群體可以任意地包括預(yù)先確定的抗原和/或分離的T細(xì)胞，例如幼稚型T細(xì)胞。T細(xì)胞可以任意地存在于分離的淋巴細(xì)胞的制劑中。也提供了產(chǎn)生激活的T細(xì)胞的方法。方法通常包括提供就分離的未成熟樹突細(xì)胞而富集的細(xì)胞群體；在適合未成熟樹突細(xì)胞附著至組成熟樹突細(xì)胞與組織培養(yǎng)基質(zhì)和樹突細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑接觸。培養(yǎng)細(xì)胞:。可將激活的樹突細(xì)^與幼稚型T細(xì)胞接觸，從而形成激活的抗原特異性T細(xì)胞。合適的抗原可包括例如胂瘤特異性抗原、肺瘤相關(guān)抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、腫瘤細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、表達(dá)抗原的重組細(xì)胞、細(xì)胞裂解物(包括腫瘤細(xì)胞裂解物)、膜制劑、重組產(chǎn)生的抗原、肽抗原(例如，合成的肽抗原)或分離的抗原。預(yù)先確定的抗原可以是可溶性抗原或顆粒抗原。也可加入可指導(dǎo)DC的成熟4吏反應(yīng)傾向Thl和/或Th2反應(yīng)的試劑，例如干擾素Y?？蓪⒕臀闯墒鞓渫患?xì)胞而富集的細(xì)胞群體同時(shí)與預(yù)先確定的抗原和組織培養(yǎng)基質(zhì)以及樹突細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑接觸，或可在與組織培養(yǎng)基質(zhì)和樹突細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑接觸之前、期間或同時(shí)或之后，將細(xì)胞與預(yù)先確定的抗原接觸。在某些實(shí)施方案中，方法還可包括獲得就單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體而富集的細(xì)胞群體；和在樹突細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑存在的情況下體外培養(yǎng)前體以誘導(dǎo)未成熟樹突細(xì)胞的形成。合適的分化誘導(dǎo)劑包括，例如，GM-CSF、白細(xì)胞介素4、白細(xì)胞介素13或白細(xì)胞介素15或其混合物?？扇我獾貜娜耸茉囌攉@得單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體。在特定的實(shí)施方案中，單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體細(xì)胞、未成熟樹突細(xì)胞和/或T細(xì)胞相互之間是自體同源的?？蓪?duì)需要抗原特異性免疫反應(yīng)刺激的動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物施用激活的抗原特異性T細(xì)胞。合適的抗原包括例如胂瘤特異性抗原、胂瘤相關(guān)抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、腫瘤細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、表達(dá)抗原的重組細(xì)胞、細(xì)胞裂解物、膜制劑、重組產(chǎn)生的抗原、肽抗原(例如，合成的肽抗原)或分離的抗原。在特定的實(shí)施方案中，細(xì)胞裂解物和/或膜制劑來(lái)源患者腫瘤或腫瘤細(xì)胞系?？扇我獾貙⑽闯墒鞓渫患?xì)胞同時(shí)與預(yù)先確定的抗原、和組織培養(yǎng)基質(zhì)、樹突細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑接觸，或可在與新的、未使用的、干凈的組織培養(yǎng)基質(zhì)接觸之前將未成熟樹突細(xì)胞與預(yù)先確定的抗原接觸。在某些實(shí)施方案中，方法還可包括從動(dòng)物分離單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體；和在分化劑存在的情況下在體外培養(yǎng)前體以形成未成熟樹突細(xì)胞。分化劑可以是例如GM-CSF、白細(xì)胞介素4、白細(xì)胞介素13、白細(xì)胞介素15或其混合物。單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體未成熟樹突細(xì)胞群體和/或T細(xì)胞對(duì)于動(dòng)物可以是自體的或?qū)τ趧?dòng)物可以是同種異體的?？蛇x擇地，單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體、未成熟樹突細(xì)胞和/或T細(xì)胞可具有與動(dòng)物相同的MHC單元型，或共有MHC標(biāo)記。在某些實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是人或可以是非人動(dòng)物。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)或觸發(fā)未成熟樹突細(xì)胞(DC)群體的激活和成熟以及引發(fā)這些細(xì)胞群體進(jìn)行抗原特異性免疫反應(yīng)的方法?？蓮闹苿┡囵B(yǎng)基(包括分離培養(yǎng)基、培養(yǎng)培養(yǎng)基等)獲得未成熟樹突細(xì)胞群體，和在樹突細(xì)胞成熟劑不存在的情況下，將就未成熟單核細(xì)胞樹突細(xì)胞而富集的細(xì)胞群體在適合于DC附著至組織培養(yǎng)基質(zhì)的條件下與組織培養(yǎng)基質(zhì)和樹突細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑接觸?？稍谶m合于體外細(xì)胞培養(yǎng)的條件下將未成熟樹突細(xì)胞與預(yù)先確定的抗原接觸以使其可被DC攝取加工和呈遞?？稍诩せ钇鹗计陂g、之前或之后進(jìn)行與目的抗原的接觸?？蛇x擇地，可獲得已暴露于抗原(例如，體內(nèi))的未成熟單核細(xì)觸。所得的激活的成熟樹突細(xì)胞呈遞目的抗原，從而被引發(fā)激活T細(xì)胞朝向抗原特異性反應(yīng)?？赏ㄟ^(guò)加入定向成熟劑(directionalmaturationagent)例如干擾素y(IFNy)等來(lái)影響反應(yīng)的方向，即支持Th-1或Th-2反應(yīng)的反應(yīng)傾向。在另一個(gè)方面，可從受試者或從供體獲得就單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體而富集的細(xì)胞群體。可將細(xì)胞群體與樹突細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑例如一種或多種細(xì)胞因子(例如但不限于GM-CFS，和GM-CSF與IL-A、GM-CSF與IL-13、GM-CSF與IL-15的混合物等)接觸來(lái)獲得未成熟樹突細(xì)胞。然后可將未成熟樹突細(xì)胞與組織培養(yǎng)基質(zhì)和樹突細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑一起或，與細(xì)胞因子或其他定向成熟劑一起與預(yù)先確定的抗原接觸，從而激活和/或部分使樹突細(xì)胞成熟。可將成熟樹突細(xì)胞直接用于在受試者中誘導(dǎo)抗原特異性免疫反應(yīng)或可將細(xì)胞用于在T細(xì)胞中誘導(dǎo)抗原特異性免疫反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，刺激MHCI類抗原加工，這用于引發(fā)抗展示預(yù)先確定的抗原的細(xì)胞的CTL反應(yīng)。可通過(guò)加入定向成熟劑例如干擾素y來(lái)影響誘導(dǎo)的反應(yīng)的方向。如此處所使用的，定向成熟劑是當(dāng)單獨(dú)使用時(shí)可影響成熟DC的最終狀態(tài)但不誘導(dǎo)DC成熟的試劑。例如，定向成熟劑可極化DC群體的成熟以有利于Thl反應(yīng)而不利于Th-2反應(yīng)，或反之亦然。樹突細(xì)胞是在多種淋巴樣和非淋巴樣組織中發(fā)現(xiàn)的不同抗原遞呈細(xì)胞群體。(SeeLiu，Ce〃106:259-262(2001);Steinman，j加.ier./邊/z7wo人9:271-296(1991))。樹突細(xì)胞包括脾的淋巴樹突細(xì)胞、表皮的朗格漢斯細(xì)胞和血液循環(huán)中的面紗細(xì)胞?？傮w上，基于它們的形態(tài)學(xué)、高水平的表面匪C-II類表達(dá)和某些T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞以及天然殺傷細(xì)胞上表達(dá)的其他表面標(biāo)記的不存在將樹突細(xì)胞分類為一類細(xì)胞。特別地，單核細(xì)胞來(lái)源的樹突細(xì)胞(也稱為單核細(xì)胞樹突細(xì)胞)通常表達(dá)CDllc、CD80、CD83、CD86且為HLA-DR+，但通常是而非總是CD14一。相反地，單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體(通常為單核細(xì)胞)通常是CD14+且不表達(dá)或表達(dá)極低水平的HLA-DR、CD83和CD86。可從它們存在的任何組織，特別是淋巴樣組織例如脾、骨髄、淋巴結(jié)和胸腺獲得單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體。也可從循環(huán)系統(tǒng)獲得單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體。外周血是容易獲得的單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體的來(lái)源。臍帶血是單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體的另一個(gè)來(lái)源?？蓮亩喾N其中可引發(fā)免疫反應(yīng)的生物獲得單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體。這樣的生物包括動(dòng)物，例如包括人和非人動(dòng)物，例如靈長(zhǎng)類動(dòng)物、其他哺乳動(dòng)物(包括，但不限于狗、貓、小鼠和大鼠)、鳥(包括雞)以及其轉(zhuǎn)基因物種。在某些實(shí)施方案中，可從健康受試者或可選擇地從需要免疫刺激的受試者，例如癌癥患者(例如，腦癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等)或細(xì)胞免疫刺激對(duì)其來(lái)說(shuō)可以是有益的或希望的另一個(gè)受試者(例如，具有細(xì)菌或病毒感染等的受試者)獲得就單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體和/或未成熟樹突細(xì)胞而富集的細(xì)胞群體。還可從HLA疫刺激的HLA匹配的受試者進(jìn)行施用。樹突細(xì)胞前體和未成熟樹突細(xì)胞用于從不同來(lái)源(包括血液和骨髄)分離就樹突細(xì)胞前體和未成熟樹突細(xì)胞而富集的細(xì)胞群體的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。例如，可通過(guò)收集肝素化血液，通過(guò)血漿分離置換法(apheresis)或白細(xì)胞分離法(leukapheresis)、通過(guò)血沉棕黃層的制備、花結(jié)法(rosetting)、離心、密度梯度離心(例如，使用FICOLL(例如FICOLL-PAQUE)、PERC0LL(用非可透析的聚乙烯吡咯酮(PVP)包被的膠體硅顆粒(15-30mm的直徑)、蔗糖等)、細(xì)胞的差別裂解、過(guò)濾等獲得就樹突細(xì)胞前體和未成熟樹突細(xì)胞而富集的細(xì)胞群體。在某些實(shí)施方案中，可以例如通過(guò)從受試者收集血液，離心(defribrinating)以除去血小板和裂解紅細(xì)胞來(lái)制備白細(xì)胞群體。任意地，可通過(guò)例如通過(guò)密度梯度材料(例如PERCOLL梯度)的離心來(lái)就單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體富集樹突細(xì)胞前體和未成熟樹突細(xì)胞。可任意地在例如封閉的、無(wú)菌的系統(tǒng)中制備就樹突細(xì)胞前體和未成熟樹突細(xì)胞富集的所有群體。如此處所用的，術(shù)語(yǔ)"封閉的、無(wú)菌的系統(tǒng)"或"封閉系統(tǒng)"是指其中對(duì)未滅菌的、環(huán)境或循環(huán)氣體或其他未滅菌條件的暴露被減小至最低限度或消除的系統(tǒng)。用于荻得樹突的密度梯度離心、細(xì)胞的開放空氣中的轉(zhuǎn)移(openairtransferofcell)、組織培養(yǎng)皿或未封閉的培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)等。在一般的實(shí)施方案中，封閉系統(tǒng)允許樹突細(xì)胞前體和未成熟樹突細(xì)胞從最初的收集容器無(wú)菌轉(zhuǎn)移至可密閉的組織培養(yǎng)容器而不暴露于未滅菌的空氣。在某些實(shí)施方案中，如WO03/010292(其公開內(nèi)容通過(guò)引用包含入本文)中所述，通過(guò)將單核細(xì)胞附著至單核細(xì)胞結(jié)合基質(zhì)來(lái)獲得單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體。例如，可將白細(xì)胞群體(例如通過(guò)白細(xì)胞分離法分離的)與附著單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體的基質(zhì)接觸。當(dāng)將白細(xì)胞群體與基質(zhì)接觸時(shí)，白細(xì)胞群體中的單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體優(yōu)先附著至基質(zhì)。其他白細(xì)胞(包括其他潛在的樹突細(xì)胞前體)展示減少的對(duì)基質(zhì)的結(jié)合親和力，從而允許單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體在基質(zhì)的表面上優(yōu)先富集。合適的基質(zhì)包括，例如，具有大的表面積對(duì)體積比的基質(zhì)。這樣的基質(zhì)可以是例如，微?；蚶w維性基質(zhì)。合適的微?；|(zhì)包括例如玻璃、塑料微粒、玻璃包被的塑料微粒、玻璃包被的聚苯乙烯微粒和適合于蛋白質(zhì)吸附的其他微珠。合適的纖維性微粒包括微毛細(xì)管和微絨毛膜。微?；蚶w維性基質(zhì)通常允許附著的單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體洗脫而不顯著地減少附著的細(xì)胞的成活力。微?；蚶w維性基質(zhì)可以基本上是無(wú)孔的，從而有助于單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體或樹突細(xì)胞從基質(zhì)洗脫。"基本上無(wú)孔的，，基質(zhì)是其中至少大部分存在于基質(zhì)中的孔比細(xì)胞更小從而使基質(zhì)中捕獲的細(xì)胞減少至最低限度的基質(zhì)。任意地，可通過(guò)加入結(jié)合介質(zhì)來(lái)增強(qiáng)單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體至基質(zhì)的附著。合適結(jié)合介質(zhì)包括單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體培養(yǎng)基(例如，AIM-V、RPMI1640、DMEM、X-VIVO15@等)，所述培養(yǎng)基單獨(dú)地或以任何組合補(bǔ)充以細(xì)胞因子(例如，粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細(xì)胞介素4(IL-4)或白細(xì)胞介素13(IL-13))、血漿、血清(例如，人血，例如自體或同種異型的血清)、純化的蛋白質(zhì)例如血清白蛋白、二介陽(yáng)離子(例如，鉀和/或鎂離了)和幫助單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體特異性附著至基質(zhì)或阻止非單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體附著至基質(zhì)的其他分子。在某些實(shí)施方案中，可加熱失活血漿或血清。加熱失活的血漿對(duì)白細(xì)胞可以是自體或異源的。在單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體附著至基質(zhì)后，可將未附著的白細(xì)胞與單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體/基質(zhì)復(fù)合物分離?？墒褂萌魏魏线m的方法將未附著的細(xì)胞與復(fù)合物分開。例如，可讓未附著的白細(xì)胞和復(fù)合物的混合物沉降，然后倒出或引流排出未附著的白細(xì)胞和培養(yǎng)基?？蛇x擇，可對(duì)混合物離心，輕輕倒出或從沉淀的復(fù)合物引流排出包含未附著白細(xì)胞的上清液。在另一個(gè)方法中，可從通過(guò)使用正切流動(dòng)過(guò)濾裝置制備的白細(xì)胞中富集的細(xì)胞群體獲得就單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體而富集的所有群體。用于獲得就單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體而富集的細(xì)胞群體的正切流動(dòng)過(guò)濾裝置可包括具有錯(cuò)流室的清除器單位(removerunit)、過(guò)濾室和置于之間的過(guò)慮器(參見W02004-000444，其全文通過(guò)引用包含入本文)。過(guò)濾器在一側(cè)(滯留表面(retentatesurface))在液體中與錯(cuò)流室相通，在另一側(cè)(濾出液表面)與過(guò)濾室相通。錯(cuò)流室具有適合于將包含白細(xì)胞的血液成分的樣品導(dǎo)入錯(cuò)流室的進(jìn)口并且平行于過(guò)濾器的滯留表面。也在錯(cuò)流室中提供了出口，其位于室的中央部分，與過(guò)慮器的滯留表面相對(duì)。適合用于正切流動(dòng)過(guò)濾裝置的過(guò)慮器通常具有范圍在大約1至10微米的平均孔徑。過(guò)慮器可具有大約3至大約7微米的平均孔徑。還可包括用于提供預(yù)先確定的樣品進(jìn)入錯(cuò)流室的進(jìn)口的輸入速率的方法和用于控制濾液通過(guò)過(guò)濾器從而進(jìn)入過(guò)濾器室的過(guò)濾速率的方法。過(guò)濾速率控制是指限制過(guò)濾的速率以使之低于過(guò)濾器的無(wú)抗擊過(guò)濾速率(unopposedfiltrationrate)?？赏ㄟ^(guò)源裝置(sourcedevice)例如白細(xì)胞分離裝置或裝有從白細(xì)胞分離裝置收集的樣品的容器提供包含血液成分的樣品?？审w外培養(yǎng)或離體培養(yǎng)樹突細(xì)胞前體以進(jìn)行分化、成熟和/或擴(kuò)增。如此處所使用的，分離的未成熟樹突細(xì)胞、樹突細(xì)胞前體、T細(xì)胞和其他細(xì)胞是指通過(guò)人工從其天然環(huán)境分離而存在的，從而為非自然產(chǎn)物的細(xì)胞。分離的細(xì)胞可以以純化的形式、半純化的形式(例如，富集的細(xì)胞群體)存在或存在于非天然環(huán)境中。簡(jiǎn)而言之，離體分化通常包括在一種或多種樹突細(xì)胞分化劑存在的情況下培養(yǎng)樹突細(xì)胞前體或具有樹突細(xì)胞前體的細(xì)胞群體。合適的分化誘導(dǎo)劑可以是例如，但不限于，細(xì)胞生長(zhǎng)因子(例如，細(xì)胞因了例如(GM-CSF)、白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素13(IL-13)、白細(xì)胞介素15(IL-15)和/或其混合物)。在某些實(shí)施方案中，誘導(dǎo)單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體以分化成單核細(xì)胞來(lái)源的未成熟樹突細(xì)胞?？稍诤线m的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)樹突細(xì)胞前體和誘導(dǎo)其分化。合適的組織培養(yǎng)基包括例如AIM-V、RPMI1640、DMEM、X-VIV015@等。組織培養(yǎng)基可補(bǔ)充以血清、氨基酸、維生素、細(xì)胞因子例如GM-CSF和/或IL-4、IL-13或IL-15、二價(jià)陽(yáng)離子等，以促進(jìn)細(xì)胞分化成未成熟樹突細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，可在體外在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)樹突細(xì)胞前體。這樣的培養(yǎng)條件可任意地不包括任何動(dòng)物來(lái)源的產(chǎn)物。常用的樹突細(xì)胞培養(yǎng)基中的常用細(xì)胞因子混合物包含各自大約500個(gè)單位/ml的GM-CSF和IL-4。樹突細(xì)胞前體，當(dāng)分化形成未成熟樹突細(xì)胞時(shí)，其表型與皮膚朗格漢斯細(xì)胞相似。未成熟樹突細(xì)胞通常是CD14-和CDllc+，表達(dá)低水平的CD86和CD83，能夠通過(guò)專門的內(nèi)吞作用捕通常，在現(xiàn)有方法中，在對(duì)患者施用前或在與T細(xì)胞接觸前，以體外或離體的方式使未成熟樹突細(xì)胞成熟形成成熟樹突細(xì)胞。在這些方法中，在預(yù)先確定的抗原之前或與其一起向包含未成熟樹突細(xì)胞的體外培養(yǎng)物中加入樹突細(xì)胞成熟劑。一旦成熟，DC逐漸和累進(jìn)地失去攝取抗原的能力，它們通常展示上調(diào)的共刺激細(xì)胞表面分子和各種細(xì)胞因子的表達(dá)。特別地，成熟DC表達(dá)比未成熟樹突細(xì)胞更高水平的MHCI類和II類抗原，成熟的樹突細(xì)胞通常鑒定為表現(xiàn)CD80+、CD83+、CD86+和CD14-。更高的MHC表達(dá)導(dǎo)致DC表面上抗原密度的增加，同時(shí)共刺激分子CD80和CD86的上調(diào)通過(guò)T細(xì)胞上的共刺激分子的相應(yīng)物例如CD28加強(qiáng)了T細(xì)胞激活信號(hào)。與現(xiàn)有方法不同，通過(guò)在適合于樹突細(xì)胞附著至組織培養(yǎng)表面的條件下將分離的未成熟樹突細(xì)胞與組織培養(yǎng)基質(zhì)和樹突細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑接觸來(lái)起動(dòng)或觸發(fā)本發(fā)明的方法中的未成熟樹突細(xì)胞的激活。在本發(fā)明的常用方法中，在不加入成熟劑的情況下完成激活。從前述培養(yǎng)基質(zhì)或純化介質(zhì)中取出和從前述培養(yǎng)基中分離未成熟樹突細(xì)胞。然后對(duì)分離的未成熟樹突細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且冷凍以待以后與新配制的培養(yǎng)基(在方法的剩余部分不加入樹突細(xì)胞成熟因子)一起使用。在一個(gè)可選擇的方法中，可在激活期間加入定向成熟劑以使樹突細(xì)胞產(chǎn)生偏向性，這樣它們可極化T細(xì)胞反應(yīng)朝向Th-l或Th-2反應(yīng)。例如，但不作為對(duì)可使用的試劑的限定，可加入干擾素Y以使T細(xì)胞反應(yīng)偏向Th-1反應(yīng)。加入單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體或未成熟DC的干擾素Y本身不誘導(dǎo)DC分化和/或成熟。用于本發(fā)明的方法的組織培養(yǎng)基質(zhì)可包括組織培養(yǎng)孔、培養(yǎng)瓶、瓶、袋或用于生物反應(yīng)器的任何基質(zhì)例如纖維、小珠、板等。通常，組織培養(yǎng)基質(zhì)包括塑料例如聚苯乙烯、Teflor^(聚四氟乙烯，PTFE)等。最常用于樹突細(xì)胞(用于免疫療法)的離體培養(yǎng)的這些組織培養(yǎng)基質(zhì)包括組織培養(yǎng)瓶、袋或由多個(gè)塑料疊加層組成的小室部分(cellffaction)等。可在合適的成熟培養(yǎng)條件中培養(yǎng)和成熟分離的未成熟樹突細(xì)胞。合適的組織培養(yǎng)基包括AIM-V、RPMI1640、DMEM，X-VIV015@等。組織培養(yǎng)基可補(bǔ)充以氨基酸、維生素、細(xì)胞因子、人血清例如大約1%至大約10%的人AB血清、二價(jià)陽(yáng)離子等，以促進(jìn)細(xì)胞的成熟。通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法監(jiān)測(cè)樹突細(xì)胞的成熟或激活。可在本領(lǐng)域熟悉的測(cè)定法例如流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)法等中檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記。還可就細(xì)胞因子的產(chǎn)生(例如，通過(guò)ELISA、FACS或其他免疫測(cè)定法)監(jiān)測(cè)細(xì)胞。在根據(jù)本發(fā)明激活的DC群體中，還可就典型的細(xì)胞表面標(biāo)記CD83、CD86和HLA-DR的出現(xiàn)測(cè)定細(xì)胞。這些抗原中的一些如CD83只在成熟DC上表達(dá)，然而其他抗原的表達(dá)在成熟后顯著上調(diào)。成熟DC也失去了通過(guò)胞飲作用攝取抗原的能力，這可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的攝入測(cè)定法來(lái)進(jìn)行分析?？衫洳乇４嬉呀佑|抗原的或未接觸抗原的樹突細(xì)胞前體、未成熟樹突細(xì)胞和成熟樹突細(xì)胞以用于以后使用。用于冷藏保存的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。參見，例如，美國(guó)專利5,788,963,其全文通過(guò)引用包含入本文?？乖景l(fā)明的成熟的、激活的樹突細(xì)胞可向T細(xì)胞呈遞抗原?？赏ㄟ^(guò)成熟的、激活的樹突細(xì)胞。可選擇地，可將已與抗原接觸(例如，在體內(nèi)在分離之前)的未成熟樹突細(xì)胞與組織培養(yǎng)基質(zhì)和樹突細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑接觸，從而產(chǎn)生被激活的成熟樹突細(xì)胞以誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。合適的預(yù)先確定的抗原可包括希望激活T細(xì)胞的任何抗原。這樣的抗原可包括，例如，細(xì)菌抗原、腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原(例如，完整的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞裂解物，例如來(lái)自成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、前列腺、或卵巢、乳腺、結(jié)腸、腦、黑素瘤或肺腫瘤細(xì)胞等的裂解物)、來(lái)自腫瘤的分離的抗原、融合蛋白、脂質(zhì)體等、病毒抗原和任何其他抗原或抗原例如肽或多肽抗原的片段。在某些實(shí)施方案中，抗原可以是例如但不限于前列腺特異性膜抗原(PSMA)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)或前列腺特異性抗原(PSA)。(參見，例如，P印sidero等人，Cs/cer40:2428-32(1980);McCormack等人，〃ro/og745:729—44(1995).)?？乖€可以是細(xì)菌細(xì)胞、細(xì)菌裂解物、來(lái)自細(xì)胞裂解物的膜片段或本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何其他來(lái)源?？杀磉_(dá)或重組產(chǎn)生或甚至化學(xué)合成抗原。重組抗原還可在宿主細(xì)胞(例如，細(xì)菌、酵母、昆蟲、脊推動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)的表面表達(dá)，可存在于裂解物中，或可從裂解物純化?？乖梢允强扇苄钥乖蝾w?？乖??？乖部纱嬖谟趤?lái)自受試者的樣品中。例如，來(lái)自受試者中過(guò)度增殖(hyperproliferative)或其他狀況的組織樣品可用作抗原的來(lái)源。可以例如通過(guò)生物活組織檢查或通過(guò)手術(shù)切除術(shù)獲得這樣的樣品。這樣的樣品可以例如用作裂解物或用作分離的制劑?？蛇x擇地，受試者(例如，癌癥患者)的細(xì)胞的膜制劑或已建立的細(xì)胞系也可用作抗原或抗原的來(lái)源。在示例性實(shí)施方案中，從手術(shù)樣品回收的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞裂解物可用作抗原的來(lái)源。例如，可在活組織檢查或手術(shù)切除時(shí)獲得的癌癥患者自已的腫瘤樣品可直接用于將抗原呈遞至樹突細(xì)胞或提供細(xì)胞裂解物以用于抗原呈遞?？蛇x擇地，可使用癌癥患者的腫瘤細(xì)胞的膜制劑。腫瘤細(xì)胞可以是成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、前列腺、肺、卵巢、乳腺、結(jié)腸、腦、黑素瘤或任何其他類型的腫瘤細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法從分離的肺瘤細(xì)胞制備裂解物和膜的制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，可在基質(zhì)上分離單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體，從基質(zhì)洗脫所述細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至生物反應(yīng)器或其他封閉系統(tǒng)例如組織培養(yǎng)袋。合適的組織培養(yǎng)袋包括例如STERICELL培養(yǎng)容器(NexellTherapeuticsInc.)或TEFLON培養(yǎng)袋(AmericanFluorosealCorp.)等。封閉系統(tǒng)可具有任何合適的大小或體積，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解這一點(diǎn)。合適的體積包括例如大約0.01升至大約5升，或大約0.01升至大約0.05升，甚至更大或更小的體積也是可能的且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。也可在基質(zhì)上培養(yǎng)單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體。例如，可將基質(zhì)上的單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體培養(yǎng)在生物反應(yīng)器(包括發(fā)酵罐)或組織培養(yǎng)瓶(culturevessel)例如，組織培養(yǎng)燒瓶、袋或板中培養(yǎng)。組織培養(yǎng)瓶、袋或板可具有任何合適的大小，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解到這一點(diǎn)。生物反應(yīng)器通常具有大約0.01至大約5升或大約0.01至大約0.05升的體積，盡管更大或更小的體積是可能的且在本發(fā)明的領(lǐng)域內(nèi)。通常，用于培養(yǎng)單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體的生物反應(yīng)器具有大約0.01至大約0.1升的體積?？捎萌魏魏线m量例如大約105個(gè)細(xì)胞至大約5x106個(gè)細(xì)胞/ml基質(zhì)的單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體接種生物反應(yīng)器。也可在封閉、無(wú)菌的系統(tǒng)中培養(yǎng)基質(zhì)上的單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體。培養(yǎng)和分化單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體，以獲得未成熟樹突細(xì)胞。合適的組織培養(yǎng)基包括AIM-V、RPMI1640、DMEM、X-VIV015等。組織培養(yǎng)基可補(bǔ)充以氨基酸、維生素、細(xì)胞因子例如粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素7(IL-7)或白細(xì)胞介素13(IL-13)、二價(jià)陽(yáng)離子等，以促進(jìn)單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體分化成未成熟樹突細(xì)胞。常用的細(xì)胞因子組合是各自大約500個(gè)單位/ml的GM-CSF和IL-4。通常，如果在基質(zhì)上培養(yǎng)單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體，以從基質(zhì)表面脫落的細(xì)胞的形式回收的成熟樹突細(xì)胞的數(shù)目是原代成熟樹突細(xì)胞。可培養(yǎng)單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體，進(jìn)行任何合適的時(shí)間。在某些實(shí)施方案中，用于將前體分化成未成熟樹突細(xì)胞的合適的培養(yǎng)時(shí)間可以是大約4至大約7天?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)員離已知的方法，例如通過(guò)使用標(biāo)記的單克隆抗體監(jiān)測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記例如CD14、CDllc、CD83、CD86、HLA-DR的存在或不存在來(lái)監(jiān)測(cè)未成熟樹突細(xì)胞從前體的分化。也可通過(guò)使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法分析基因表達(dá)的模式來(lái)確定樹突細(xì)胞的表型。未成熟樹突細(xì)胞的一般細(xì)胞表面表型是CD14—、CDllc+、CD83—、CD86—和HLA-DR+。也可以在合適的組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)未成熟樹突細(xì)胞，從而擴(kuò)增細(xì)胞群體和/或使未成熟樹突細(xì)胞保持原態(tài)以用于進(jìn)一步分化或抗原攝取、加工和呈遞。例如，可在GM-CSF和IL-4存在的情況下保持和/或擴(kuò)增未成熟樹突細(xì)胞。未成熟樹突細(xì)胞對(duì)于一些應(yīng)用可以是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈儽３至颂幚硇驴乖哪芰Α?參見，例如Koch等人，J.Immunol.155:93-100(1995))。相反地，成熟樹突細(xì)胞(例如，CD14—、CDllc+、CD83+、CD86+和HLA-DR+)，已暴露于抗原和加工抗原以及暴露于合適的成熟條件的成熟樹突細(xì)胞，通常已失去有效加工新抗原的能力?？蓪⒊墒鞓渫患?xì)胞與能夠與MHCI類和/或匪CII類分子結(jié)合的肽接觸以使其呈現(xiàn)在細(xì)胞表面。在培養(yǎng)期間，任意地，可將未成熟樹突細(xì)胞暴露于預(yù)先確定的抗原。合適的預(yù)先確定的抗原可如上包括希望激活T細(xì)胞的任何抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，在腫瘤裂解物(例如，膠質(zhì)細(xì)胞瘤、前列腺、卵巢、乳腺、結(jié)腸、腦、黑素瘤或腫瘤細(xì)胞等的裂解物)存在的情況下培養(yǎng)未成熟樹突細(xì)胞以用于癌癥免疫療法和/或腫瘤生長(zhǎng)抑制。其他抗原可包括例如細(xì)菌和病毒抗原、腫瘤細(xì)胞、純化的腫瘤細(xì)胞膜、腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原(例如，來(lái)自腫瘤的分離的抗原、融合蛋白、脂質(zhì)體等)、細(xì)菌細(xì)胞、細(xì)菌抗原、病毒顆粒、病毒抗原和任何其他抗原。此外，可在轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的表達(dá)抗原的宿主細(xì)胞的表面上、或抗原。在與抗原例如胂瘤細(xì)胞裂解物接觸后，可培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行任何合適的時(shí)間，以允許抗原攝取和加工，允許擴(kuò)增抗原特異性樹突細(xì)胞的群體等。也可使未成熟樹突細(xì)胞成熟為在MHCI類或MHCII類分子的背景下呈遞抗原的被激活的樹突細(xì)胞?？梢岳缤ㄟ^(guò)在其他已知的成熟劑不存在的情況下，在有助于樹突細(xì)胞附著至組織培養(yǎng)基質(zhì)的條件下，在組織培養(yǎng)基質(zhì)上和使用樹突細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行該成熟。通常，樹突細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑是GM-CSF和IL-4、IL-13或IL-15等。根據(jù)另一個(gè)方面，可將樹突細(xì)胞暴露于預(yù)先確定的抗原和定向成熟劑。當(dāng)單獨(dú)使用時(shí)，定向成熟劑不誘導(dǎo)單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體細(xì)胞的分化或不誘導(dǎo)未成熟樹突細(xì)胞的成熟，但通常，當(dāng)與激活方法組合時(shí)，指導(dǎo)DC朝向可誘導(dǎo)Th-l或Th-2反應(yīng)的細(xì)胞的細(xì)胞的成熟。干擾素Y是可誘導(dǎo)朝向Th-l反應(yīng)的誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)的偏向性的試劑的實(shí)例。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用暴露于預(yù)先確定的抗原的非成熟樹突細(xì)胞體外激活抗抗原的T細(xì)胞?？稍诒┞队诳乖罅⒓词褂脴渫患?xì)胞刺激T細(xì)胞?？蛇x擇地，可在暴露于抗原和T細(xì)胞之前，在細(xì)胞因子混合物(例如，GM-CSF和IL-4)存在的情況下保持樹突細(xì)胞，或可通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法冷藏保存樹突細(xì)胞以在以后使用。在特定的實(shí)施方案中，使用人樹突細(xì)胞刺激人T細(xì)胞?？蓮牟煌牧馨蜆咏M織獲得T細(xì)胞或T細(xì)胞亞型以用作應(yīng)答細(xì)胞。這樣的組織包括但不限于脾、淋巴結(jié)和外周血?？蓪⒎蛛x的或純化的T細(xì)胞以混合的T細(xì)胞群體的形式或以純化的T細(xì)胞亞群的形式與暴露于預(yù)先確定的抗原的樹突細(xì)胞共培養(yǎng)。例如，可將純化的CD8+T細(xì)胞與抗原暴露的樹突細(xì)胞共培養(yǎng)以引發(fā)抗原特異性CTL反應(yīng)。此外，CD4+T細(xì)胞的早期清除可防止CD4+細(xì)胞在CD8+和CD4+T細(xì)胞的混合培養(yǎng)物中過(guò)度生長(zhǎng)。可通過(guò)陽(yáng)性或陰性選擇包括但不限于使用針對(duì)CD2、CD3、CD4、CD6和/或CD8的抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞的純化?？蛇x擇地，可將CD4+和CD8+T細(xì)胞的混合群體與樹突細(xì)胞共培養(yǎng)以引發(fā)對(duì)獲得細(xì)胞毒性和T輔助免疫反應(yīng)的抗原是特異性的反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，可按照本發(fā)明的方法產(chǎn)生激活的CD8+或CD4+T細(xì)胞。一般地，用于產(chǎn)生抗原反應(yīng)性、激活的T細(xì)胞的成熟的、已接觸從該受試者獲得的)?？蛇x擇地，可使用來(lái)自HLA匹配的供體的非癌細(xì)胞(例如正常細(xì)胞)在體外制備具有與希望的受者受試者相同的HLA單元型的樹突細(xì)胞。在特定的實(shí)施方案中，體外擴(kuò)增抗原反應(yīng)性T細(xì)胞，包括CTL和Th-l輔助細(xì)胞以作為用于免疫刺激的細(xì)胞來(lái)源。細(xì)胞群體的體內(nèi)施用在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于給需要免疫刺激的受試者施用成熟的、已接觸抗原的樹突細(xì)胞或激活的，例如極化的T細(xì)胞或包含此類細(xì)胞的細(xì)胞群體的方法。此類細(xì)胞群體可包括成熟的、激活的樹突細(xì)胞群體和/或激活的例如極化的T細(xì)胞群體。在某些實(shí)施方案中，這樣進(jìn)行所述方法，即獲得樹突細(xì)胞前體或未成熟樹突細(xì)胞，通過(guò)與組織培養(yǎng)基質(zhì)、樹突細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑和預(yù)先確定的抗原接觸來(lái)分化和成熟這些細(xì)胞，從而形成經(jīng)引發(fā)誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)的成熟的激活的樹突細(xì)胞群體?？稍诩せ钪?、期間或之后將未成熟樹突細(xì)胞與抗原接觸?？芍苯訉?duì)需要免疫刺激的受試者施用成熟的或激活的樹突細(xì)胞。在相關(guān)實(shí)施方案中，可將激活的或成熟的成熟樹突細(xì)胞與來(lái)自受試者的淋巴細(xì)胞接觸以刺激淋巴細(xì)胞群體內(nèi)的T細(xì)胞?？蓪⒓せ畹?、極化的淋巴細(xì)胞(任意地之后在抗原反應(yīng)CD4+和/或CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行克隆擴(kuò)增)給需要免疫刺激的受試者施用。在某些實(shí)施方案中，激活的、極化的T細(xì)胞對(duì)于受試者是自體同源的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，樹突細(xì)胞、T細(xì)胞和受者受試者具有相同的單元型MHC(HLA)單元型。確定受試者的HLA單元型的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。在相關(guān)實(shí)施方案中，樹突細(xì)胞和/或T細(xì)胞對(duì)于受者受試者是同種異型的。例如樹突細(xì)胞對(duì)于具有相同MHC(HLA)單元型的T細(xì)胞和受者可以是同種異型的。同種異型細(xì)胞通常對(duì)于至少一個(gè)MHC等位基因是匹配的(例如，共有至少一個(gè)但非所有MHC等位基因)。在不太常見的實(shí)施方案中，樹突細(xì)胞、T細(xì)胞和受體接受者在相互之間全都同種異型，但全都共同具有至少一個(gè)共同的MHC等位基因。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，于從其獲得未成熟樹突細(xì)胞的相同受試者獲得T細(xì)胞。在體外成熟和極化后，將自體T細(xì)胞施用給受試者，從而激發(fā)和/或增強(qiáng)已存在的免疫反應(yīng)。例如，可通過(guò)例如以大約108至大約109個(gè)細(xì)胞/012身體表面積的劑量靜脈內(nèi)輸注來(lái)施用T細(xì)胞(參見，例如，Ridell等人，Science257:238-241(1992)，通過(guò)引用將其合并入本文)?？梢砸韵Ｍ拈g隔例如每月一次重復(fù)輸注?？稍赥細(xì)胞輸注期間和之后就不利效應(yīng)的任何跡象監(jiān)控受者。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，通過(guò)與新的、未使用的干凈的本發(fā)明的組織培養(yǎng)基質(zhì)接觸而成熟的樹突細(xì)胞可直接注射入腫瘤或包含靶抗原的其他組織。這樣的部分成熟的細(xì)胞可在體內(nèi)攝取抗原并將該抗原呈遞至T細(xì)胞。實(shí)施例下列實(shí)施例的提供僅僅用作本發(fā)明的不同方面的舉例說(shuō)明，不應(yīng)當(dāng)解釋為以任何方式限定本發(fā)明。實(shí)施例1:通過(guò)與組織培養(yǎng)基質(zhì)接觸進(jìn)行的單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體的成熟在本實(shí)施例中，在GM-CSF和IL-4存在此的情況下將就前體而富從組織培養(yǎng)系統(tǒng)收集未成熟樹突細(xì)胞，'對(duì)其進(jìn)行洗滌、^數(shù)和在新的干凈的組織培養(yǎng)瓶中與預(yù)先確定的抗原混合。在通常適用于樹突細(xì)胞保持的條件下在預(yù)先確定的可溶性抗原或顆粒抗原存在的情況下培養(yǎng)細(xì)胞，常用的樹突細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充以GM-CSF和IL-4。不向培養(yǎng)基中加入樹突細(xì)胞成熟劑。通過(guò)確定成熟樹突細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記特征的存在來(lái)確定樹突細(xì)胞在不加入樹突細(xì)胞成熟劑的情況下已成熟。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)在補(bǔ)充以1%的人血漿的OptiME薩培養(yǎng)基(Gibco-BRL)存在的情況下將外周血單核細(xì)胞與塑料接觸來(lái)制備未成熟DC?？赏ㄟ^(guò)清洗除去未結(jié)合的單核細(xì)胞。在每毫升500個(gè)單位的GM-CSF和500個(gè)單位的IL-4存在的情況下在X-VIV015@培養(yǎng)基中培養(yǎng)結(jié)合的單核細(xì)胞，進(jìn)行大約6至7天。通過(guò)漂洗收集未成熟的DC,用培養(yǎng)基清洗細(xì)胞。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，將清洗的DC與來(lái)自例如從接受治療的患者手術(shù)切除的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的腫瘤細(xì)胞裂解物混合。將上述具有GM-CSF和IL-4的培養(yǎng)基中的DC和裂解物加入新的干凈的未使用的組織培養(yǎng)皿中，并且培養(yǎng)大約12至大約20小時(shí)。在可選擇的實(shí)施方案中，可加入干擾素Y以誘導(dǎo)Th-l增強(qiáng)的反應(yīng)。收集、洗滌和制備激活的DC以對(duì)患者進(jìn)行施用。激活的DC的樣品用于通過(guò)用各自對(duì)于CD14、CD83、CD86和HLA-DR是特異性的抗體進(jìn)行標(biāo)記來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的表型。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析標(biāo)記的細(xì)胞以確定它們的表型。激活的DC顯示極少或沒有CD14,對(duì)于CD83是陽(yáng)性的，且表達(dá)高水平的CD86和HLA-DR，這正是成熟樹突細(xì)胞所預(yù)期的表型。將剩余部分的激活的DC以1x106個(gè)細(xì)胞至1x1(T個(gè)細(xì)胞/注射的量給患者施用。通過(guò)使用MHC四聚體分析測(cè)量T細(xì)胞反應(yīng)和/或通過(guò)ELISA測(cè)量對(duì)抗原的抗體反應(yīng)來(lái)評(píng)估抗原特異性免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)。實(shí)施例2:在成熟劑不存在的情況下激活的單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體細(xì)胞的細(xì)胞表面表型的確定在該實(shí)施例中，通過(guò)附著至塑料組織培養(yǎng)瓶中純化單核細(xì)胞，收獲細(xì)胞，洗滌細(xì)胞，將其重懸浮于新的組織培養(yǎng)瓶中進(jìn)行另外的培養(yǎng)時(shí)間。確定成熟樹突細(xì)胞標(biāo)記CD83的細(xì)胞表面表達(dá)。為了產(chǎn)生成熟DC，通過(guò)附著至塑料純化單核細(xì)胞，然后在具有GM-CSF和IL-4以及1%人AB血清的樹突細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)大約7天。大約7天后，收獲幾乎完全自由漂浮在培養(yǎng)基中的細(xì)胞，然后重新涂布在裝有樹突細(xì)胞培養(yǎng)基的未使用的干凈的聚苯乙烯組織培養(yǎng)瓶中，所述培養(yǎng)基具有GM-CSF和IL-4和大約1%的人AB血清。重新涂布的細(xì)胞在倒置顯微鏡下的目視觀察顯示大部分細(xì)胞緊緊附著至組織培養(yǎng)物表面。在重新涂布后20小時(shí)，細(xì)胞展示DC標(biāo)記物CD83的誘導(dǎo)。下列表提供了對(duì)分離的單核細(xì)胞的不同樣品的CD83染色。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實(shí)施例3:在不使用成熟劑的情況下激活的樹突細(xì)胞的臨床用途在該實(shí)施例中，檢測(cè)樹突細(xì)胞組合物的安全性和功效，所述樹突接觸的情況下，從多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者獲得的樹突細(xì)胞組合物。從手術(shù)切除的腫瘤組織制備腫瘤裂解物。將分離的腫瘤組織切碎放入裝有包含膠原蛋白酶的緩沖溶液的容器中以分離組織。讓該混合物在室溫下放置過(guò)夜。在確保組織消化的過(guò)濾后，將釋放的腫瘤細(xì)胞離心成沉淀。將細(xì)胞沉淀重懸浮于小體積的RPMI1640中，使之經(jīng)歷3次凍融循環(huán)。在凍融后，通過(guò)離心使腫瘤裂解物澄清，將包含蛋白質(zhì)的上清液通過(guò)0.22微米的過(guò)濾品過(guò)濾以進(jìn)行滅菌。通過(guò)在FICOLL梯度上純化白細(xì)胞分離法的產(chǎn)物，然后將其附著至塑料來(lái)制備就單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體而富集的細(xì)胞群體。附著細(xì)胞是在標(biāo)準(zhǔn)樹突細(xì)胞培養(yǎng)條件下在RPMI1640(補(bǔ)充以10%的AB人血清和各自500U/ml的hGM-CSF和hIL-4)中培養(yǎng)7天的單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體。在7天后，收獲、洗滌分化的未成熟樹突細(xì)胞，冷凍所述細(xì)胞以待曰后使用或在1%至104人AB血清和各自500U/ml的hGM-CSF和IL-4存在的情況下，將其與患者腫瘤裂解物混合并重新涂布新鮮組織培養(yǎng)瓶中。DC的終濃度是0.5至2百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml(通常lxl(T個(gè)細(xì)胞/ml)，腫瘤裂解物的終濃度是10至1000jag/ml(通常100/ag/ml)。在第一試驗(yàn)中，所述患者接受與來(lái)源于自體培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的腫瘤裂解物接觸的樹突細(xì)胞。研究是劑量增大研究，其中3人受試者接受1x106個(gè)DC，3位受試者接受5x106個(gè)DC，6個(gè)受試得接受10x106個(gè)DC。通過(guò)測(cè)量遲發(fā)型超敏感性(DTH反應(yīng))、細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)(CTL)和通過(guò)確定在疾病復(fù)發(fā)的情況下在再手術(shù)過(guò)程中浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的存在來(lái)估量免疫反應(yīng)。各個(gè)測(cè)定測(cè)量了誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的不同方面。DTH反應(yīng)通常是輔助T細(xì)胞(Th)活性的證據(jù)，然而CTL反應(yīng)測(cè)量誘導(dǎo)的反應(yīng)是否具有導(dǎo)致產(chǎn)生具有殺死腫瘤細(xì)胞的能力的T細(xì)胞。反應(yīng)后的腫瘤中檢測(cè)到的浸潤(rùn)T細(xì)胞測(cè)量了激活的T細(xì)胞是否具有遷移至肺瘤位置，從而原位殺死腫瘤細(xì)胞的能力。表2.免疫反應(yīng)的概述-第I期試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>a通過(guò)浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的數(shù)目的半主觀估量評(píng)分。n.a.，因?yàn)闆]有手術(shù)而不適用的。第二個(gè)試驗(yàn)也是劑量增大研究，4位受試者接受1x106個(gè)DC/注射，6位受試者接受5x1(je個(gè)DC/注射，6位受試者接受10x106個(gè)DC/注射。在該研究中，腫瘤裂解物來(lái)源于從各特定的患者切除的腫瘤，將裂解物與來(lái)源于該患者的DC接觸。通過(guò)在接種后對(duì)抗原特異性CD8+T細(xì)胞進(jìn)行四聚體染色和，如果適用的話，通過(guò)在再手術(shù)時(shí)確定浸潤(rùn)的瘤內(nèi)T細(xì)胞的存在來(lái)估量免疫反應(yīng)。通常，可在疾病復(fù)發(fā)后進(jìn)行再手術(shù)?；颊咧械?3位具有最近診斷的多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)，2位具有復(fù)發(fā)的GBM，1位具有復(fù)發(fā)的III級(jí)少枝星形細(xì)胞瘤。通過(guò)抗原特異性T細(xì)胞的四聚體染色進(jìn)行的免疫反應(yīng)的評(píng)估允許確定循環(huán)T細(xì)胞的存在和定量循環(huán)T細(xì)胞的水平，所述循環(huán)T細(xì)胞表達(dá)對(duì)于給定的抗原是特異性的T細(xì)胞受體。這樣的T細(xì)胞，如果也表達(dá)CD8，被認(rèn)為是抗這些抗原的CTL群體的代表。選擇用于該研究的抗原已知為已通過(guò)組織學(xué)方法顯示存在于最初切除的腫瘤中的胂瘤抗原。使用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)腫瘤相關(guān)抗原(包括GplOO(黑素瘤相關(guān)腫瘤抗原，也在GBM中發(fā)現(xiàn)的)、Trp-2(酪氨酸酶(tyroinase)相關(guān)蛋白2)、Her-2(表皮生長(zhǎng)因子受體相關(guān)受體酶氨酸激酶)和CMV(細(xì)胞巨化病毒)的反應(yīng)性。在7位患者中嘗試用于抗原特異性CD8+T細(xì)胞的四聚體染色，在5位患者中檢測(cè)到陽(yáng)性反應(yīng)。在5位反應(yīng)患者中，2位已用1x106個(gè)DC進(jìn)行了免疫，3個(gè)已用10x1(^個(gè)DC進(jìn)行了免疫。這些結(jié)果表明通過(guò)本發(fā)明的方法成熟的DC能夠在大部分患者中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。在大多數(shù)情況下，該反應(yīng)包括抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。前述實(shí)施例的提供是用于舉例說(shuō)明而非限定本發(fā)明的范圍的。本發(fā)明的其他變型對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是很顯然的，且由所附權(quán)利要求所包括。所有此處引用的出版物、專利、專利申請(qǐng)和其他參考資料也以其全文通過(guò)引用包含入本文。權(quán)利要求1.用于產(chǎn)生包含富集的激活的樹突細(xì)胞的群體的細(xì)胞群體的方法，該方法包括在適合未成熟樹突細(xì)胞附著至組織培養(yǎng)基質(zhì)和適合于樹突細(xì)胞的體外培養(yǎng)的條件下，將包含富集的未成熟樹突細(xì)胞的群體的細(xì)胞群體與組織培養(yǎng)基質(zhì)和具有樹突細(xì)胞分化劑的培養(yǎng)基接觸，進(jìn)行足以使激活的樹突細(xì)胞成熟的時(shí)間。2.權(quán)利要求1的方法，其中在與組織培養(yǎng)基質(zhì)接觸之前、同時(shí)或之后將預(yù)先確定的抗原與細(xì)胞群體接觸。3.權(quán)利要求2的方法，其中預(yù)先確定的抗原是腫瘤特異性抗原、腫瘤相關(guān)抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、腫瘤細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、表達(dá)抗原的重組細(xì)胞、細(xì)胞裂解物、膜制劑、重組產(chǎn)生的抗原、肽或分離的抗原。4.權(quán)利要求3的方法，其中從腦腫瘤、前列腺腫瘤、前列腺組織、卵巢腫瘤、乳腺腫瘤、乳腺組織、白血病細(xì)胞群體、肺腫瘤、黑素瘤、膀胱腫瘤或腫瘤細(xì)胞系獲得細(xì)胞裂解物或膜制劑。5.權(quán)利要求4的方法，其中腦腫瘤是多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤或少枝星形細(xì)胞瘤。6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其中樹突細(xì)胞分化劑是GM-CSF、IL-4、IL-13、IL-15或其組合。7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中未成熟樹突細(xì)胞來(lái)源于就單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體而富集的細(xì)胞群體。8.權(quán)利要求7的方法，其中將就單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體而富集的細(xì)胞群體與樹突細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑接觸。9.權(quán)利要求8的方法，其中樹突細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑是GM-CSF、IL-4、IL-13或IL-15和其組合。10.權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)的方法，其中單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體來(lái)自患者或來(lái)自HLA匹配的個(gè)體。11.權(quán)利要求3至9中任一項(xiàng)的方法，其中腫瘤細(xì)胞和樹突細(xì)胞來(lái)自患者。12.權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的方法，其中將未成熟樹突細(xì)胞進(jìn)一步與定向成熟劑接觸。13.權(quán)利要求12的方法，其中定向成熟劑是干擾素Y。14.用于激活未成熟樹突細(xì)胞的方法，該方法包括在適合于未成熟樹突細(xì)胞的體外培養(yǎng)和適合于未成熟樹突細(xì)胞附著組織培養(yǎng)基質(zhì)的條件下，將未成熟樹突細(xì)胞與組織培養(yǎng)基質(zhì)和樹突細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑接15.權(quán)利要求14的方法，該方法進(jìn)一步包括在將未成熟樹突細(xì)胞與組織培養(yǎng)基質(zhì)接觸之前、同時(shí)或之后，將未成熟樹突細(xì)胞與預(yù)先確定的抗原接觸。16.權(quán)利要求15的方法，其中預(yù)先確定的抗原是腫瘤特異性抗原、腫瘤相關(guān)抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、腫瘤細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、表達(dá)抗原的重組細(xì)胞、細(xì)胞裂解物、膜制劑、重組產(chǎn)生的抗原、肽或分離的抗原。17.權(quán)利要求16的方法，其中細(xì)胞裂解物或膜制劑來(lái)源于腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞系。18.權(quán)利要求17的方法，其中從腦腫瘤、前列腺腫瘤、卵巢腫瘤、乳腺腫瘤、肺腫瘤、黑素瘤、膀胱腫瘤或白血病細(xì)胞群體獲得腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞系。19.權(quán)利要求18的方法，其中腦腫瘤是多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤或少枝星形細(xì)胞瘤。20.權(quán)利要求14至19中任一項(xiàng)的方法，其中樹突細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑是GM-CSF、IL-4、IL-13、IL-15或其組合。21.權(quán)利要求14至20中任一項(xiàng)的方法，其中將未成熟樹突細(xì)胞與定向成熟劑進(jìn)一步接觸。22.權(quán)利要求21的方法，其中定向成熟劑是干擾素Y。23.用于激活T細(xì)胞的方法，該方法包括將T細(xì)胞與樹突細(xì)胞群體和預(yù)先確定的抗原接觸，所述樹突細(xì)胞群體是通過(guò)在有助于未成熟樹突細(xì)胞附著至組織培養(yǎng)基質(zhì)的條件下，與組織培養(yǎng)基質(zhì)和樹突細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑接觸而成熟的樹突細(xì)胞群體。24.用于產(chǎn)生激活的抗原特異性T細(xì)胞的方法，該方法包括將分離的未成熟樹突細(xì)胞與預(yù)先確定的抗原接觸；在有助于未成熟樹突細(xì)胞附著至組織培養(yǎng)基質(zhì)的條件下，將分離的未成熟樹突細(xì)胞與組織培養(yǎng)基質(zhì)和樹突細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑接觸以激活未成熟樹突細(xì)胞；和將激活的樹突細(xì)胞與幼稚型T細(xì)胞接觸以形成激活的抗原特異性T細(xì)胞。25.權(quán)利要求24的方法，其中預(yù)先確定的抗原是腫瘤特異性抗原、腫瘤相關(guān)抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、腫瘤細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、表達(dá)抗原的重組細(xì)胞、細(xì)胞裂解物、膜制劑、重組產(chǎn)生的抗原、肽抗原或分離的抗原。26.權(quán)利要求25的方法，其中從腦肺瘤、前列腺腫瘤、前列腺組織、卵巢肺瘤、白血病細(xì)胞群體、肺肺瘤、乳腺腫瘤或膀胱腫瘤獲得細(xì)胞裂解物或膜制劑。27.權(quán)利要求26的方法，其中腦腫瘤是多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤或少枝星形細(xì)胞瘤。28.權(quán)利要求24至27中任一項(xiàng)的方法，該方法作為第一步驟的包含在分化誘導(dǎo)劑存在的情況下培養(yǎng)單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體以形成未成熟樹突細(xì)胞。29.權(quán)利要求28的方法，其中分化誘導(dǎo)劑是GM-CSF、白細(xì)胞介素4、GM-CSF和白細(xì)胞介素4的混合物或白細(xì)胞介素13。30.權(quán)利要求28和29的方法，其中從人受試者分離單核細(xì)胞樹突細(xì)胞前體。31.權(quán)利要求30的方法，其中未成熟樹突細(xì)胞和T細(xì)胞相互之間是自體同源的。全文摘要本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)未成熟樹突細(xì)胞(DC)成熟和用于在不使用樹突細(xì)胞成熟劑的情況下激活這些細(xì)胞的方法。激活的DC可用于誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)。本發(fā)明的方法也可包括加入定向成熟劑例如干擾素γ以在獲得的反應(yīng)中誘導(dǎo)Th-1和/或Th-2傾向(bias)。本發(fā)明還提供了用于激活和誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞的樹突細(xì)胞群體。類似地，提供了激活的抗原特異性T細(xì)胞群體和產(chǎn)生所述T細(xì)胞群體的方法。文檔編號(hào)C12N5/00GK101336291SQ200680052028公開日2008年12月31日申請(qǐng)日期2006年12月8日優(yōu)先權(quán)日2005年12月8日發(fā)明者A·L·博因頓,M·L·博希申請(qǐng)人:西北生物治療藥物公司