專利名稱：制備和儲(chǔ)存活化的、成熟樹突細(xì)胞的體系和方法
制備和儲(chǔ)存活化的、成熟樹突細(xì)胞的體系和方法
發(fā)明背景
癌癥研究已經(jīng)取得了明顯進(jìn)步，這些進(jìn)步使得許多類型的惡性腫瘤的死亡率穩(wěn)定下降。這種死亡率的下降已經(jīng)受到早期檢測的改進(jìn)、先進(jìn)的外科手術(shù)技術(shù)和新治療干預(yù)的應(yīng)用的影響。鑒于在降低癌癥相關(guān)死亡率中的成功，研究已經(jīng)轉(zhuǎn)向了以針對癌癥的新型靶向治療為中心，其中疫苗的開發(fā)已經(jīng)處于最前沿。疫苗在降低由病原體導(dǎo)致的死亡率中是高度有效的，這是因?yàn)樗鼈兗せ蠲庖呦到y(tǒng)和賦予外源抗原免疫性的能力。不僅有效地接種疫苗有助于降低死亡率，而且疫苗引起長期的免疫性，該免疫性保護(hù)免受多發(fā)性感染。
正是疫苗發(fā)展免疫性的這種能力最初引起開發(fā)癌癥疫苗的興趣。顯然，所有形式的癌癥疫苗在誘導(dǎo)針對為靶選擇的腫瘤抗原的免疫應(yīng)答中已經(jīng)顯示至少一定程度的成功。 雖然癌癥疫苗在用作單一療法時(shí)，尤其是在晚期疾病情況中，一般是令人失望的(Terrando 等，2007，Vaccine 25，4-16 ；Burgdorf 等，2008，Oncol. Rep. 20 (6)，1305 - 1311)，但最近的研究表明樹突細(xì)胞(DC)疫苗可能影響患者的生存。
當(dāng)前，用于免疫治療的方法通常結(jié)合體外刺激的抗原呈遞細(xì)胞(APC)，其中DC前體在從患者收集后立即進(jìn)行培養(yǎng)，然后負(fù)載抗原的DC在收獲后被盡快輸注到患者中。這種方法造成了時(shí)間約束，其不僅限制DC的潛在治療用途，而且還使免疫治療過程中在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)從患者提取產(chǎn)物成為必要。
除了抗原呈遞之外，據(jù)認(rèn)為DC在成熟后通過以細(xì)胞因子和趨化因子的方式產(chǎn)生各種信號分子，能進(jìn)一步影響免疫應(yīng)答。然而，之前的DC免疫治療方法并不利用成熟的DC。 此外，之前關(guān)于DC的成熟的工作并不充分最佳化成熟過程以利用DC信號產(chǎn)生。
因?yàn)樨?fù)載抗原的、成熟DC已經(jīng)加工了抗原，并且具有將抗原遞呈到免疫細(xì)胞的能力，這些細(xì)胞在活化后不僅能快速產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答，而且，它們也能產(chǎn)生信號，以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)免疫應(yīng)答。毫無疑問，負(fù)載抗原的、成熟DC的有效冷藏能使方法快速產(chǎn)生功能上有效的細(xì)胞，用于免疫治療。這種細(xì)胞的冷藏尚未被有效證明。因此，在本領(lǐng)域中，對以保持新產(chǎn)生的DC的有效抗原呈遞和信號分泌特征的方式冷藏活化的DC的有效和定向的方法存在長期的需求。本發(fā)明滿足該需要。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明包括產(chǎn)生負(fù)載抗原的、活化的樹突細(xì)胞(DC)以用于免疫治療的方法，所述方法包括裝載至少一種抗原到DC中；用至少一種TLR激動(dòng)劑活化所述DC ;冷藏(或深低溫保藏，cryopreserve)所述DC ;和解凍(或融化)所述DC ;其中所述DC產(chǎn)生有效量的至少一種細(xì)胞因子，以產(chǎn)生T細(xì)胞應(yīng)答。
在一個(gè)實(shí)施方式中，抗原是腫瘤抗原。在另一實(shí)施方式中，抗原是微生物抗原。在再一實(shí)施方式中，TLR激動(dòng)劑是LPS。在再一實(shí)施方式中，冷藏包括在約-70°C或更低的溫度下冷凍所述DC。在再一實(shí)施方式中，解凍后DC的回收和存活率大于或等于約70%。在再一實(shí)施方式中，解凍后DC的回收和存活率大于或等于約80%。在再一實(shí)施方式中，DC被冷藏至少約一周。在再一實(shí)施方式中，細(xì)胞因子是IL12。在再一實(shí)施方式中，DC顯示殺傷作用，由此所述DC能夠裂解靶向的癌細(xì)胞。
本發(fā)明還包括在哺乳動(dòng)物中引起免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括將之前冷藏的組合物施用到需要其的哺乳動(dòng)物中，所述組合物包括負(fù)載抗原的、活化的DC，其中所述DC負(fù)載抗原，并在冷藏前被活化。
在一個(gè)實(shí)施方式中，抗原是腫瘤抗原。在另一實(shí)施方式中，抗原是微生物抗原。在再一實(shí)施方式中，TLR激動(dòng)劑是LPS。在再一實(shí)施方式中，冷藏包括在約-70°c或更低的溫度下冷凍所述DC。在再一實(shí)施方式中，解凍后DC的回收和存活率大于或等于約70%。在再一實(shí)施方式中，解凍后DC的回收和存活率大于或等于約80%。在再一實(shí)施方式中，DC被冷藏至少約一周。在再一實(shí)施方式中，細(xì)胞因子是IL12。在再一實(shí)施方式中，DC顯示殺傷作用，由此所述DC能夠裂解靶向的癌細(xì)胞。
本發(fā)明還包括用于在哺乳動(dòng)物中引起免疫應(yīng)答的可保存組合物，該組合物包括 負(fù)載有至少一種抗原的DC ;其中所述DC已通過暴露于至少一種TLR激動(dòng)劑而被活化；和， 其中所述DC產(chǎn)生有效量的至少一種細(xì)胞因子，以產(chǎn)生T細(xì)胞應(yīng)答，無論所述組合物是否已經(jīng)被冷藏。
在一個(gè)實(shí)施方式中，抗原是腫瘤抗原。在另一實(shí)施方式中，抗原是微生物抗原。在再一實(shí)施方式中，TLR激動(dòng)劑是LPS。在再一實(shí)施方式中，組合物在約-70°C或更低的溫度下被冷藏。在再一實(shí)施方式中，解凍后DC的回收和存活率大于或等于約70%。在再一實(shí)施方式中，解凍后DC的回收和存活率大于或等于約80%。在再一實(shí)施方式中，組合物被冷藏至少約一周。在再一實(shí)施方式中，細(xì)胞因子是IL12。在再一實(shí)施方式中，DC顯示殺傷作用，由此所述DC能夠裂解靶向的癌細(xì)胞。附圖
簡介
為了闡釋本發(fā)明，在附圖中描述了本發(fā)明的某些實(shí)施方式。然而，本發(fā)明并不限于附圖中所描述的實(shí)施方式的精確排列和手段。
圖I比較常規(guī)DC (vac-DC)和ICAIT-DC產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子組，以及由此這些細(xì)胞能夠裂解乳腺癌細(xì)胞系的殺傷作用。
圖2描述常規(guī)成熟的DC和ICAIT-DC均成功敏化針對腫瘤抗原的T細(xì)胞，但僅 ICAIT-DC調(diào)節(jié)T細(xì)胞真正識(shí)別表達(dá)HER-2的腫瘤。
圖3——包括圖3A和3B——描述新鮮的ICAIT-DC對比冷藏并解凍的ICAIT-DC的可比較的存活率和回收率。利用錐蟲藍(lán)排除，在冷藏前和解凍并洗滌(通過離心)冷藏的細(xì)胞后立即測定冷藏的ICAIT DC的存活率和回收率。圖3A描述二批處理組的三個(gè)單例， 而圖3B描述二批處理組的兩個(gè)單例。存活率在新鮮制備和冷藏的DCl中是具有可比性的。 冷藏的DCl的回收率通常在80-90%之間，比新鮮制備的DCl好得多，這是由于通過收獲新鮮制備的DCl而損失了細(xì)胞。
圖4——包括圖4A-4F——描述DCl從冷藏解凍后優(yōu)異的IL12生產(chǎn)水平。信號3 的繼續(xù)產(chǎn)生(IL12)通過ELISA分析來測量。圖4A描述在新鮮和冷藏的細(xì)胞因子介導(dǎo)的 DC(CMDC)中的IL12的產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于在新鮮DCl和冷藏的DCl中觀察到的IL12的產(chǎn)量。圖 4B描述在冷藏前、解凍后兩小時(shí)后和解凍后12小時(shí)時(shí)，在DCl中的IL12的產(chǎn)量。圖4C-4F 描述冷藏的DCl與從冷藏的單核細(xì)胞制備的DCl的IL12產(chǎn)量的比較。
圖5描述在冷藏的DCl中與來自冷藏的單核細(xì)胞的DCl中測量的IFN Y水平的比較。純化的異源⑶4細(xì)胞(I X IO6/孔)的兩個(gè)樣品與冷藏的TLR激動(dòng)劑刺激的DC (I X IO5/ 孔)共同培養(yǎng)，與從冷藏的單核細(xì)胞制備的DCl比較。9天以后，收獲T細(xì)胞并在涂有抗CD3 和抗⑶28抗體的板上再刺激。24小時(shí)后，在上清液中分析IFNy水平(由T細(xì)胞產(chǎn)生)。
圖6描述CD4+CD25+T細(xì)胞在不成熟的、但不是DCl的樹突細(xì)胞存在下抑制反應(yīng)淋巴細(xì)胞增殖。2. 5 X IO5個(gè)CFSE標(biāo)記的未分級的(unfractionated)反應(yīng)淋巴細(xì)胞與IXlO5 個(gè)不成熟樹突細(xì)胞(iDC)、成熟的樹突細(xì)胞——利用IFN- Y /LPS (LPS活化的DC)、或成熟的樹突細(xì)胞——利用常規(guī)細(xì)胞因子混合物(CMM)，共同培養(yǎng)5天。I. 25X IO5個(gè)儲(chǔ)存的、分級的 ⑶4+⑶25+T細(xì)胞(U如所指明地被包括在內(nèi)。針對⑶4-級(gated)和⑶8-級的T細(xì)胞顯示反應(yīng)淋巴細(xì)胞增殖。顯示的數(shù)據(jù)代表10個(gè)試驗(yàn)。也顯示⑶4-陽性應(yīng)答細(xì)胞在T,egs和在共同培養(yǎng)前用LPS短暫處理(15分鐘)的不成熟樹突細(xì)胞的存在下的增殖。
圖7——包括圖7A-7D——描述由不依賴于IL-6和IL-12的可溶因子產(chǎn)生的DCl 樹突細(xì)胞對Treg功能的抑制。圖7A描述與I X IO5個(gè)不成熟的樹突細(xì)胞或LPS活化的樹突細(xì)胞共同培養(yǎng)的I. 25X IO5個(gè)分選的、純化的I；egs。顯示24小時(shí)后凋亡標(biāo)記膜聯(lián)蛋白-V 和7-AAD 24的表達(dá)。柱狀圖總結(jié)同時(shí)表達(dá)兩個(gè)標(biāo)記(+/+)、僅表達(dá)膜聯(lián)蛋白-V (+/_)、僅表達(dá)7-AAD(-/+)、或均不表達(dá)(-/_)的細(xì)胞的百分比。圖7B描述I. 25X IO5個(gè)分選的、純化的Iregs與2. 5 X IO5個(gè)CFSE標(biāo)記的未分級的反應(yīng)淋巴細(xì)胞在I X IO5個(gè)不成熟的或LPS活化的樹突細(xì)胞存在下共同培養(yǎng)，如所指明的。此外，I X IO5個(gè)不成熟的或LPS活化的樹突細(xì)胞被加入到放直在培養(yǎng)孔(culturewell)中的半透性Tran.swell fl旲中，如所指明的。圖7C 描述I. 25 X IO5個(gè)分選的、純化的T,egs與2. 5 X IO5個(gè)CFSE標(biāo)記的未分級的反應(yīng)淋巴細(xì)胞和 I X IO5個(gè)LPS活化的樹突細(xì)胞在5 μ g/mL中和抗-IL-6或抗-IL-12抗體存在下共同培養(yǎng)。 顯示的數(shù)據(jù)代表每一實(shí)例中至少3個(gè)單獨(dú)的試驗(yàn)。圖7D描述Tregs或CFSE標(biāo)記的未分級的反應(yīng)淋巴細(xì)胞，其在500 μ L培養(yǎng)基和加入LPS (I X IO6個(gè)細(xì)胞/mL)后約10小時(shí)取自LPS 活化的樹突細(xì)胞培養(yǎng)物的500 μ L培養(yǎng)基中培養(yǎng)。24小時(shí)之后，這些“處理”的群體用于以如所指明的常規(guī)比例(I:2，Tregs:應(yīng)答細(xì)胞)進(jìn)行共同培養(yǎng)。數(shù)據(jù)代表2個(gè)單獨(dú)的試驗(yàn)。
圖8——包括圖8Α和8Β——描述阻抑因子⑶4+⑶25+Τ細(xì)胞在DCl樹突細(xì)胞存在下分泌效應(yīng)細(xì)胞因子。圖8Α描述與2. OX IO5個(gè)不成熟的或LPS活化的樹突細(xì)胞結(jié)合的 2. 5Χ105個(gè)分選的CD4+CD25+(I；eg)或CD4+CD25_(Teff)T細(xì)胞。在第5天收獲上清液，并用ELISA測量上清液中存在的IFN- Y的量。在第5天，一些培養(yǎng)樣品被透化，并且，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)IFN- Y。34. 4%的⑶4T細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)IFN- y (N=3)。圖8B描述 I. 25X IO5個(gè)⑶4+⑶25+T細(xì)胞，其與I X IO5個(gè)不成熟的或LPS活化的DC共同培養(yǎng)。中和抗-IL12抗體(5 μ g/mL)包含在一些樣品中。在48小時(shí)時(shí)，收集細(xì)胞、透化，并且，通過細(xì)胞內(nèi)染色檢測T-bet和FoxP3的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。顯示的數(shù)據(jù)被分級為(gated)⑶4-陽性細(xì)胞 (N=3)。
詳細(xì)描述
本發(fā)明涉及開發(fā)和冷藏成熟的、負(fù)載抗原的DC，所述DC由Toll樣受體激動(dòng)劑活化，以誘發(fā)臨床上有效的免疫應(yīng)答，優(yōu)選在疾病過程的早期中使用時(shí)誘發(fā)臨床上有效的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的DC通過產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子能夠調(diào)向強(qiáng)的Thl細(xì)胞應(yīng)答，并且還能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本發(fā)明的DC開發(fā)技術(shù)也提供平臺(tái)，來靶向新的分子和癌干細(xì)胞，其能消除具有高轉(zhuǎn)移潛力的細(xì)胞。本發(fā)明也涉及以在解凍后保持它們呈遞抗原以及產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和趨化因子的潛能和功能性的方式來冷藏這些活化的DC。
定義
如本文中所使用的，以下每一術(shù)語具有與其在該部分有關(guān)的含義。
冠詞“一(a和an)”在本文中用來指一個(gè)或一個(gè)以上(即，至少一個(gè))該冠詞的語法對象。舉例來說，“一個(gè)元件(an element) ”意為一個(gè)或一個(gè)以上的元件。
術(shù)語“約”將被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解，并且，將在一定程度上根據(jù)其被應(yīng)用的上下文而變化。
如本文中所使用的，術(shù)語“抗體”是指免疫球蛋白分子，其能夠特異性結(jié)合抗原上的特定表位。抗體可以是衍生自天然源或來自重組源的完整免疫球蛋白，還可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分?？贵w通常是免疫球蛋白分子的四聚物。本發(fā)明中的抗體可以以各種形式存在，包括例如多克隆抗體、單克隆抗體、Fv, Fab和F(ab)2以及單鏈抗體和人源化抗體(Harlow 等,1988 ；Houston 等,1988 ；Bird 等,1988)。
如本文中所使用的，術(shù)語“抗原”或“ag”被定義為引起免疫應(yīng)答的分子。這種免疫應(yīng)答可以包括抗體產(chǎn)生或者特定免疫活性(感受態(tài)，competent)細(xì)胞的活化,或者兩者。 本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)理解，任何高分子——事實(shí)上包括所有蛋白質(zhì)或肽——均可用作抗原。此外，抗原可衍生自重組或基因組DNA。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，包括編碼引起免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因而編碼“抗原”，其與本文中使用的術(shù)語一樣。此外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，抗原不必僅僅由基因的全長核苷酸序列編碼。顯而易見的是，本發(fā)明包括、但不限于使用一個(gè)以上基因的部分核苷酸序列，以及這些核苷酸序列以各種組合排列，以引起期望的免疫應(yīng)答。另外，技術(shù)人員將理解，抗原根本不必由“基因”編碼。顯而易見的是，抗原可以通過合成產(chǎn)生或者可以衍生自生物學(xué)樣品。這種生物學(xué)樣品可以包括、但不限于組織樣品、腫瘤樣品、細(xì)胞或生物流體。
“抗原呈遞細(xì)胞” (APC)是能夠活化T細(xì)胞的細(xì)胞，其包括、但不限于單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和樹突細(xì)胞(DC)。
術(shù)語“樹突細(xì)胞”或“DC”是指淋巴或非淋巴組織中發(fā)現(xiàn)的形態(tài)學(xué)上相似的細(xì)胞類型的不同群體的任何成員。這些細(xì)胞的特征在于其不同的形態(tài)和高水平表面MHC-II級表達(dá)。DC可分離自一些組織源。DC具有高的敏化MHC限制的T細(xì)胞的能力，并且，非常有效地原位呈遞抗原到T細(xì)胞?？乖梢允亲泽w抗原和外源抗原，所述自體抗原在T細(xì)胞發(fā)育和耐受過程中被表達(dá)，所述外源抗原在正常免疫過程中存在。
如本文中所使用的，“活化的DC”是已經(jīng)暴露于Toll樣受體激動(dòng)劑的DC?；罨?DC可以或者可以不負(fù)載有抗原。
如本文中所使用的，術(shù)語“成熟的DC”被定義為這樣的樹突細(xì)胞，其表達(dá)分子，包括高水平的MHC II級、⑶80(B7. I)和⑶86 (B7. 2)。相反地，不成熟樹突細(xì)胞表達(dá)低水平的 MHC II級、⑶80(B7. I)和CD86 (B7. 2)分子，并仍能捕獲抗原。
“負(fù)載抗原的APC”或“抗原脈沖的(antigen-pulsed) APC”包括APC，其被暴露于抗原并被抗原活化。例如，APC可以成為體外負(fù)載的Ag，例如在抗原存在下的培養(yǎng)期間。APC 也可以通過暴露于抗原在體內(nèi)負(fù)載。“負(fù)載抗原的APC”以如下一種或兩種方式被常規(guī)制備 ⑴小肽片段，稱為抗原肽，被直接“脈沖”到APC的外面；或⑵用全蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)顆粒溫育APC，然后通過APC來消化這些蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)被APC消化成小肽片段，并最終運(yùn)輸并呈遞到APC表面上。此外，負(fù)載抗原的APC也可以通過將編碼抗原的多核苷酸引入到細(xì)胞中來產(chǎn)生。
如本文中所使用的，術(shù)語“自身免疫性疾病”被定義為由自身免疫應(yīng)答導(dǎo)致的病癥。自身免疫性疾病是對自體抗原的不當(dāng)或過度應(yīng)答的結(jié)果。自身免疫性疾病的實(shí)例包括、 但不限于阿狄森病、局限性脫發(fā)、強(qiáng)直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克羅恩病、糖尿病(I型)、貧養(yǎng)表皮水泡癥、附睪炎、腎小球性腎炎、格雷夫斯病、格-巴二氏綜合征、橋本氏病、溶血性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、尋常天庖瘡、牛皮癬、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肉樣瘤病、硬皮病、斯耶格倫氏綜合怔、脊椎關(guān)節(jié)炎、甲狀腺炎、血管炎、白斑、粘液性水腫、惡性貧血、潰瘍性結(jié)腸炎等等。
如本文中所使用的，術(shù)語“自體的”意指衍生自同一個(gè)體的任何材料，稍后該材料將被重新引入到該個(gè)體。
如本文中所使用的，術(shù)語“癌”被定義為以異常細(xì)胞的快速和不受控制的生長為特征的疾病。癌細(xì)胞可以局部擴(kuò)散或者通過血流和淋巴系統(tǒng)擴(kuò)散到身體的其它部分。各種癌癥的實(shí)例包括、但不限于、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、 腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。
如本文中所使用的，術(shù)語“冷藏的”或“冷藏”是指被重新懸浮在低溫培養(yǎng)基 (cryomedium)中并在大約-70°C或更低的溫度下冷凍的細(xì)胞。
如本文中所使用的，術(shù)語“低溫培養(yǎng)基”是指任何這樣的培養(yǎng)基，其混合有細(xì)胞樣品，被制備用于冷凍，以便細(xì)胞樣品中的至少一些細(xì)胞可以被回收并在解凍后保持存活。
“供體抗原”是指由待被移植到受體的供體組織表達(dá)的抗原。
“受體抗原”是指對供體抗原的免疫應(yīng)答的靶標(biāo)。
如本文中所使用的，“效應(yīng)細(xì)胞”是指介導(dǎo)針對抗原的免疫應(yīng)答的細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞的實(shí)例包括、但不限于T細(xì)胞和B細(xì)胞。
如本文中所使用的，“內(nèi)源的”是指來自或產(chǎn)生自生物體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)內(nèi)部的任何物質(zhì)。
如本文中所使用的，術(shù)語“外源的”是指從生物體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)引入或產(chǎn)生自其外面的任何物質(zhì)。
如本文中所使用的，術(shù)語“表位”被定義為抗原上的小化學(xué)分子，其能引起免疫應(yīng)答——包括B和/或T細(xì)胞應(yīng)答。抗原可以具有一個(gè)或多個(gè)表位。大部分抗原具有許多表位；即，它們是多價(jià)的。通常，表位的大小為大約5個(gè)氨基酸和/或糖。本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解，通常，總體三維結(jié)構(gòu)——而不是分子的具體線性序列——是抗原特異性的主要標(biāo)準(zhǔn)， 因而使得表位彼此區(qū)分開。
如本文中所使用的，術(shù)語“輔助細(xì)T細(xì)胞”被定義為效應(yīng)T細(xì)胞，其主要功能是促進(jìn)其它B和T淋巴細(xì)胞和或巨噬細(xì)胞的活化和功能。大部分輔助細(xì)T細(xì)胞是CD4T細(xì)胞。
如本文中所使用的，“免疫原”是指能夠在哺乳動(dòng)物中刺激或誘導(dǎo)體液抗體和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的物質(zhì)。
如本文中所使用的，術(shù)語“免疫球蛋白”或“Ig”被定義為用作抗體的一類蛋白質(zhì)。 這類蛋白質(zhì)中包括的五個(gè)成員是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是初級抗體，其存在于身分泌物中，如唾液、眼淚、母乳、胃腸分泌物和呼吸道和生殖泌尿道的黏液分泌物。IgG是最常見的循環(huán)抗體。IgM是主要的免疫球蛋白，其在大部分哺乳動(dòng)物的初次免疫應(yīng)答中產(chǎn)生。 它在凝集、補(bǔ)體固定和其它抗體應(yīng)答中是最有效的免疫球蛋白，并且，在防御細(xì)菌和病毒中是重要的。IgD是沒有已知抗體功能的免疫球蛋白，但是，其可以用作抗原受體。IgE是通過在暴露于變應(yīng)原后引起介體從肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞釋放而介導(dǎo)速發(fā)型過敏的免疫球蛋白。
如本文中所使用的，術(shù)語“主要組織相容性復(fù)合體”或“MHC”被定義為特定的基因簇，其中的許多編碼涉及抗原呈遞的、進(jìn)化上相關(guān)的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，這是其中組織相容性的最重要的決定因素。I類MHC或MHC-I主要在向⑶8T淋巴細(xì)胞的抗原呈遞中起作用。II 類MHC或MHC-II主要在向⑶4T淋巴細(xì)胞的抗原呈遞中起作用。
如本文中所使用的，術(shù)語“調(diào)節(jié)”意指生物狀態(tài)的任何變化，即，提高、降低等等。
如本文中所使用的，術(shù)語“多肽”被定義為氨基酸殘基鏈，通常具有限定的序列。如本文中所使用的，術(shù)語多肽相互包括術(shù)語“肽”和“蛋白質(zhì)”。
如本文中所使用的，術(shù)語“自體抗原”被定義為由宿主細(xì)胞或組織表達(dá)的抗原。自體抗原可以是腫瘤抗原，但在一些實(shí)施方式中，自體抗原在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均表達(dá)。技術(shù)人員將會(huì)理解，自體抗原可以在細(xì)胞中被過表達(dá)。
如本文中所使用的，“基本上純化的”細(xì)胞是這樣的細(xì)胞，其基本上不含其它細(xì)胞類型。基本上純化的細(xì)胞也指這樣的細(xì)胞，所述細(xì)胞已從其天然存在狀態(tài)中與之天然相關(guān)的其它細(xì)胞類型分離。在一些情況中，基本上純化的細(xì)胞群是指同質(zhì)細(xì)胞群。在其它情況下，該術(shù)語僅指這樣的細(xì)胞，所述細(xì)胞已從其天然狀態(tài)中與之天然相關(guān)的細(xì)胞分離。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞在體外培養(yǎng)。在其它實(shí)施方式中，細(xì)胞未在體外培養(yǎng)。
如本文中所使用的，術(shù)語“T細(xì)胞”被定義為胸腺衍生的細(xì)胞，其參與各種細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
如本文中所使用的，術(shù)語“B細(xì)胞”被定義為衍生自髓和/或脾的細(xì)胞。B細(xì)胞可以發(fā)展成產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞。
如本文中所使用的，術(shù)語“Toll樣受體”或“TLR”被定義為在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用的一類蛋白質(zhì)。TLR是跨單膜的、非催化受體，其識(shí)別衍生自微生物的、結(jié)構(gòu)上保守的分子。TLR在結(jié)合到配體后激活免疫細(xì)胞應(yīng)答。
如本文中所使用的，術(shù)語“Toll樣受體激動(dòng)劑”或“TLR激動(dòng)劑”被定義為這樣的配體，其結(jié)合TLR以激活免疫細(xì)胞應(yīng)答。
如本文中所使用的“治療有效量”是足以為施用組合物的哺乳動(dòng)物提供有益作用的組合物的量。
如本文中所使用的，術(shù)語“疫苗”被定義為這樣的物質(zhì)，其用于在施用給動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人之后弓I起免疫應(yīng)答。
范圍在該公開內(nèi)容中，本發(fā)明的各個(gè)方面可以以范圍的形式程現(xiàn)。應(yīng)該理解，以范圍形式進(jìn)行描述僅僅是為了方便和簡潔，而不應(yīng)該被解釋為對本發(fā)明范圍的僵硬限制。 因此，對范圍的描述應(yīng)該被理解成具體公開了所有可能的亞范圍以及該范圍內(nèi)的單個(gè)數(shù)值。例如，對范圍的描述，如從I到6，應(yīng)該被認(rèn)為具體公開了這樣的亞范圍，如I到3、1到 4、I至Ij 5、2到4、2到6、3到6等，以及該范圍內(nèi)的單個(gè)數(shù)值，例如，1、2、2· 7、3、4、5、5· 3和6。無論范圍的寬度如何，這均適用。
描述
如在本文中所考慮的，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生和冷藏具有如下優(yōu)異功能的DC的方法產(chǎn)生較強(qiáng)信號給T細(xì)胞，因而產(chǎn)生更有效的DC基抗腫瘤疫苗。通過選擇性地冷藏這種細(xì)胞，樣品可以被儲(chǔ)存和解凍，用于稍后使用，從而在疫苗生產(chǎn)過程中減少對重復(fù)提取和沖洗過程的需要。這些方法也可以被用于直接靶向涉及致癌信號傳導(dǎo)通道和癌干細(xì)胞(CSC) 的分子。
本發(fā)明包括成熟的、由Toll樣受體激動(dòng)劑活化的、負(fù)載抗原的DC，其誘導(dǎo)臨床上有效的免疫應(yīng)答，尤其在疾病過程的早期中使用時(shí)。本發(fā)明的DC產(chǎn)生期望水平的細(xì)胞因子和趨化因子，而且還能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
本發(fā)明還顯示，TLR配體不僅活化呈遞細(xì)胞，而且還抑制用于限制適應(yīng)性應(yīng)答的調(diào)節(jié)細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，通過多個(gè)Toll樣受體——包括TLR-2、TLR-4、TLR-8和TLR-9 的信號傳導(dǎo)被顯示通過免疫調(diào)節(jié)性⑶4+⑶25+Foxp3+T細(xì)胞(在本文中被稱為T,egs)進(jìn)行反向阻抑。在本文中顯示，TLR-4-活化的樹突細(xì)胞不僅抑制1^8對反應(yīng)淋巴細(xì)胞的作用，而且表現(xiàn)出使調(diào)節(jié)子本身轉(zhuǎn)換成產(chǎn)生IFN-Y的效應(yīng)子。
本發(fā)明還涉及以這樣的方式對這些活化的DC進(jìn)行冷藏保持其在解凍后呈遞抗原以及其產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和趨化因子的潛能和功能性，以便冷藏和隨后解凍的、活化的 DC像新鮮收獲和活化的DC —樣在臨床上是有效的。
基于DC的免疫治療
DC衍生自用作抗原呈遞細(xì)胞(APC)的多能單核細(xì)胞。DC普遍存在于外周組織中，在外周組織中它們被制備，以捕獲抗原。在抗原捕獲后，DC將抗原加工成小肽，并向次級淋巴器官移動(dòng)。正是在淋巴器官中，DC將抗原肽呈遞到固有T細(xì)胞，從而觸發(fā)使T細(xì)胞分化極性化的信號級聯(lián)。在暴露之后，DC將結(jié)合的抗原分子呈遞到MHC I類或II類結(jié)合妝并分另1J 活化 CD8.或 CD4+T 細(xì)胞(Steinman, 1991, Annu. Rev. Immunol. 9:271 - 296 ； Banchereau 等，1998，Nature 392, 245 - 252 ；Steinman,等，2007，Nature 449:419 -426 ；Ginhoux 等，2007，J. Exp. Med. 204:3133 - 3146 ;Banerjee 等，2006，Blood 108:2655 - 2661 ；Sallusto 等,1999, J. Exp. Med. 189:611 - 614 ；Reid 等,2000,Curr. Opin. Immunol. 12:114 - 121 ；Bykovskaia 等,1999, J. Leukoc. Biol. 66:659 - 666 ；Clark 等，2000，Microbes Infect. 2:257 - 272)。
DC負(fù)責(zé)誘導(dǎo)、協(xié)調(diào)和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，其用于協(xié)調(diào)免疫系統(tǒng)的固有武器 (arm)和適應(yīng)性武器的效應(yīng)子之間的交流。這些特征使得DC成為免疫治療的強(qiáng)有力的候選者。DC具有獨(dú)特的能力來通過大胞飲和受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用對環(huán)境進(jìn)行取樣(Gerner 等,2008,J.Tmmunol · 181:155 - 164 ；Stoitzner 等,2008,Cancer Immunol. Immunother 57:1665 - 1673 ；Lanzevecchia A. , 1996, Curr. Opin. Immunol. 8:348 - 354 ；Delamarre 等,2 005，Science,307 (5715):1630 - 1634)。
DC也需要成熟信號來增強(qiáng)其抗原呈遞能力。DC通過提供另外的成熟信號，如TNF-α、CD40L或鈣信號傳導(dǎo)劑(Czerniecki等，1997，. J. Immunol. 159:3823 - 3837 ；Bedrosian 等 2000，J. Immunother. 23:311 - 320 ；Mailliard 等，2004，CancerRes. 64，5934 - 5937 ;Brossart 等，1998，Blood 92:4238-4247 ;Jin等，2004, Hum. Immunol. 65:93 - 103)，來上調(diào)表面分子，如⑶80和⑶86 (也稱為第二信號分子)的表達(dá)。已經(jīng)確定，細(xì)胞因子——包括TNF- α、IL-I β、IL-6和前列腺素E2 (PGE2)的混合物具有使 DC 成熟的能力(Jonuleit,等，2000，Arch. Derm. Res. 292:325 - 332)。DC 也可以在用抗原脈沖之前通過韓離子載體(ionophore)而成熟。
除了病原體-識(shí)另Ij受體，如 PKR 和 MDA-5 (Kalali 等，2008，J. Immunol. 181:2694 - 2704 ；Nallagatla 等，2008，RNA Biol. 5(3) : 140 - 144)之外，DC 還包含一系列受體，被稱為Toll樣受體(TLR)，所述Toll樣受體也能夠感覺到來自病原體的威脅。當(dāng)這些TLR被觸發(fā)時(shí)，在DC中就會(huì)引起一些活化變化，這些變化導(dǎo)致T細(xì)胞的成熟和信號傳導(dǎo)(Boullart 等 2008，Cancer Immunol. Immunother. 57 (11) : 1589 - 1597 ； Kaisho 等，2003，Curr. Mol.Med.3 (4) :373-385 ;Pulendran 等，2001，Science 293(5528) : 253-256 ；NapoIitani 等，2005, Nat. Immunol. 6(8) : 769-776)。DC 可以活化并擴(kuò)張細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答的各種武器，如天然殺傷細(xì)胞Y-δΤ和α-βΤ細(xì)胞，并且，一旦被活化，DC 保持其免疫能力(Steinman, 1991, Annu. Rev. Immunol. 9:271-296 ；Banchereau 等，1998，Nature 392:245-252 ;Reid 等，2000，Curr.Opin. Immunol. 12:114-121 ; Bykovskaia 等,1999, J. Leukoc. Biol. 66:659-666 ；Clark 等,2000,Microbes Infect. 2:257-272)。
信號的DC-產(chǎn)牛
據(jù)認(rèn)為，成熟DC在活化T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中更有優(yōu)勢(Jonuleit 等,2001, Int. J. Cancer. 93:243 - 25 1 ；Prabakaran 等,2002,Ann. Surg. Oncol. 9:411 - 418 ;Xu 等，2003，J. Immunol. 171:2251 - 2261)。與不成熟 DC 相比，成熟DC能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的T細(xì)胞應(yīng)答，部分因?yàn)樘囟ǖ募?xì)胞因子由成熟DC分泌，其加強(qiáng)更強(qiáng)和更有效的T細(xì)胞應(yīng)答。例如，成熟DC在與CD4T細(xì)胞相互作用時(shí)產(chǎn)生 IL-12 (Koch 等，1996，J. Exp. Med. 184:741 - 746 ;Heifler 等，1996，Eur. J. Immunol. 26:659 - 668)。分泌 Thl 驅(qū)動(dòng)細(xì)胞因子，如 IL-12、IL-18 和 IL-23 的 DC 被稱為 I 型極性化 DC 或 DCl (Kalinski,等,1999, Immunol. Today 20:561 - 567 ；Lanzavecchia 等，2000，Science290 (5489):92 - 97)。
由成熟DC產(chǎn)生的細(xì)胞因子對T細(xì)胞應(yīng)答具有不同的效應(yīng)。例如，IL-12是異二聚體細(xì)胞因子，其由DC產(chǎn)生，并且在產(chǎn)生分泌IFN- Y的⑶4+和⑶8+T細(xì)胞以及增強(qiáng)抗細(xì)菌和抗腫瘤應(yīng)答中是關(guān)鍵的(Gee 等,2009, Inflamm. Allergy DrugTargets 8:40 - 52)。IL-12 也可以抑制卵巢癌(OV-HM)鼠模型中原發(fā)性腫瘤以及轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的生長(Tatsumi 等，2001，Cancer Res. 61:7563-7567)。IL-12也可以介導(dǎo)高親和力抗腫瘤T細(xì)胞的產(chǎn)生 (Xu等，2003，J. Immunol. 171:2251 - 2261)，從而提高抗腫瘤T細(xì)胞功能。DC也產(chǎn)生趨化因子作為第四信號，其導(dǎo)致T細(xì)胞的積累并進(jìn)一步影響T細(xì)胞應(yīng)答(Xiao等，2003，細(xì)胞因子 23:126-132)。
DC可以分泌其它細(xì)胞因子，所述細(xì)胞因子進(jìn)一步影響T細(xì)胞活化。例如，DC可以分泌IL-I、IL-6和IL-23，其活化Thl7細(xì)胞。Thl7細(xì)胞是最近被定義的促炎T細(xì)胞的亞組，其通過產(chǎn)生其信號細(xì)胞因子——IL-17——的手段，有助于造成病原體清除和組織炎癥 (Kikly 等，2006，Curr. Opin. Immunol. 18:670 - 675)。IL-12 的產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致更有效的 Thl 應(yīng)答，而IL-23的產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致Thl7細(xì)胞的成熟。實(shí)際上，產(chǎn)生IL-12的DC在IL-23存在的情況下會(huì)使主要的Thl應(yīng)答極性化，然而，通過對比，產(chǎn)生IL-23的DC在IL-12不存在的情況下使強(qiáng)的 Thl7 應(yīng)答極性化(Roses 等,2008, J. Immunol. 181:5120-5127 ；Acosta-Rodriguez 等，2007，Nat. Immunol. 8:639-646)。因此，由于特定DC-分泌的細(xì)胞因子對T細(xì)胞功能具有如此大的影響，描述成熟DC的細(xì)胞因子特性的重要性是潛在T細(xì)胞效應(yīng)子會(huì)產(chǎn)生什么的一個(gè)更加大得多的量度。因此，成熟DC可以更有效地通過它們占優(yōu)勢的細(xì)胞因子產(chǎn)量和隨后的對T細(xì)胞的信號作用進(jìn)行表征，而不是僅通過表面分子的表達(dá)進(jìn)行更常規(guī)的表征。
負(fù)載的(脈沖的)免疫細(xì)胞的產(chǎn)生
本發(fā)明包括已經(jīng)被暴露或以其它方式用抗原“脈沖”的細(xì)胞。例如，APC，如DC可以例如通過在抗原存在的情況下進(jìn)行離體培養(yǎng)或通過在體內(nèi)暴露于抗原而變成體外Ag-負(fù)載的。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員也會(huì)容易理解，APC可以以使APC暴露于抗原達(dá)足以促使該抗原呈遞到APC表面上的時(shí)間的方式被“脈沖”。例如，APC可以以小肽片段——被稱為抗原肽——的形式暴露于抗原，該小肽片段被直接“脈沖”到APC外面(Mehta-Damani等，1994)； 或者，APC可以用完整蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)顆粒溫育，該蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)顆粒隨后被APC攝取。這些完整蛋白質(zhì)通過APC被消化成小肽片段，并最終被攜帶和呈遞到APC表面(Cohen 等，1994)。肽形式的抗原可以通過本文所述的標(biāo)準(zhǔn)“脈沖”技術(shù)暴露于細(xì)胞。
不希望被任何具體理論所束縛，外源抗原或自身抗原形式的抗原通過本發(fā)明的 APC進(jìn)行處理，以保持抗原的免疫原性形式。抗原的免疫原性形式意味著通過片段化處理抗原，以產(chǎn)生可以被識(shí)別的抗原形式，并能刺激免疫細(xì)胞，例如T細(xì)胞。優(yōu)選地，這種外源抗原或自身抗原是通過APC被加工成肽的蛋白質(zhì)。由APC產(chǎn)生的相關(guān)肽可以被提取和純化，以用作免疫原性組合物。由APC加工的肽也可以用于誘導(dǎo)對由APC加工的蛋白質(zhì)的耐性。
本發(fā)明的負(fù)載抗原的APC，又稱為“脈沖的APC”，通過使APC在體外或體內(nèi)暴露于抗原而被產(chǎn)生。在APC被體外脈沖的情況下，可將APC鋪在培養(yǎng)皿上，并使其以足夠的量暴露于抗原足夠的時(shí)間段，以允許抗原結(jié)合APC。實(shí)現(xiàn)抗原與APC結(jié)合所必需的量和時(shí)間可以通過使用本領(lǐng)域中已知的方法或本文中公開的另外方式來確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的其它方法，例如免疫測定或結(jié)合分析可以用于檢測暴露于抗原后抗原在APC上的存在。
在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，APC可以通過載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，所述載體允許APC表達(dá)特定蛋白質(zhì)。由APC表達(dá)的蛋白質(zhì)然后可以被加工，并呈遞到細(xì)胞表面上。然后，轉(zhuǎn)染的 APC可以用作免疫原性組合物，以產(chǎn)生針對載體編碼的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。
如在本文別處所論述的，載體可以被制備成包括特定的多核苷酸，該多核苷酸編碼并表達(dá)蛋白質(zhì)，針對該蛋白質(zhì)期望免疫原性應(yīng)答。優(yōu)選地，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體被用于感染細(xì)胞。更優(yōu)選地，腺病毒載體用于感染細(xì)胞。
在另外的實(shí)施方式中，可以通過修飾病毒載體使載體靶向APC，以編碼由APC上的受體識(shí)別的蛋白質(zhì)或其部分，由此載體對APC受體的占據(jù)將引發(fā)載體的胞吞作用，允許加工和呈遞由病毒載體的核酸編碼的抗原。由病毒遞送的核酸對于病毒可以是天然的，其在 APC上被表達(dá)時(shí)編碼病毒蛋白質(zhì)，該病毒蛋白質(zhì)然后被加工和呈遞到APC的MHC受體上。
如在本文中所考慮的，許多方法可用于將多核苷酸轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞。所述方法包括包括、但不限于磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、粒子轟擊、微注射、電穿孔法、膠體分散體系(即， 高分子復(fù)合體、納米囊、微球、珠和基于脂類的體系——包括水包油乳液、微團(tuán)、混合的微團(tuán)12和脂質(zhì)體)。這些方法在本領(lǐng)域中被理解，并描述在公布的文獻(xiàn)中，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)嵤┻@些方法。
在另外的實(shí)施方式中，編碼抗原的多核苷酸可被克隆到表達(dá)載體中，并且，載體可被引入到APC中，以另外產(chǎn)生負(fù)載的APC。將核酸引入到細(xì)胞的各種類型的載體和方法在可獲得的、公開的文獻(xiàn)中有論述。例如，表達(dá)載體可通過物理、化學(xué)或生物學(xué)手段被轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中。參見，例如，Sambrook 等(2001，MolecularCloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York),和在 Ausubel 等(1997，Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons, NewYork)中。容易理解,包含編碼抗原的多核苷酸的表達(dá)載體的引入產(chǎn)生脈沖的細(xì)胞。
本發(fā)明包括用于脈沖APC的多種方法，包括、但不限于使APC負(fù)載有蛋白質(zhì)、cDNA 或mRNA形式的完整抗原。然而，本發(fā)明不應(yīng)該被解釋為限于用于脈沖APC的抗原的具體形式。相反地，本發(fā)明包括本領(lǐng)域中已知的、用于產(chǎn)生負(fù)載抗原的APC的其它方法。優(yōu)選地， APC用編碼限定抗原的mRNA轉(zhuǎn)染。利用適當(dāng)?shù)囊锖湍孓D(zhuǎn)錄酶_聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 結(jié)合轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，對應(yīng)于序列已知的基因產(chǎn)物的mRNA可以在體外被快速產(chǎn)生。對于產(chǎn)生脈沖的APC來說，用mRNA轉(zhuǎn)染APC提供超過其它抗原負(fù)載技術(shù)的優(yōu)勢。例如，從微量組織，即， 腫瘤組織，擴(kuò)增RNA的能力擴(kuò)大了 APC的用途，用于對大量患者接種疫苗。
對于作為疫苗有用的抗原組合物,抗原組合物必需誘發(fā)對細(xì)胞、組織或哺乳動(dòng)物 (例如，人)中抗原的免疫應(yīng)答。如本文中所使用的，“免疫學(xué)組合物”可以包括抗原(例如，肽或多肽)、編碼抗原的核酸(例如，抗原表達(dá)載體)或表達(dá)或呈遞抗原或細(xì)胞成分的細(xì)胞。在具體實(shí)施方式
中，抗原組合物包括或編碼所有或部分本文所述的任意抗原，或其免疫學(xué)上的功能等同物。在其它實(shí)施方式中，抗原組合物在包括另外的免疫刺激劑或編碼這種劑的核酸的混合物中。免疫刺激劑包括、但不限于另外的抗原、免疫調(diào)節(jié)劑、抗原呈遞細(xì)胞或佐劑。在其它實(shí)施方式中，一種或多種另外的劑以任意組合共價(jià)結(jié)合到抗原或免疫刺激劑。在某些實(shí)施方式中，抗原組合物結(jié)合于或包括HLA錨定基序氨基酸。
如在本文中所考慮的，疫苗的核酸和/或細(xì)胞成分的組成可以變化。在非限制性實(shí)例中，編碼抗原的核酸也可以與佐劑配制。當(dāng)然，應(yīng)該理解，本文所述的各種組合物可以進(jìn)一步包括另外的成分。例如，一種或多種疫苗成分可以包含在脂類或脂質(zhì)體中。在另外的非限制性實(shí)例中，疫苗可以包括一種或多種佐劑。本發(fā)明的疫苗及其各種成分可以通過本文所公開的任何方法進(jìn)行制備和/或施用，或者，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)知道的，鑒于本發(fā)明的公開內(nèi)容，進(jìn)行制備和/或施用。
應(yīng)該理解，本發(fā)明的抗原組合物可以通過本領(lǐng)域中悉知的方法進(jìn)行制備，所述方法包括但不限于通過固相合成和通過HPLC純化去掉化學(xué)反應(yīng)的其它產(chǎn)物進(jìn)行的化學(xué)合成，或者通過在體外翻譯體系或或細(xì)胞中表達(dá)編碼包含本發(fā)明抗原的肽或多肽的核酸序列 (例如，DNA序列)而產(chǎn)生。另外，抗原組合物可以包括分離自生物學(xué)樣品的細(xì)胞成分?？乖M合物被分離并大量透析，以去除一種或多種不期望的小分子量分子和/或被凍干，以更容易配制成期望的賦形劑。進(jìn)一步理解，在疫苗組分中進(jìn)行的另外的氨基酸、突變、化學(xué)修飾等等——如果存在的話，將優(yōu)選基本上不干涉抗體識(shí)別表位序列。
對應(yīng)于一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明抗原決定簇的肽或多肽的長度通常應(yīng)該為至少5個(gè)或6 個(gè)氨基酸殘基，并且可以包含多達(dá)約10個(gè)、約15個(gè)、約20個(gè)、約25個(gè)、約30個(gè)、約35個(gè)、約40個(gè)、約45或約50個(gè)殘基等等。肽序列可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法合成，所述方法例如利用自動(dòng)肽合成儀進(jìn)行肽合成，所述自動(dòng)肽合成儀如可以獲自Applied Biosystems, Inc. , Foster City, CA (Foster City, CA)的那些。
較長的肽或多肽也可以例如通過重組手段被制備。在某些實(shí)施方式中，編碼本文所述的抗原組合物和/或成分的核酸可被用于，例如體外或體內(nèi)產(chǎn)生本發(fā)明的各種組合物和方法的抗原組合物。例如，在某些實(shí)施方式中，編碼抗原的核酸被包含在，例如重組細(xì)胞的載體中。核酸可以被表達(dá)，以產(chǎn)生包含抗原序列的肽或多肽。肽或多肽可以從細(xì)胞中分泌,或者作為部分被包含或者在細(xì)胞內(nèi)。
在某些實(shí)施方式中，可以通過用編碼抗原的核酸轉(zhuǎn)染或接種哺乳動(dòng)物來促進(jìn)免疫應(yīng)答。然后，在施用核酸給哺乳動(dòng)物之后，包含在目標(biāo)哺乳動(dòng)物中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞表達(dá)由該核酸編碼的序列。疫苗也可以是，例如編碼抗原的所有或部分肽或多肽序列的核酸(例如，cDNA或RNA)的形式。通過核酸的體內(nèi)表達(dá)可以,例如通過質(zhì)粒型載體、病毒載體或病毒/質(zhì)粒構(gòu)建載體進(jìn)行。
在另外的實(shí)施方式中，核酸包括編碼區(qū)，所述編碼區(qū)編碼所有或部分序列，所述序列編碼適當(dāng)?shù)目乖?，或其免疫學(xué)上的功能等同物。當(dāng)然，核酸可以包括和/或編碼另外的序列，包括、但不限于包含一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑或佐劑的那些。
杭原
如在本文中所考慮的，本發(fā)明可以包括應(yīng)用適于載入APC以引起免疫應(yīng)答的任何抗原。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用腫瘤抗原。腫瘤抗原可以分成兩大類共有的腫瘤抗原；和特有的腫瘤抗原。共有抗原由許多腫瘤表達(dá)，而特有腫瘤抗原由通過物理或化學(xué)致癌原誘導(dǎo)的突變引起，因而僅由個(gè)別腫瘤表達(dá)。在某些實(shí)施方式中，共有腫瘤抗原被載入到本發(fā)明的DC中。在其它實(shí)施方式中，特有腫瘤抗原被載入到本發(fā)明的DC中。
在本發(fā)明的上下文中，“腫瘤抗原”是指特定高度增生性疾病共有的抗原。在某些方面，本發(fā)明的高度增生性疾病抗原衍生自癌癥，包括但不限于原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宮癌、宮頸癌、 膀胱癌、腎癌和腺癌諸如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等等。
惡性腫瘤表達(dá)一些可用作免疫攻擊的目標(biāo)抗原的蛋白質(zhì)。這些分子包括、但不限于組織特異性抗原諸如黑素瘤中的MART-I、酪氨酸酶和GP 100以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特異性抗原(PSA)。屬于轉(zhuǎn)化相關(guān)分子類的其它目標(biāo)分子諸如癌基因HER-2/Neu/ErbB-2。再一類的目標(biāo)抗原是癌胚抗原諸如癌胚抗原(CEA)。在B細(xì)胞淋巴瘤中，腫瘤特異性獨(dú)特型免疫球蛋白構(gòu)成真正的腫瘤特異性免疫球蛋白抗原，其是個(gè)別腫瘤特有的。B細(xì)胞分化抗原諸如CD19、CD20和CD37是B細(xì)胞淋巴瘤中的目標(biāo)抗原的其它候選者。一些這種抗原(CEA、HER-2、⑶19、⑶20，獨(dú)特型)已經(jīng)被用作通過單克隆抗體進(jìn)行的被動(dòng)免疫治療的目標(biāo)，獲得有限的成功。
腫瘤抗原及其抗原癌表位可以從天然源，諸如從初級臨床分離物、細(xì)胞系等等被純化和分離。癌癥肽及其抗原表位也可以通過本領(lǐng)域中已知的化學(xué)合成或通過重組 DNA技術(shù)獲得。用于化學(xué)合成的技術(shù)描述在Steward等(1969) ;Bodansky等(1976)； Meienhofer (1983);和 Schroder 等(1965)中。此外，如在 Renkvist 等(2001)中所描述的， 本領(lǐng)域中存在許多已知的抗原。盡管沒有具體描述類似物或人工修飾的表位，但技術(shù)人員知道如何通過本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)手段獲得或產(chǎn)生它們。被抗體識(shí)別并由Serex技術(shù)(見Sahin 等(1997)和Chen等(2000))所檢測的其它抗原在路德維格癌癥研究院(Ludwig Institute for Cancer Research)的數(shù)據(jù)庫中被鑒別。
在再另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明可以包括微生物抗原，用于通過APC進(jìn)行呈遞。如本文中所考慮的，微生物抗原可來源于病毒、細(xì)菌或真菌。感染性病毒的實(shí)例包括逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)(例如，人免疫缺陷病毒諸如HIV-I (也稱為HTLV-III. LAV或 HTLV-III/LAV 或 HIV-III ;和其它隔離群諸如 HIV-LP ;小 RNA 科病毒(Picornaviridae) (例如，脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒；腸道病毒、人柯薩奇病毒、鼻病毒、?？刹《?；環(huán)狀病毒科(Calciviridae)(例如，引起腸胃炎的毒株)；披膜科病毒(Togaviridae)(例如，馬腦炎病毒、風(fēng)疹病毒)；黃病毒科(Flaviridae)(例如，登革病毒、腦炎病毒、黃熱病病毒)；冠狀病毒科(Coronaviridae)(例如，冠狀病毒)；(Rhabdoviridae)彈狀病毒科 (例如，水皰性口炎病毒、狂犬病病毒)；絲狀病毒科(Filoviridae)(例如，埃博拉病毒)； 副黏病毒科(Paramyxoviridae)(例如，副流感病毒、腿腺炎病毒、麻疫病毒、呼吸道合胞病毒)；正黏病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)；布尼亞病毒科(Bungaviridae) (例如，汗坦病毒、布尼亞病毒、白嶺病毒和內(nèi)羅病毒)；沙粒病毒科(Arena viridae)(出血熱病毒)；呼腸病毒科(Reoviridae)(例如，呼腸病毒、環(huán)狀病毒和輪狀病毒)；|RNA 病毒科(Birnaviridae);肝0應(yīng)病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；細(xì)小病毒科 (Parvovirida)(細(xì)小病毒);乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳頭瘤病毒、多瘤病毒)； 腺病毒科(Adenoviridae)(大部分腺病毒)；皰疫病毒科(Herpesviridae)(單純皰疫病毒 (HSV) I和2型、水痘帶疹病毒、巨細(xì)胞病毒(CMV)、皰疹病毒);痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如，非洲豬痕病毒)；和未分類病毒(例如，海綿狀腦病的病原、S肝炎病原(被認(rèn)為是乙型肝炎病毒的缺陷型衛(wèi)星 (defective satellite))、非甲型、非乙型肝炎的病原(I類=體內(nèi)傳播的；2類=非經(jīng)腸道傳播的(即，丙型肝炎)；諾瓦克病毒和相關(guān)病毒和星狀病毒)。
感染性細(xì)菌的實(shí)例包括幽門螺桿菌(Helicobacter pyloris)、布氏疏螺旋體(Borelia burgdorferi)、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophilia)、分枝桿菌屬某些種(Mycobacteria sps)(例如，結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)、鳥分枝桿菌M. avium()、胞內(nèi)分支桿菌(M. intracelIulare)、堪薩斯分支桿菌(M. kansasii)、登氏分枝桿菌(M. gordonae))、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟菌 (Neisseriagonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、單核細(xì)胞增生李斯特桿菌(Listeria monocytogenes)、釀胺鏈球菌(Streptococcus pyogenes) (A 組鏈球菌)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae) (B 組鏈球菌)、鏈球菌(Streptococcus) (草綠色鏈球菌組(viridans group))、糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)、牛鏈球菌(Streptococcusbovis)、鏈球菌(Streptococcus)(厭氧種(anaerobic sps.))、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、病原體彎曲桿菌屬種(Campylobacter sp.)、 腸球菌屬種(Enterococcussp.)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、炭疽芽抱桿菌(Bacillus anthracis)、白喉棒桿菌(corynebacterium diphtheriae)、棒桿菌屬種 (corynebacterium sp·)、豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、多殺巴斯德氏菌 (Pasturella multocida)、類桿菌屬種(Bacteroides sp·)、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠狀鏈桿菌(Streptobacillus moniliformis)、極細(xì)密螺旋體(Treponema pertenue)、鉤端螺旋體(Leptospira)和衣氏放線菌(Actinomyces israelii)。
感染性真菌的實(shí)例包括新生隱球菌(Cryptococcus neoformans)、莢膜組織胞楽■菌(Histoplasma capsulatum)、粗球抱子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)和白色念珠菌 (Candida albicans)。其它感染性生物體(即，原生生物(protists))包括惡性痕原蟲 (Plasmodium falciparum)和剛地弓形蟲(oxoplasma gondii)。
DC的活化
雖然常規(guī)的基于DC的疫苗(之前在臨床試驗(yàn)中占優(yōu)勢)用包括TNF、IL-6、PGE2 和IL-I β的組合的細(xì)胞因子混合物使DC成熟——該混合物最終刺激無菌炎癥，但本發(fā)明改為利用TLR激動(dòng)劑來使DC成熟并刺激信號的產(chǎn)生。
根據(jù)本發(fā)明的方面，用TLR配體的組合來刺激DC導(dǎo)致增加量的IL-12的產(chǎn)生。此外，用TLR激動(dòng)劑的組合活化DC或產(chǎn)生更顯著的⑶4和⑶8Τ細(xì)胞應(yīng)答。(Warger 等，2006，Blood 108:544 - 550)。因此，通過暴露于觸發(fā)TLR的這些配體，本發(fā)明的DC能分泌Thl驅(qū)動(dòng)細(xì)胞因子諸如IL-12。例如，將聚(I:C)、TLR3激動(dòng)劑加入到IL-I β、TNF-α 和IFN-Y能夠產(chǎn)生有效的I-型極性化的DC，其以高水平的IL-12產(chǎn)量為特征(Heifler 等，1996，Eur. J. Immunol. 26:659-668)。在某些實(shí)施方式中，抗原可以在TLR激動(dòng)劑暴露前被載入到DC。在其它實(shí)施方式中，抗原可以在TLR激動(dòng)劑暴露后隨后被載入到DC。
根據(jù)本發(fā)明的方面，新的、完整的方法被用于產(chǎn)生高度有效的DC，其通過TLR活化產(chǎn)生強(qiáng)的抗腫瘤免疫應(yīng)答。該方法，也可以被稱為通過活化的固有(自體的)轉(zhuǎn)移(ICAIT) 進(jìn)行的免疫調(diào)節(jié)，利用通過刺激細(xì)菌感染的生物分子特異性活化的、單核細(xì)胞衍生的DC，從而構(gòu)成ICAIT-DC。這種獨(dú)特的活化方法將在通過TNF、IL-6、PGE2和IL-I β的細(xì)胞因子混合物成熟(“常規(guī)的成熟”)的DC中沒有發(fā)現(xiàn)的性質(zhì)賦予DC，其還刺激無菌炎癥(Lombardi 等，2009，J. Immunol. 182:3372 - 3379)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的ICAIT-DC可用TLR4激動(dòng)劑、細(xì)菌脂多糖(LPS)、 TLR7/8 激動(dòng)劑、resimiquod(R848)和 / 或 IFN- Y 的組合進(jìn)行活化(Amati 等,2006, Curr. Pharm. Des 12:4247-4254)。通過用TLR4激動(dòng)劑和細(xì)菌LPS活化DC，產(chǎn)生ICAIT-DC，其與通過常規(guī)成熟方法產(chǎn)生的DCl至少實(shí)質(zhì)上相同(在表型上)。這些ICAIT-DC具有高的表面分子的表達(dá)，所述表面分子包括⑶83、⑶80、⑶86和HLA-DR。在其它實(shí)施方式中，可以使用TLR2激動(dòng)劑諸如脂磷壁酸(lipotechoic acid, LTA)、TLR3激動(dòng)劑諸如聚(I:C)和/或其它TLR4激動(dòng)劑諸如MPL。如在本文中所考慮的，任何TLR激動(dòng)劑或TLR激動(dòng)劑的組合均可用于活化DC，倘若這些配體通過活化的DC刺激細(xì)胞因子和趨化因子信號的產(chǎn)生。許多其它TLR激動(dòng)劑在本領(lǐng)域中是已知的，并可以在公開的文獻(xiàn)中找到，以結(jié)合本發(fā)明使用。
即使ICAIT-DC和常規(guī)成熟的DC的表型之間存在相似性，但本發(fā)明的ICAIT-DC 顯示許多顯著的優(yōu)勢。例如，如在圖I中所描述的，與常規(guī)成熟的DC相比，ICAIT-DC產(chǎn)生更高水平的 TNF 以及高水平的 IL-12、CCL3 (MIP-1 α )和 CCL4 (ΜΙΡ-1 β )、CCL5 (RANTES)和 CXCLlO(IP-IO)。
這些因子中的每一個(gè)均可增強(qiáng)抗腫瘤免疫性的方面。例如，CXCLlO (IP-10)化學(xué)吸引增強(qiáng)腫瘤排斥的 NK 細(xì)胞(Zing 等,2005, J. Interferon Cytokine Res. 25:103-112)。 TNF和IL-12是抗血管生成的，并斷絕腫瘤的血液供應(yīng)(Albini等，2009，J. Transl. Med. 7(5)) ο IL-12促進(jìn)分泌IFN-Y的Thl細(xì)胞的發(fā)育和補(bǔ)充(募集，recruitment),并活化NK細(xì)胞。與此相反，常規(guī)成熟的DC對于所有這些生物分子的表達(dá)非常差，相反地， 其強(qiáng)烈表達(dá)CCL17 (TARC)——與變應(yīng)性反應(yīng)有關(guān)的趨化因子，以及Th2細(xì)胞的補(bǔ)充(Xiao 等，2003，Cytokine 23:126-132)。同樣描述在圖I中的是ICAIT-DC顯示常規(guī)DC所缺乏的獨(dú)特殺傷作用的能力，由此它們能夠裂解乳腺癌細(xì)胞系。
因此，本發(fā)明的ICAIT-DC不僅顯示已知為有效的抗腫瘤分子的細(xì)胞因子的產(chǎn)生， 而且，ICAIT-DC還積極影響敏化的T細(xì)胞的性質(zhì)。如圖2所描述的，雖然常規(guī)成熟的DC和 ICAIT-DC均能針對腫瘤抗原成功地敏化T細(xì)胞，但僅ICAIT-DC能調(diào)節(jié)T細(xì)胞，以有效識(shí)別表達(dá)HER-2的腫瘤。這表明，腫瘤具有通過與常規(guī)DC活化有關(guān)的手段來保護(hù)它們免于被敏化的T細(xì)胞識(shí)別的機(jī)制，但是，這些機(jī)制可以被由ICAIT-DC敏化和調(diào)節(jié)的T細(xì)胞克服。因此，ICAIT-DC例證常規(guī)DC所不具有的獨(dú)特性質(zhì)，并且，ICAIT-DC模型允許調(diào)節(jié)高級T細(xì)胞敏化，多譜系效應(yīng)子對腫瘤沉積物的趨化吸引，并且有助于癌細(xì)胞的直接破壞。
ICAIT-DC在免瘡治療中的應(yīng)用
盡管在開發(fā)基于DC的癌癥疫苗方面已經(jīng)取得了進(jìn)展，但仍存在限制當(dāng)前基于DC 的癌癥疫苗成功的許多挑戰(zhàn)。一個(gè)最重要的挑戰(zhàn)是克服腫瘤逃避免疫系統(tǒng)的能力。這可以歸于這樣的事實(shí)，即，組織特異性腫瘤相關(guān)的抗原可能是微弱的免疫原性的，因此逃避宿主免疫應(yīng)答，或者免疫應(yīng)答可以免疫編輯腫瘤，因而消除抗原_陽性細(xì)胞而剩下抗原_陰性腫瘤細(xì)胞。該免疫編輯的過程是一種方法，由此免疫應(yīng)答可以將腫瘤塑造成更具侵襲性的表型。免疫編輯可以部分地解釋為何僅靶向單一組織特異性抗原產(chǎn)生了相當(dāng)有限的臨床成功。除靶向的免疫編輯概念之外，表位擴(kuò)展的想法作為增強(qiáng)效應(yīng)T細(xì)胞誘導(dǎo)的另一可能的機(jī)制近來也獲得關(guān)注。
利用DC的大部分臨床試驗(yàn)僅靶向組織特異性腫瘤蛋白質(zhì)/抗原。然而，存在許多這樣的分子，其在過表達(dá)時(shí)與腫瘤性轉(zhuǎn)化相關(guān)并尚未被靶向。例如，存活蛋白——抗凋亡家族的一員——被理解為信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT3)通路的直接下游目標(biāo)(Gritsko 等，2006，Clin. Cancer Res. 12:11 - 19)直接抑制STAT3信號傳導(dǎo)阻斷存活蛋白的表達(dá)并發(fā)起乳癌細(xì)胞的凋亡。還據(jù)信，HER-2/neu過表達(dá)的誘導(dǎo)上調(diào)存活(Siddiqa等，2008，BMC Cancer 8:129)。公認(rèn)的腫瘤抗原——HER-2/neu和信號傳導(dǎo)通路基因——存活蛋白之間的這種聯(lián)系提供巨大的潛力來開發(fā)新的免疫治療干預(yù)，其靶向乳腺癌的發(fā)病機(jī)理中的多個(gè)效應(yīng)子。存活蛋白基因的其它免疫原性肽已經(jīng)被識(shí)別，所以通過本發(fā)明的體系和方法開發(fā)抗_存活蛋白、基于DC的治療非?？煽?，并且，結(jié)合確認(rèn)的抗-HER-2/neu、基于DC 的接種疫苗對于衰退具有深遠(yuǎn)的影響，而且可能預(yù)防不依賴于雌激素的乳腺癌(Reker 等，2004，Cancer Biol. Ther.3:180 - 183)。
蛋白質(zhì)HER-1/EGFR是新的分子的另一實(shí)例，其可用作根據(jù)本發(fā)明的體系和方法開發(fā)的基于DC的疫苗的靶標(biāo)。除了存活蛋白以外，HER-1/EGFR也可用作基于DC的癌癥疫苗的、新的非組織特異性靶。乳腺癌、結(jié)直腸癌、多形性腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌和非小細(xì)胞肺癌范圍內(nèi)的各種惡性腫瘤的癌發(fā)生已經(jīng)涉及HER-1/EGFR的過表達(dá)或突變(Hynes等，2009，Curr. Opin. Cell Biol. 21:177-184)。DC 可以用 HER-1/EGFR 脈沖并如本文所述地被活化，因而可以產(chǎn)生抗-HER-1/EGFR T細(xì)胞應(yīng)答。
黏蛋白I(MUC-I)也可以用作癌癥疫苗靶標(biāo)。MUC-I是一種上皮細(xì)胞糖蛋白， 其在許多腺癌中高度過表達(dá)并異常糖基化，所述腺癌包括乳腺癌和膽癌和胰腺癌(Vlad 等，2004，Adv. Immunol. 82:249-293 ;von Mensdorff-Pouilly 等，2000，Int.J.Biol. Markersl5，343-356)。在腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移中已經(jīng)涉及MUC-I的過表達(dá)。假設(shè)MUC-I的過表達(dá)與一些血液和上皮惡性腫瘤有關(guān)，結(jié)合抗-MUC-I、基于DC的疫苗與針對組織特異性腫瘤靶標(biāo)的疫苗會(huì)產(chǎn)生臨床上相關(guān)的結(jié)果。靶向這些分子會(huì)對腫瘤細(xì)胞的增殖產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，因而中斷疾病的進(jìn)展。因?yàn)榛贒C的疫苗可以包括蛋白質(zhì)諸如存活蛋白和HER-I/ EGFR，利用多重靶向的接種疫苗方法有可能在臨床上影響疾病發(fā)展。
如在本文中所考慮的，CSC也是本發(fā)明的新的、基于DC的疫苗的免疫治療靶標(biāo)。據(jù)信，干細(xì)胞亞群體引發(fā)和維持各種贅生物(Wicha等，2006，Cancer Res. 66:1883 - 1890)。 與CSC有關(guān)的通路被認(rèn)為缺乏調(diào)節(jié)，因而產(chǎn)生CSC的不受控制的自我更新，這產(chǎn)生抵抗常規(guī)治療的腫瘤(Eyler等，2008，J. Clin. Oncol. 26:2839 - 2845)。當(dāng)前的癌癥干預(yù)靶向分化的腫瘤細(xì)胞，但不傷害CSC群體(Eyler等，2008，J. Clin. Oncol. 26:2839 - 2845)，然而，正是 CSC群體可能引發(fā)疾病復(fù)發(fā)和/或限制標(biāo)準(zhǔn)治療的治療益處。因此，有必要在對控制自我更新和在CSC中生存的方面的信號傳導(dǎo)通道更好地理解的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)新的策略，以鑒定這些細(xì)胞中的新的治療靶標(biāo)。干細(xì)胞標(biāo)記已經(jīng)在一些人類惡性腫瘤——包括血液惡性腫瘤和腦、前列腺、乳、胰腺、頭頸和結(jié)腸腫瘤中被識(shí)別。除了識(shí)別干細(xì)胞標(biāo)記之外，調(diào)節(jié)自我更新和細(xì)胞發(fā)育的通道諸如Wnt、Notch和Hedgehog也被詳細(xì)地分析(Kakarala等，2008, J. Clin. Oncol. 26:2813 - 2820 ；Medina 等，2009，Clin. TransI. Oncol. 11:199 - 207 ；Bolos 等，2009，Clin. TransI. Oncol. 11:11 - 19 ；Bisson 等，2009，Cell Res. 19(6):683 - 697)。
在開發(fā)靶向特定腫瘤的DC疫苗中應(yīng)用的相同機(jī)制也可以用于靶向?qū)τ贑SC特異的分子。據(jù)信，并非所有的乳癌細(xì)胞都是一樣的，以及乳CSC亞組可能是浸潤性和轉(zhuǎn)移性疾病發(fā)展的原因。人乳腺癌包含以顯示干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞表面標(biāo)記⑶44+/⑶241ow/lin-的表達(dá)為特征的細(xì)胞群體(Al-Hajj 等，2003，Proc. Natl Acad. Sci. USA 100:3983 - 3988)。 HER-2/neu屬于調(diào)節(jié)干細(xì)胞群體的分子。在干細(xì)胞標(biāo)記醛脫氫酶I的表達(dá)和HER-2/neu過表達(dá)之間存在相關(guān)性。例如，在一系列477個(gè)乳腺癌中，正常人乳腺上皮細(xì)胞以及乳腺癌中的HER-2/neu過表達(dá)與表達(dá)ALDHI的干細(xì)胞比例的增加有關(guān)(Ginestier等，2007, Cell干細(xì)胞.5:555 - 567)。HER-2/neu表達(dá)和干細(xì)胞之間的這種相關(guān)性用作識(shí)別CSC的特定標(biāo)記如何能促進(jìn)利用本發(fā)明的體系和方法的、基于DC的疫苗的開發(fā)的完美實(shí)例，本發(fā)明的體系和方法不僅靶向腫瘤抗原，而且也意圖消除自我調(diào)節(jié)細(xì)胞諸如干細(xì)胞。靶向總是連接CSC 的分子部分地通過減少可用作癌發(fā)生引發(fā)劑的多能細(xì)胞的克隆而可以有效預(yù)防癌癥。針對基于DC的疫苗的開發(fā)考慮本發(fā)明，癌癥疫苗開發(fā)同樣可以以靶向?qū)τ贑SC特異的分子為目標(biāo)。通過靶向在CSC中表達(dá)的分子，存在機(jī)會(huì)來消除可能導(dǎo)致大部分系統(tǒng)性復(fù)發(fā)和當(dāng)前抗癌治療失敗的細(xì)胞的克隆。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)，鑒別對于CSC特異的分子，然后，如在本文中所考慮的，可以實(shí)施基于DC的免疫治療，以靶向?qū)τ诟杉?xì)胞特異的分子。
調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的抑制
本發(fā)明還顯示，TLR配體不僅活化呈遞細(xì)胞，而且抑制用于限制適應(yīng)性應(yīng)答的調(diào)節(jié)細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，通過若干Toll樣受體——包括TLR-2、TLR-4、TLR-8和TLR-9進(jìn)行的信號傳導(dǎo)通過Tmss逆轉(zhuǎn)阻抑。在本文中顯示，TLR-4-活化的樹突細(xì)胞不僅抑制TMg對反應(yīng)細(xì)胞的作用，而且表現(xiàn)出將調(diào)節(jié)子本身轉(zhuǎn)換成產(chǎn)生IFN-Y的效應(yīng)子。
通過LPS和IFN- Y活化的樹突細(xì)胞而不是通過細(xì)胞因子-成熟的DC消除調(diào)節(jié)T 細(xì)胞對反應(yīng)細(xì)胞增殖的抑制性作用。由于凋亡標(biāo)記在TLR活化的DC存在下的表達(dá)沒有變化，所以該作用不是由于細(xì)胞死亡造成的。如本文所顯示的，甚至在TLR-活化的樹突細(xì)胞通過半透性膜與調(diào)節(jié)子和反應(yīng)細(xì)胞分開時(shí)，仍能觀察到反應(yīng)細(xì)胞增殖的恢復(fù)。該作用借助于可溶因子，但不依賴于IL-6和IL-12。此外，這種未知的可溶介體表現(xiàn)出至少部分對調(diào)節(jié)子本身而不是反應(yīng)細(xì)胞起作用。如本文中所顯示的，TLR-活化的樹突細(xì)胞可以在T調(diào)節(jié)細(xì)胞中引起細(xì)胞因子產(chǎn)生和效應(yīng)子作用。調(diào)節(jié)T細(xì)胞在TLR-活化的樹突細(xì)胞而不是不成熟的或通過細(xì)胞因子_成熟的樹突細(xì)胞的存在下產(chǎn)生大量IFN- Y。IFN- Y的產(chǎn)生與Thl轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子T-bet的上調(diào)有關(guān)，并且很大部分的產(chǎn)生IFN- Y的調(diào)節(jié)子共同表達(dá)T-bet和FoxP3。 雖然LPS-活化的樹突細(xì)胞對反應(yīng)細(xì)胞增殖的作用是不依賴于IL-12的，但T-bet的上調(diào)被中和抗-IL12抗體抑制。因此，用LPS活化的、單核細(xì)胞衍生的DC可以通過抑制阻抑因子 T細(xì)胞和將這些調(diào)節(jié)子復(fù)原成Thl效應(yīng)子而部分引導(dǎo)免疫應(yīng)答的表型。
冷藏
如之前所闡釋的，本發(fā)明不僅提供用于通過開發(fā)ICAIT-DC而產(chǎn)生優(yōu)異APC的體系和方法，而且提供用于以保持其在解凍后產(chǎn)生對于T細(xì)胞功能重要的信號的能力的方式冷藏這些活化的DC的體系和方法。如在本文中所考慮的，本發(fā)明包括多種冷藏技術(shù)和低溫培養(yǎng)基，如將被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的。例如，在某些實(shí)施方式中，用于培養(yǎng)的細(xì)胞的低溫培養(yǎng)基可以包括約5-10%DMS0或甘油和10-50%血清，如例如人血清。在其它實(shí)施方式中，低溫培養(yǎng)基可以不含血清。在某些實(shí)施方式中，可以使用受控的冷凍速率，而其它實(shí)施方式可以包括使用絕熱容器，其中，與低溫培養(yǎng)基混合的細(xì)胞的管形瓶放置在冷凍機(jī)中，如在約-70°C到_80°C的溫度范圍內(nèi)。本發(fā)明以這種方式提供保藏活化的ICAIT-DC的方法 以便進(jìn)一步促進(jìn)這種細(xì)胞的臨床應(yīng)用和減少對大量的重復(fù)提取(pherisis)和沖洗步驟的需要。如在本文中所考慮的，冷藏技術(shù)可以用于小規(guī)模和大規(guī)模批量作業(yè)。
當(dāng)考慮活化的DC的廣泛用途時(shí)，提供穩(wěn)定供應(yīng)冷藏的、活化的DC的能力代表明顯的優(yōu)勢，該優(yōu)勢可以促進(jìn)這種細(xì)胞的各種治療用途。例如，活化的DC的大規(guī)模培養(yǎng)物可以根據(jù)本發(fā)明的方法以合適大小的等分試樣進(jìn)行冷藏，以便單獨(dú)劑量的細(xì)胞稍后可用于任何特定的免疫治療方案中。在某些實(shí)施方式中，活化的DC可以在_70°C或更低的溫度下被冷藏達(dá)2-24周。在較低的溫度下，諸如約_120°C或或更低，活化的DC可以被冷藏至少一年或更久。
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，DC懸浮在人血清和大約10%DMS0(v/v)中?？蛇x地， 可以使用其他血清型，諸如胎牛血清。懸浮的細(xì)胞被等分成較小的樣本，諸如在1.8ml管形瓶中，并在大約-70°C或或更低的溫度下儲(chǔ)存。在其它實(shí)施方式中，低溫培養(yǎng)基可以包括約20%血清和約10%DMS0，并且，懸浮的細(xì)胞可以在約-180°C下儲(chǔ)存。進(jìn)一步的實(shí)施方式可以包括包含以下的培養(yǎng)基約55%氧化聚明膠——其是血漿擴(kuò)張劑、約6%羥乙基淀粉和約 5%DMS0。其它示例性低溫培養(yǎng)基可以包括約12%DMS0和約25-30%的血清。
雖然本文描述的本發(fā)明可以包括特定濃度的血清，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理19解，低溫培養(yǎng)基中血清的確切量可以變化，并且在一些實(shí)施方式中可以完全不存在，但通常將在約1%到30%的范圍內(nèi)。當(dāng)然，產(chǎn)生大約50%的細(xì)胞存活率和/或大約50%的細(xì)胞回收率的任何濃度的血清均可用于本發(fā)明的任意ICAIT-DC組合物中，以及用于本文所述的任何冷藏方法。優(yōu)選地，在選擇的低溫培養(yǎng)基中回收冷藏的細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞存活率和回收率至少為60%，更優(yōu)選至少約70%，或者甚至期望80%。
類似地，雖然本文所述的本發(fā)明可以包括特定濃度的DMS0，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，在一些實(shí)施方式中，DMSO可以完全不存在，而在其它實(shí)施方式中，從約5%到高達(dá)約20%的濃度可用于低溫培養(yǎng)基中，并包括在本文所述的冷藏方法中。通常，較低濃度的 DMSO是優(yōu)選的，諸如在約5%到約10%之間。然而，在解凍后導(dǎo)致至少50%的細(xì)胞存活率和至少50%的細(xì)胞回收率，優(yōu)選至少60%的細(xì)胞存活率和回收率，更優(yōu)選約70%，更優(yōu)選約80% 和甚至更優(yōu)選約90%以及更高細(xì)胞存活率和回收率的任何濃度的DMSO均可以被使用。
雖然本文所述的本發(fā)明可以包括參考速度控制的冷凍，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，以速度控制或非速度控制方式進(jìn)行冷凍的方法可以被常規(guī)使用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)該理解，本文所述的各種冷藏培養(yǎng)基可以包括血清或者不含血清。不含血清的培養(yǎng)基的實(shí)例可以包括XVIVO 10、XVIV0 15、XVIV0 20, StemPro以及任何商業(yè)可得的不含血清的培養(yǎng)基。但使用不含血清的低溫培養(yǎng)基時(shí)，本發(fā)明的冷藏方法通常不包括感染劑、抗體和可能具有抗原性的外源蛋白質(zhì)以及通常在基于血清的低溫培養(yǎng)基中可能發(fā)現(xiàn)的其它外源分子。
負(fù)載抗原的、活化的DC的冷藏可以在用TLR激動(dòng)劑活化細(xì)胞之后在任何時(shí)刻發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方式中，活化的DC在暴露于TLR激動(dòng)劑后約6-8hr被冷藏。優(yōu)選地，選擇用來冷藏活化的細(xì)胞的時(shí)間點(diǎn)可以基于細(xì)胞的信號產(chǎn)生，尤其是IL-12產(chǎn)生的最大化。
治療應(yīng)用
本發(fā)明包括負(fù)載抗原的、活化的APC的產(chǎn)生，其在從冷藏解凍后產(chǎn)生顯著水平的細(xì)胞因子和趨化因子，其中所述負(fù)載抗原的和活化的APC被用于哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人的免疫治療中。對由APC呈遞的抗原的應(yīng)答可以通過利用本領(lǐng)域中已知的方法監(jiān)測對抗原的溶細(xì)胞性T細(xì)胞應(yīng)答、輔助T細(xì)胞應(yīng)答和/或抗體應(yīng)答的誘導(dǎo)來測量。
本發(fā)明包括增強(qiáng)哺乳動(dòng)物中免疫應(yīng)答的方法，包括如下步驟從獲自哺乳動(dòng)物 (例如，患者)的單核細(xì)胞中產(chǎn)生不成熟的DC ;用包含抗原組成的組合物脈沖不成熟的DC ； 用至少一種TLR激動(dòng)劑活化負(fù)載抗原的DC ;冷藏活化的、負(fù)載抗原的DC ;解凍活化的、負(fù)載抗原的DC ;然后，將活化的、負(fù)載抗原的DC施用給需要其的哺乳動(dòng)物。組合物至少包括抗原，其還可以是在哺乳動(dòng)物中用于離體免疫和/或體內(nèi)治療的疫苗。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物是人。
離體方法在本領(lǐng)域中是悉知的，并在下面被更充分地論述。簡言之，從哺乳動(dòng)物 (優(yōu)選人)中分離細(xì)胞。可將細(xì)胞施用給哺乳動(dòng)物接受者，以提供治療益處。哺乳動(dòng)物接受者可以是人，并且，對于接受者來說，細(xì)胞可以是自體的?？蛇x地，對于接受者來說，細(xì)胞可以是同種異源的、同源的或異種的。
在一個(gè)實(shí)施方式中，通過組合的白細(xì)胞提取和沖洗從患者中獲得外周血單核細(xì)胞?？梢杂肎M-CSF和IL-4在SFM中培養(yǎng)單核細(xì)胞過夜。次日，可以用抗原脈沖不成熟的 DC,接下來使DC接觸IFN- Y和LPS。然后，可將活化的DC懸浮于低溫培養(yǎng)基中并冷凍直到準(zhǔn)備用于免疫治療中。
冷藏的ICAIT-DC可以在與新活化的ICAIT-DC相比能有效產(chǎn)生細(xì)胞的回收率％ 和存活率％的條件下離體進(jìn)行培養(yǎng)。產(chǎn)生自冷藏的樣品的ICAIT-DC可以顯示與新制備的 ICAIT-DC相比相似的穩(wěn)定性。此外，冷藏的成熟DC與那些新制備的DC的比較可以顯示實(shí)質(zhì)上一致的表型以及信號分泌特性。如在本文中所考慮的，在本文所述的各種低溫培養(yǎng)基中，在大約-70°C到-80°C的溫度下，ICAIT-DC可以同時(shí)以小規(guī)模和大規(guī)模進(jìn)行保藏大約2 到24周。在低于約-120°C的溫度下，儲(chǔ)存的持續(xù)時(shí)間可以被不確定地延長或延長至少超過24周而不影響DC的細(xì)胞回收率、存活率和功能性。例如，在某些實(shí)施方式中，活化的細(xì)胞可以被保藏達(dá)至少一年，并仍保留其在解凍后產(chǎn)生信號的能力。本發(fā)明提供在解凍細(xì)胞后有效的回收和存活特性，此外，本文所述的冷藏條件并不影響ICAIT-DC保留其信號特性的能力，如在本文中所闡釋的。
在示例性實(shí)施方式中，在活化ICAIT-DC之后，可以通過將細(xì)胞重新懸浮于預(yù)冷卻的人血清中，隨后將大約10%DMS0加入到樣品中來進(jìn)行冷藏。然后，可將混合物等分到 1.8ml管形瓶中，并在低溫室中在約-80°C冷凍過夜。然后，管形瓶可在次日轉(zhuǎn)移到液氮桶中。冷藏約2到24周之后，可將冷凍的ICAIT D解凍并檢測其回收和存活率。這種ICAIT DC的回收率可以大于或等于約70%，同時(shí)存活率大于或等于約70%。在其它實(shí)施方式中，DC 或者甚至單核細(xì)胞可以在細(xì)胞活化之前進(jìn)行冷藏。
可選地，造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的離體擴(kuò)大的方法描述在美國專利號5，199, 942 中，該專利通過引用被并入本文，可適用于本發(fā)明的細(xì)胞。除了美國專利號5，199，942中描述的細(xì)胞生長因子之外，其它因子諸如flt3-L、IL-l、IL-3和c_kit配體均可用于培養(yǎng)和擴(kuò)大細(xì)胞。
用于鑒別并從細(xì)胞群體中分離細(xì)胞的各種細(xì)胞選擇技術(shù)是已知的。例如，單克隆抗體(或其它特定細(xì)胞結(jié)合蛋白質(zhì))可用于結(jié)合標(biāo)記蛋白質(zhì)或細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的表面抗原蛋白質(zhì)。若干這種標(biāo)記或細(xì)胞表面抗原在本領(lǐng)域中是已知的。
疫苗制劑
本發(fā)明還包括適合用于免疫治療的疫苗制劑。在某些實(shí)施方式中，疫苗制劑被用于預(yù)防和/或治療疾病，諸如癌癥和感染性疾病。在一個(gè)實(shí)施方式中，為了預(yù)防和/或治療癌癥而將根據(jù)本發(fā)明的疫苗施用給患者可以發(fā)生在去除癌癥的外科手術(shù)之前或之后、治療癌癥的化學(xué)治療程序之前或之后和治療癌癥的輻射治療之前或之后及其任意組合。在其它實(shí)施方式中，疫苗制劑可以結(jié)合或聯(lián)合另一組合物或藥品施用給患者。應(yīng)該理解，本發(fā)明還可用于在沒有癌癥的個(gè)體中預(yù)防癌癥，但所述個(gè)體可能處于患癌的風(fēng)險(xiǎn)中。
根據(jù)本發(fā)明制備的癌癥疫苗的施用廣泛適用于預(yù)防或治療癌癥，這部分地取決于形成部分癌癥疫苗的抗原的選擇?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的實(shí)踐被合適地治療的癌癥包括但不限于肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、結(jié)腸癌、頭頸癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、腎癌、骨癌、肝癌、食道癌、腦癌、睪丸癌、子宮癌以及各種白血病和淋巴瘤。
在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的疫苗可來源于待治療的腫瘤或癌細(xì)胞。例如，在治療肺癌中，可以如上文所述處理肺癌細(xì)胞，以產(chǎn)生肺癌疫苗。類似地，乳腺癌疫苗、結(jié)腸癌疫苗、胰腺癌疫苗、胃癌疫苗、膀胱癌疫苗、腎癌疫苗等等均可被產(chǎn)生并用作根據(jù)各種實(shí)踐的免疫治療劑，以預(yù)防和/或治療從中產(chǎn)生疫苗的腫瘤或癌細(xì)胞。
在另外的實(shí)施方式中，如所述的，通過收集由病原體散發(fā)到培養(yǎng)基中的相關(guān)抗原， 也可以制備根據(jù)本發(fā)明的疫苗來治療傷害哺乳動(dòng)物的各種感染性疾病。因?yàn)橛梢鹣嗤膊〉牟煌N類生物體表達(dá)的免疫原性和保護(hù)性抗原的類型的異質(zhì)性，所以可以通過從表達(dá)不同的重要抗原的生物體庫(pool)制備疫苗而制備多價(jià)疫苗。
在本發(fā)明另外的實(shí)施方式中，疫苗可以經(jīng)結(jié)內(nèi)注射到腹股溝結(jié)中而施用?？蛇x地， 而且取決于疫苗靶標(biāo)，可以經(jīng)皮內(nèi)或皮下將疫苗施用到被治療的患者的末端、胳膊和腿。盡管該方法通常對于黑素瘤和其它癌癥——包括預(yù)防或治療感染性疾病是令人滿意的，但也可以使用其它施用途徑諸如經(jīng)肌肉施用或進(jìn)入到血流中。
另外，疫苗可以與佐劑和/或免疫調(diào)節(jié)劑一起給予，以促進(jìn)疫苗的活性和患者的應(yīng)答。本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解這些佐劑和/或免疫調(diào)節(jié)劑，其在可得的公開文獻(xiàn)中已經(jīng)被描述。
如本文所考慮的，如果期望，根據(jù)產(chǎn)生的疫苗的類型，通過在生物反應(yīng)器或發(fā)酵器或適于細(xì)胞大量生長的其它這樣的容器或裝置中培養(yǎng)細(xì)胞，疫苗的產(chǎn)量可以而被按比例提高。在這種設(shè)備中，可以有規(guī)律地、頻繁地或連續(xù)地收集培養(yǎng)基，以在材料或抗原在培養(yǎng)基中降解之前從中回收任何這種材料或抗原。
如果期望，根據(jù)本發(fā)明，含有產(chǎn)生或回收的疫苗或抗原、并適于持續(xù)或間歇釋放的裝置或組合物可以有效植入到身體或局部應(yīng)用到身體，以使這種材料相對緩慢或定時(shí)釋放到身體中。
可以個(gè)別考慮疫苗制備中的其它步驟，以滿足特定疫苗的需要。這種另外的步驟將被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解。例如，某些收集的抗原材料可以被濃縮，并且在一些情況下，可以用洗滌劑處理并進(jìn)行超速離心，以去除移植同種抗原。
本文描述的這些方法決不是囊括性的，并且，適于特定應(yīng)用的另外的方法對于普通的技術(shù)人員來說將是顯而易見的。此外，組合物的有效量可以通過類比法進(jìn)一步接近于已知發(fā)揮期望作用的化合物。
實(shí)施例
現(xiàn)在，通過參考以下實(shí)施例描述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅為了說明目的而被提供， 并且，本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例，相反地，包括由于本文提供的教導(dǎo)而顯而易見的所有變型。
進(jìn)行本文公開的試驗(yàn)，以探索冷藏對負(fù)載抗原的、活化的DC在解凍用于免疫治療時(shí)的功能的影響。解凍的細(xì)胞通過產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子保持針對強(qiáng)Thl細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行調(diào)節(jié)的能力，并進(jìn)一步包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。
現(xiàn)在描述本文公開的試驗(yàn)和實(shí)施例中應(yīng)用的材料和方法。
ICAIT DC的冷藏通過輕輕刮取收獲DC。所有培養(yǎng)基和細(xì)胞均一直保存在濕冰中。通過以大約800RPM離心IOmin溫和洗滌細(xì)胞。小心地將10X IO6個(gè)細(xì)胞懸浮于人血清和10%DMS0中，并轉(zhuǎn)移到I. 8ml管形瓶中。在泡沫絕熱的Nalgen容器中在_80°C下在異丙醇浴中冷凍細(xì)胞。隨著以I°C/min降低溫度由實(shí)驗(yàn)室建立冷凍條件。也可以在生物冷凍機(jī)設(shè)備中冷凍細(xì)胞，該冷凍機(jī)設(shè)備利用N2作為冷凍源。18-24hr之后，將細(xì)胞快速移到液氮桶的汽相中。從外部控制桶的汽相區(qū)域，以便溫度決不高于約_135°C。
DC的解凍將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到37°C水浴中。當(dāng)幾乎解凍時(shí)，通過使含有細(xì)胞的移液管逐漸降低到培養(yǎng)基中并將細(xì)胞逐滴釋放到培養(yǎng)基中，將細(xì)胞懸浮在冰冷的DC培養(yǎng)基中。以 800RPM離心細(xì)胞5min并重新懸浮。細(xì)胞被計(jì)數(shù)并準(zhǔn)備使用。
用于冷藏的ICAIT DC的制備新淘洗的髓樣單核細(xì)胞在6孔微孔板(12X IO6個(gè)細(xì)胞/孔)中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基由不含血清的培養(yǎng)基(SFM Invitrogen Carlsbad CA)組成。 加入的GMCSF的終濃度為50ng/ml，而IL4的終濃度為1000U/ml。細(xì)胞在37°C下在5%C02 中培養(yǎng)過夜。在一些批次中，在16-20hr后，細(xì)胞用足夠的肽脈沖，并再培養(yǎng)6-8hr，然后加入 1000U/ml IFN- Y 用 TLR 激動(dòng)劑 LPS (TLR 4，10ng/ml)或 R848 (TLR8,，I μ g/ml)使樹突細(xì)胞成熟。成熟時(shí)間至少約6hr。然后，使TLR激動(dòng)劑活化的DC準(zhǔn)備用于冷藏或立即使用。
現(xiàn)在描述本文所介紹的試驗(yàn)的結(jié)果。
實(shí)施例I :冷藏的、活化的ICAIT-DC以類似于新產(chǎn)生的ICAIT-DC的水平保持信號產(chǎn)牛
首先，測定冷藏的、活化的DC的存活率和回收率。利用錐蟲藍(lán)排除法，在冷藏之前和解凍并洗滌(通過離心)冷藏的DC之后立即測定冷藏的ICAIT DC的存活率和回收率。 如圖3A和3B中所描述的，顯示兩批次冷藏的DC的5個(gè)單獨(dú)的例子。新制備的和冷藏的 DCl之間的存活率是可比較的，并且，回收率通常在約80-90%之間。與新制備的DCl的回收率相比，冷藏的樣品中的回收率好得多，因?yàn)橥ㄟ^收獲新制備的DCl損失了細(xì)胞。
接下來，比較新ICAIT DC和冷藏的ICAIT DC之間的信號產(chǎn)生，以及與常規(guī)成熟技術(shù)諸如細(xì)胞因子介導(dǎo)的DC成熟(CMDC)的信號產(chǎn)生水平進(jìn)行比較。如圖4A中所描述的，通過ELISA分析，測量到信號3 (IL12)的連續(xù)產(chǎn)生。冷藏的ICAIT DC顯示類似顯著的IL12 產(chǎn)生水平。重要的是，冷藏的ICAIT DC的IL12產(chǎn)量明顯高于冷藏的CMDC或新的CMDC，表明冷藏的ICAIT DC保持優(yōu)于常規(guī)成熟的DC的細(xì)胞因子和趨化因子特性，從而，在引起T細(xì)胞應(yīng)答中保留更多有效的細(xì)胞。如在圖4B中所描述的，在解凍后2hr和12hr時(shí)，IL12的產(chǎn)生水平類似于冷藏前所看到的IL12的產(chǎn)生水平。
為了測定⑶4T細(xì)胞的同種致敏作用，將純化的異源⑶4細(xì)胞(IXlO6Z^L)的兩個(gè)樣品與冷藏的TLR激動(dòng)劑刺激的DC (I X IO5/孔)共培養(yǎng)，與從冷藏的單核細(xì)胞制備的DCl 進(jìn)行比較。如圖5中所描述的，9天以后，收獲T細(xì)胞并在涂有抗CD3和抗CD28抗體的平板上進(jìn)行再刺激。24hr之后，分析上清液中的IFN- Y水平(由T細(xì)胞產(chǎn)生)。
實(shí)施例2 :⑶4+⑶25+T細(xì)胞在不成熟的、佰不是DCl樹突細(xì)胞的存在下抑制反應(yīng)細(xì)胞增殖
之前，顯示純化的CD14+淘洗的單核細(xì)胞在用DC信號傳導(dǎo)劑處理時(shí)獲得活化的DC 的特性(Czerniecki 1997)。最近，顯示這些利用IFN-Y產(chǎn)生的、單核細(xì)胞衍生的、攜帶腫瘤抗原的樹突細(xì)胞和TLR-4激動(dòng)劑LPS (LPS活化的DC)促進(jìn)患有原位導(dǎo)管癌的患者中靶向的免疫應(yīng)答(Czerniecki 等，2007，Cancer Res67:1842-1852)。之前的研究一致表明，TLR 激動(dòng)劑——包括LPS能夠消除由⑶4+⑶25+Foxp3+T細(xì)胞(refs)介導(dǎo)的免疫抑制。因此， 假設(shè)TLR活化的DC可能能夠逆轉(zhuǎn)TMg介導(dǎo)的免疫抑制。
為了檢測該假設(shè)，設(shè)計(jì)試驗(yàn)來比較在不成熟樹突細(xì)胞(iDC)對比LPS活化的單核細(xì)胞衍生的DC存在的情況下，人⑶4+⑶25+T細(xì)胞抑制⑶4和⑶8淋巴細(xì)胞針對TCR刺激 (抗-CD3)的增殖的能力。將I. 25 X IO5個(gè)分選的CD4+CD25+T細(xì)胞與2. 5 X IO5個(gè)CFSE標(biāo)記的未分級的淋巴細(xì)胞(⑶4和⑶8陽性)和I X IO5個(gè)不成熟的樹突細(xì)胞組合。如在圖6 中所描述的，在第五天，與TMgs不存在的情況下相對，在TMgs存在的情況下，CD4和CD8陽性T細(xì)胞的增殖應(yīng)答均被抑制。分選的CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖類似地被抑制，排除了該結(jié)果完全是使用未分級的應(yīng)答細(xì)胞的人為結(jié)果的可能性(數(shù)據(jù)未顯示)。通過對比，包含利用IFN- Y和LPS成熟的DC樹突細(xì)胞使得⑶4和⑶8陽性T細(xì)胞的增殖得以回收，無論調(diào)節(jié)子存在與否。在Iregs和LPS活化的DC存在的情況下，應(yīng)答細(xì)胞增殖類似于調(diào)節(jié)群體不存在情況下的應(yīng)答細(xì)胞增殖。通過用LPS簡單地預(yù)處理iDC(15分鐘)，排除用于使單核細(xì)胞衍生的DC成熟的LPS污染導(dǎo)致該結(jié)果的共培養(yǎng)物。在該情況下阻抑未受影響，表明DC群體需要正常成熟的，并且，污染LPS與該結(jié)果無關(guān)。值得注意的是，利用常規(guī)的、基于細(xì)胞因子的成熟混合物(IL-1、IL-6、TNF-a、PGE2)成熟的樹突細(xì)胞在調(diào)節(jié)子存在的情況下并不完全恢復(fù)效應(yīng)子的增殖。這些結(jié)果表明，單核細(xì)胞衍生的LPS成熟的DC抑制Treg介導(dǎo)的對響應(yīng)抗-⑶3的⑶4和⑶8陽性T細(xì)胞的阻抑。
CFSE的使用，更具體而言，僅僅效應(yīng)細(xì)胞的標(biāo)記是該試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹匾矫?。在許多其它研究中用于證明阻抑的增殖分析要忍受對氚標(biāo)記的胸苷的依賴。在許多報(bào)道中已經(jīng)顯示，調(diào)節(jié)T細(xì)胞不完全是無反應(yīng)性的，而是實(shí)際上具有明顯的增殖潛力，尤其在炎癥信號的背景下(Brinster 等，2005，J Tmmunol 175:7332-7340 ;Klein 等，2003，Proc Natl Acad Sci U S A 100:8886-8891)?；陔皹?biāo)記的胸苷的分析不能排除注意到的增殖差異至少部分歸于調(diào)節(jié)元件的可能性?；贑FSE的分析追蹤增殖，尤其是效應(yīng)細(xì)胞之間的增殖，并直接比較這些效應(yīng)子在Tmss和/或不同樹突細(xì)胞群體存在/不存在情況下的增殖。在這情況下，其消除通過⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)子的增殖促進(jìn)結(jié)果曲解的可能性。
實(shí)施例3 :通過DCl樹突細(xì)胞對Treg功能的抑制是由可溶因子造成的，佰是不依賴于IL-6和IL-12
設(shè)計(jì)試驗(yàn)來表征DCl群體抑制TMg介導(dǎo)的阻抑的機(jī)制。為了測定DCl樹突細(xì)胞是否通過在調(diào)節(jié)T細(xì)胞補(bǔ)體中誘導(dǎo)凋亡來抑制Treg介導(dǎo)的阻抑，將分選的⑶4+⑶25+T細(xì)胞與 iDC和LPS活化的DC共培養(yǎng)，并在24小時(shí)之后比較凋亡標(biāo)記膜聯(lián)蛋白-V和7-AAD的表達(dá)。 假定在第五天注意到增殖差異由很早之前的凋亡事件引起，選擇第一天作為時(shí)間點(diǎn)。如在圖7A中所描述的(對于膜聯(lián)蛋白+/7-AAD+和膜聯(lián)蛋白_/7AAD_組，p>0. 2)，培養(yǎng)24小時(shí)之后，膜聯(lián)蛋白-V和7-AAD的表達(dá)均類似于與任一樹突細(xì)胞群體共培養(yǎng)的Tmss的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，與不成熟樹突細(xì)胞相比，LPS活化的DC群體并不明顯改變TMg凋亡。
已經(jīng)確定LPS活化的、單核細(xì)胞衍生的DC細(xì)胞對T,eg介導(dǎo)的阻抑的影響不是由于凋亡，為了測定該影響是否是依賴于細(xì)胞接觸的或者是由可溶因子介導(dǎo)的，將CFSE標(biāo)記的效應(yīng)細(xì)胞與未標(biāo)記的CD4+CD25+T細(xì)胞在不成熟樹突細(xì)胞存在的情況下共培養(yǎng)，然后加入由半透性Transwelf膜分開的替代的DC群體。當(dāng)不成熟樹突細(xì)胞的另外的補(bǔ)體加入到 Tramwdf膜時(shí)，如圖7B所描述地，在iDC存在的情況下對阻抑沒有影響。然而，當(dāng)LPS活化的DC群體加入到Transwelf膜時(shí)，觀察到Leg介導(dǎo)的阻抑的打斷，其與在I；egs直接與這些 DC共培養(yǎng)時(shí)看到的類似。為了控制DC本身通STranswe|f遷移以打斷阻抑的可能性，將調(diào)節(jié)T細(xì)胞與CFSE標(biāo)記的效應(yīng)子在樹突細(xì)胞不存在的情況下、但加入由膜分開的LPS活化的 DC進(jìn)行共培養(yǎng)。注意到非常少的增殖。這些數(shù)據(jù)總體表明，LPS活化的DC群體能以不依賴于細(xì)胞接觸的方式抑制TMg介導(dǎo)的阻抑。
不希望受任何具體理論所束縛，據(jù)信打斷阻抑的兩個(gè)最可能的可溶介體是IL-12 和IL-6。LPS活化的DC群體特征在于分泌大量的IL-12，其主要涉及發(fā)展Thl免疫應(yīng)答(Xu 等，2003，J Immunol 171:2251-2261)。已經(jīng)顯示，IL-6在LPS介導(dǎo)的Ireg介導(dǎo)的阻抑的體外逆轉(zhuǎn)中是重要的(Pasare 等，2003，Science 299:1033-1036)。IL-6 或 IL-12 的中和在 LPS活化的DC存在的情況下是否會(huì)恢復(fù)I；egs的抑制作用已經(jīng)被測試，如在圖7C中所描述的，其發(fā)現(xiàn)在Tmss和IFN- Y /LPS活化的DC的存在下，效應(yīng)子的增殖受包含中和抗-IL-12 抗體的影響最低，并且基本上未受包含抗-IL-6的影響。結(jié)合Transwdi 試驗(yàn)考慮，這些數(shù)據(jù)表明除了 IL-6和IL-12以外的可溶因子介導(dǎo)受LPS活化的DC影響的阻抑的中斷，而且以不依賴于凋亡的方式進(jìn)行。
前述試驗(yàn)不能夠辨別DC群體是否作用于調(diào)節(jié)子本身或僅僅從Treg抑制釋放反應(yīng)細(xì)胞。因?yàn)镈C作用通過可溶因子發(fā)生，為了評價(jià)用取自LPS活化的DC的培養(yǎng)基預(yù)處理調(diào)節(jié)子或應(yīng)答細(xì)胞是否會(huì)逆轉(zhuǎn)I；eg介導(dǎo)的阻抑，將分選的⑶4+⑶25+T細(xì)胞或CFSE標(biāo)記的效應(yīng)細(xì)胞在等份的培養(yǎng)基和從LPS活化的DC培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。收集這些細(xì)胞并在24小時(shí)之后洗滌，然后，用于共培養(yǎng)。如在圖7D中描述的，用LPS活化的DC培養(yǎng)基預(yù)處理應(yīng)答細(xì)胞對于Ireg介導(dǎo)的阻抑沒有影響。然而，在共培養(yǎng)前預(yù)處理調(diào)節(jié)子在其存在下稍微恢復(fù)反應(yīng)細(xì)胞增殖。僅用LPS(5ng/mL)預(yù)處理TMgs沒有擴(kuò)大增殖(數(shù)據(jù)未顯示)。 這些發(fā)現(xiàn)總體表明，可溶因子可能至少部分地作用于調(diào)節(jié)子本身，以打斷阻抑。
一些最近的研究表明，各種Toll樣受體——包括TLR-2、TLR-4、TLR-8和 TLR-9 能夠消除 Treg 介導(dǎo)的阻抑(Urry 等，2009，J Clin Invest 119:387-398 ；Pasare 等，2003，Science 299:1033-1036 ；Pasare 等，2003，Science 299:1033-1036 ；SutmuIIer 等，2006，J Clin Invest 116:485-494 ;Peng 等，2005，Science 309:1380-1384 ；Porrett 等，2008，J Immunol 181:1692-1699 ;LaRosa 等，2007，Immunol Lett 108:183-188 ； Pasare等，2003，Science 299:1033-1036)。這些作者證明，用LPS活化的樹突細(xì)胞分泌可溶因子，其通過⑶4+⑶25+T細(xì)胞的阻抑來釋放效應(yīng)細(xì)胞。該作用需要IL-6，但其表現(xiàn)出與一種或多種其它細(xì)胞因子協(xié)同作用。本文示出的結(jié)果與這些發(fā)現(xiàn)一致，但將它們延伸到許多方面。首先，利用當(dāng)前用于免疫治療中的人細(xì)胞群體——包括樹突細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。觀察到，在當(dāng)前用于腫瘤免疫治療的人細(xì)胞群體中的相似作用將這些發(fā)現(xiàn)直接變?yōu)榕R床場合 (clinical venue)。其次，雖然這些作者將LPS直接加入到樹突細(xì)胞以誘導(dǎo)它們的作用，但試驗(yàn)顯示，用LPS活化的樹突細(xì)胞——然后轉(zhuǎn)移到含有Iregs和效應(yīng)子的共培養(yǎng)物中——仍能夠消除阻抑。該發(fā)現(xiàn)表明對APC的持久作用，并表明可溶介體的延長分泌能夠打斷阻抑。 在該研究中，LPS通過直接作用于阻抑因子群體或效應(yīng)子而打斷Treg介導(dǎo)的阻抑被排除。相反地是LPS-活化的樹突細(xì)胞在介導(dǎo)該作用。第三，試驗(yàn)顯示不依賴于IL-6和IL-12但表現(xiàn)出受可溶因子介導(dǎo)的作用。在上述研究中，可能該因子與IL-6協(xié)同作用。最后，試驗(yàn)表明，LPS-活化的樹突細(xì)胞可以分泌使調(diào)節(jié)子本身失活的因子而不是僅僅通過TMg控制釋放效應(yīng)子。
實(shí)施例4 :在DCl樹突細(xì)胞存在下，阻抑因子⑶4+⑶25+T細(xì)胞上調(diào)T_bet,下調(diào) FoxP3,并分泌效應(yīng)細(xì)胞因子
最近以若干試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行的研究已經(jīng)證明，各種表型的樹突細(xì)胞能夠?qū)⒄{(diào)節(jié)T細(xì)胞轉(zhuǎn)換成抗原特異性自身免疫效應(yīng)子(Baban等，2009，J Immunol 183:2475-2483, 18 ；Radhakrishnan 等，2008，J Tmmunol 181:3137-3147)。機(jī)械地，該發(fā)現(xiàn)以轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子 FoxP3的下調(diào)為特征，并可以涉及效應(yīng)細(xì)胞因子的上調(diào)。最被一致注意的是將TMgs轉(zhuǎn)換成產(chǎn)生IL-17的效應(yīng)細(xì)胞，其有可能介導(dǎo)Thl7免疫性(Baban等，2009，JImmunol 183:2475-2483,18 ；Radhakrishnan 等，2008，J Immunol 181:3137-3147 ；Beriou 等，2009，Blood 113:4240-4249)。為了測定阻抑的打斷是否反映調(diào)節(jié)T細(xì)胞的簡單失活或它們轉(zhuǎn)換成進(jìn)一步提高免疫應(yīng)答的效應(yīng)細(xì)胞。如果IFN- Y /LPS活化的DC顯示IL-12強(qiáng)烈產(chǎn)生并且是Thl免疫性的強(qiáng)誘導(dǎo)物，假設(shè)與IL-17產(chǎn)生相比，轉(zhuǎn)換成效應(yīng)子會(huì)更可能以 IFN-Y產(chǎn)生為特征。
為了測試該假設(shè)，以典型的1.25:1比例共培養(yǎng)I；egs和⑶4+⑶25-效應(yīng)子，并利用ELISA測量其細(xì)胞因子產(chǎn)生。發(fā)現(xiàn)，與不成熟樹突細(xì)胞共培養(yǎng)的⑶4+⑶25+I；egs和 ⑶4+⑶25-效應(yīng)細(xì)胞均基本上不產(chǎn)生IFN- Y。然而，如在圖8A中所描述的，當(dāng)與LPS活化的單核細(xì)胞衍生的DC共培養(yǎng)時(shí)，兩個(gè)群體均產(chǎn)生明顯量的IFN-Y。為了確認(rèn)測量的細(xì)胞因子由T細(xì)胞而不是樹突細(xì)胞補(bǔ)體產(chǎn)生，在共培養(yǎng)后收集細(xì)胞，并評價(jià)IFN-Y的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生。如在圖8A中所描述的，明顯部分的⑶4+T細(xì)胞是IFN-Y陽性的。通過對比，更少數(shù)目的⑶Ilc陽性樹突細(xì)胞是細(xì)胞因子陽性的(數(shù)據(jù)未顯示)。分選的⑶4+⑶25+群體的純度可靠地>99%，排除細(xì)胞因子產(chǎn)生由污染細(xì)胞介導(dǎo)的可能性(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，相當(dāng)百分比的分選的⑶4+⑶25+群體是FoxP3陰性的(大約20% ;數(shù)據(jù)未顯示)。因此，有可能最可能造成阻抑的FoxP3+細(xì)胞被簡單地失活，并且細(xì)胞因子產(chǎn)生主要來自該FoxP3陰性群。
研究表明TMgs轉(zhuǎn)換成效應(yīng)細(xì)胞使該表型變化與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子FoxP3的下調(diào)和各種細(xì)胞因子的上調(diào)相關(guān)聯(lián)。已知該LPS活化的DC群體使Thl免疫應(yīng)答極性化，這是由于其大量產(chǎn)生IL-12，該IL-12促進(jìn)產(chǎn)生IFN-γ的T細(xì)胞的發(fā)育。Thl細(xì)胞的分化通過若干轉(zhuǎn)錄因子——包括T盒因子T-bet的作用而被程序化。假設(shè)在該研究中Iregs轉(zhuǎn)換成產(chǎn)生IFN- Y 的效應(yīng)細(xì)胞可能與I；eg特異性轉(zhuǎn)錄因子FoxP3的下調(diào)和T-bet的上調(diào)有關(guān)。
為了測試該假設(shè)，將⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)子與不成熟的或LPS活化的DC和可溶⑶3共培養(yǎng)，然后利用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色來分析FoxP3和T-bet的表達(dá)。如在圖8B中所描述的， 與不成熟樹突細(xì)胞相比，LPS活化的DC在⑶4+⑶25+T細(xì)胞中誘導(dǎo)T_bet的上調(diào)。有趣的是，T-bet上調(diào)在FoxP3陽性細(xì)胞中是最顯著的。在第二天，注意到明顯部分的⑶4+⑶25+T 細(xì)胞同時(shí)表達(dá)FoxP3和T-bet。在不成熟樹突細(xì)胞存在下溫育的⑶4+⑶25+T細(xì)胞并不上調(diào) T-bet，并且，非常少的細(xì)胞被測量為雙陽性。假設(shè)在第五天注意到的增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生的差異反映轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的較早變化，選擇稍微早的時(shí)間點(diǎn)(第二天)。
這些數(shù)據(jù)顯示，通過與LPS活化的DC共培養(yǎng)的⑶4+⑶25+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-Y與 T-bet的上調(diào)相關(guān)，尤其在FoxP3陽性細(xì)胞中。這些數(shù)據(jù)還致使由ELISA檢測的細(xì)胞因子通過擴(kuò)張F(tuán)oxP3陰性⑶4+⑶25+T細(xì)胞而產(chǎn)生的可能性變得更小。不希望被任何具體理論所束縛，據(jù)信，大部分T-bet陽性細(xì)胞也是FoxP3陽性的事實(shí)表明，調(diào)節(jié)T細(xì)胞被轉(zhuǎn)換成產(chǎn)生細(xì)胞因子的效應(yīng)子；FoxP3陰性細(xì)胞擴(kuò)張以產(chǎn)生檢測到的細(xì)胞因子可能性較小。轉(zhuǎn)變成效應(yīng)子的Trags至少短暫表達(dá)多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子,這已經(jīng)在向Thl7細(xì)胞的轉(zhuǎn)換中報(bào)道過(Beriou 等，2009，Blood 113:4240-4249 ;Sharma 等，2009，Blood 113:6102-6111)。
由于IL-12對于Thl分化和隨后的IFN- Y產(chǎn)生至關(guān)重要，為了測定調(diào)節(jié)子轉(zhuǎn)換成本文中注意到的、產(chǎn)生IFN-Y的細(xì)胞是否是IL-12依賴性的。雖然顯示這些I-型DC否定26Tregs以不依賴于IL-12的方式對反應(yīng)細(xì)胞增殖的影響，但是，不同信號支配向效應(yīng)子的轉(zhuǎn)換是可行的。因此，T,egs在中和抗-IL-12抗體存在下與LPS活化的DC共培養(yǎng)，并被評價(jià)FoxP3 和T-bet的表達(dá)。如在圖8B中所描述的，發(fā)現(xiàn)T-bet上調(diào)在中和抗體存在下最小。
這些發(fā)現(xiàn)表明將調(diào)節(jié)T細(xì)胞整合到免疫系統(tǒng)的新范例。Iregs當(dāng)前被視為外周耐受(peripheral tolerance)的主要介體,所述外周耐受有助于緩和炎癥免疫應(yīng)答的發(fā)展和防止自身免疫性。目前還不確定產(chǎn)生的免疫應(yīng)答如何被發(fā)起，無論這些細(xì)胞的存在和活性如何?，F(xiàn)在顯示在炎癥背景下T細(xì)胞調(diào)節(jié)中斷的多數(shù)研究提出一個(gè)模型——在致病性攻擊情況中遇到的炎癥信號在發(fā)展免疫應(yīng)答中使調(diào)節(jié)子失活。值得注意的是，TLR活化的 DC恢復(fù)反應(yīng)細(xì)胞的增殖，無論Tregs存在與否。顯示Tregs轉(zhuǎn)換成抗原特異性Thl7細(xì)胞的最近的研究通過表明Iregs可變成產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的部分而將該模型延伸(Baban等，2009, J Tmmunol 183:2475-2483 ；Radhakrishnan 等，2008，J Tmmunol 181:3137-3147 ;Beriou 等，2009，Blood 113:4240-4249 ;Sharma 等，2009，Blood 113:6102-6111)。本文所示出的數(shù)據(jù)表明，在LPS活化的DC群體的存在下，Tregs被募集進(jìn)入效應(yīng)子樣區(qū)室，其主要分泌 IFN-Y，因此表現(xiàn)出更近似于Thl細(xì)胞。有趣地是，該發(fā)現(xiàn)(與關(guān)于增殖應(yīng)答注意到的作用不同)是IL-12依賴性的?？傮w上，這些數(shù)據(jù)針對TMgs如何結(jié)合到發(fā)展免疫應(yīng)答中提出了若干可能性。首先是不同信號引導(dǎo)TMg活性中斷而不是轉(zhuǎn)換成產(chǎn)生細(xì)胞因子的效應(yīng)子。有可能的是，在開始免疫應(yīng)答過程中存在的可溶信號部分地通過決定Iregs是被動(dòng)地旁觀還是作為產(chǎn)生細(xì)胞因子的效應(yīng)子起作用而決定其數(shù)量。其次是Iregs可能被轉(zhuǎn)換成抗原特異性效應(yīng)子的各種亞型(subset) (Thl、Th2、Thl7)，這取決于由攻擊的性質(zhì)決定的免疫應(yīng)答的類型。在分子基礎(chǔ)上，這可能通過上調(diào)譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子(例如T-bet)而發(fā)生，并且，細(xì)胞可能至少短暫地高水平表達(dá)弓I導(dǎo)調(diào)節(jié)和效應(yīng)子表型的因子。然后，這些細(xì)胞可以與類似分化的、釋放的FoxP3陰性細(xì)胞協(xié)同作用，以使免疫性最大化。
關(guān)于腫瘤免疫治療疫苗的設(shè)計(jì)，這些結(jié)果也具有重要性。在我們從二十世紀(jì)八十年代開始的、誘導(dǎo)腫瘤免疫性的嘗試中，調(diào)節(jié)T細(xì)胞已經(jīng)證明是有問題的。若干最近的研究已經(jīng)顯示，各種疫苗接種策略提高調(diào)節(jié)T細(xì)胞的頻率和/或潛能(Lacelle等，2009，Clin Cancer Res 15:6881-6890 ;Eggermont，2009，Clin Cancer Resl5:6745-6747 ；Francois 等，2009，Cancer Res 69:4335-4345)?？赡茏钜俗⒛康氖?，利用常規(guī)細(xì)胞因子混合物~^常常用于產(chǎn)生疫苗——成熟的樹突細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)擴(kuò)大表現(xiàn)出具有阻抑因子功能的 FoxP3高細(xì)胞(Baner jee等，2006，Blood 108:2655-2661)。這可能危害抗腫瘤免疫性的發(fā)展和耐久性。鑒于這些發(fā)現(xiàn)，若干最近的方案將抗腫瘤疫苗與消耗Iregs的劑組合；相對于每一單獨(dú)的劑，劑的組合常常帶來增加的益處(Delluc等，Cancer Immunol Immunother 58:1669-1677 ；Yamamoto 等，2009，Oncol Rep 22:337-343 ；Morse 等，2008，Blood 112:610-618 ;Rech等，2009，Ann N YAcad Sci 1174:99-106 ;Shimizu等，1999，J Immunol 163:5211-5218 ;Turk 等，2004，JExp Med 200:771-782 ;Dannull 等，2005，J Clin Invest 115:3623-3633)。因此，優(yōu)化疫苗功效可能需要破壞正常的調(diào)節(jié)過程。在這方面，LPS活化的單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞疫苗是理想的，因?yàn)樗憩F(xiàn)出抑制而不是活化T細(xì)胞介導(dǎo)的阻抑，并可以帶來將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)換成腫瘤反應(yīng)性效應(yīng)子的優(yōu)勢。盡管沒有關(guān)于LPS活化的DC 疫苗與利用常規(guī)方案成熟的樹突細(xì)胞疫苗的直接比較，在本文中顯示的對Ireg功能的影響支持DC疫苗功效的潛能。增加的益處的是該性質(zhì)是固有的，并不會(huì)攜帶與當(dāng)前在組合方案中使用的各種外源的、消耗TMg的治療有關(guān)的毒性。
本文引用的每一專利、專利申請和出版物的公開內(nèi)容在此通過引用其整體被并入本文。
雖然已經(jīng)通過參考具體實(shí)施方式
公開了本發(fā)明，但顯而易見的是，本領(lǐng)域的其他技術(shù)人員還可以設(shè)計(jì)本發(fā)明的其它實(shí)施方式和變型，而不背離本發(fā)明的真正精神和范圍。 所附權(quán)利要求書意圖被解釋為包括所有這樣的實(shí)施方式及等同變型。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生負(fù)載抗原的、活化的樹突細(xì)胞(DC)以用于免疫治療的方法，包括裝載至少一種抗原到DC中；用至少一種TLR激動(dòng)劑活化所述DC ；冷藏所述DC ;和 解凍所述DC ；其中所述DC產(chǎn)生有效量的至少一種細(xì)胞因子，以產(chǎn)生T細(xì)胞應(yīng)答。
2.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述抗原是腫瘤抗原。
3.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述抗原是微生物抗原。
4.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述TLR激動(dòng)劑是LPS。
5.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述冷藏包括在約_70°C或更低的溫度下冷凍所述DC。
6.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述DC在解凍后的回收和存活率大于或等于約70%。
7.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述DC在解凍后的回收和存活率大于或等于約80%。
8.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述DC被冷藏至少約一周。
9.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述細(xì)胞因子是IL12。
10.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述DC顯示殺傷作用，由此所述DC能夠裂解靶向的癌細(xì)胞。
11.在哺乳動(dòng)物中引起免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括將之前冷藏的組合物施用到需 要其的哺乳動(dòng)物中，所述組合物包括負(fù)載抗原的、活化的DC，其中所述DC裝載抗原并在冷 藏前被活化。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述抗原是腫瘤抗原。
13.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述抗原是微生物抗原。
14.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述TLR激動(dòng)劑是LPS。
15.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述冷藏包括在約_70°C或更低的溫度下冷凍所述DC。
16.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述DC在解凍后的回收和存活率大于或等于約70%。
17.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述DC在解凍后的回收和存活率大于或等于約80%。
18.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述DC被冷藏至少約一周。
19.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述細(xì)胞因子是IL12。
20.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述DC顯示殺傷作用，由此所述DC能夠裂解靶向的癌細(xì)胞。
21.用于在哺乳動(dòng)物中引起免疫應(yīng)答的可保存組合物，所述組合物包括負(fù)載有至少一種抗原的DC ；其中所述DC已通過暴露于至少一種TLR激動(dòng)劑而被活化；和 其中所述DC產(chǎn)生有效量的至少一種細(xì)胞因子，以產(chǎn)生T細(xì)胞應(yīng)答，無論所述組合物是 否已經(jīng)被冷藏。
22.權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述抗原是腫瘤抗原。
23.權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述抗原是微生物抗原。70% c
24.權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述TLR激動(dòng)劑是LPS。
25.權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述組合物已在約-70°C或更低的溫度下被冷藏。
26.權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述DC在解凍后的回收和存活率大于或等于約>
27.權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述DC在解凍后的回收和存活率大于或等于約80%。
28.權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述組合物被冷藏至少約一周。
29.權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述細(xì)胞因子是IL12。
30.權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述DC顯示殺傷作用，由此所述DC能夠裂解靶向的癌細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供用于產(chǎn)生和冷藏樹突細(xì)胞的組合物和方法，產(chǎn)生了更有效的DC基抗腫瘤疫苗，所述樹突細(xì)胞具有產(chǎn)生較強(qiáng)信號給T細(xì)胞的優(yōu)異能力。本發(fā)明包括成熟的、由Toll樣受體激動(dòng)劑活化的負(fù)載抗原的DC，所述Toll樣受體激動(dòng)劑誘發(fā)臨床上有效的免疫應(yīng)答，優(yōu)選在用于疾病過程的早期時(shí)。本發(fā)明的DC產(chǎn)生期望水平的細(xì)胞因子和趨化因子，而且還具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。細(xì)胞可以被冷藏，并被解凍以待后用，從而在疫苗生產(chǎn)期間減少對重復(fù)提取和沖洗過程的需要。這些方法也可用于直接靶向致癌信號傳導(dǎo)通道和癌干細(xì)胞中涉及的分子。
文檔編號A61K39/00GK102933228SQ201180024046
公開日2013年2月13日 申請日期2011年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月15日
發(fā)明者B·J·茨爾尼基, U·科爾多夫斯基, S·許, G·K·柯斯基 申請人:賓夕法尼亞大學(xué)董事會(huì)