產(chǎn)松二糖菌株及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種能夠產(chǎn)生松二糖的普城沙雷菌菌株并且涉及其用途。
CNCM I-4604
2012.03.07
【專利說明】產(chǎn)松二糖菌株及其用途 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種產(chǎn)松二糖菌株并且涉及其用途。
[0002] 發(fā)明的技術(shù)背景
[0003] 松二糖是一種藏糖同分異構(gòu)體，包括經(jīng)由一個(gè)a (1 - 3)鍵連接的一個(gè)葡萄糖單 元和一個(gè)果糖單元。它是蜂蜜的一種典型糖，在蜂蜜中它W通常在0與3%之間的低量存 在。
[0004] 例如，它可W通過松H糖的部分水解產(chǎn)生，從而產(chǎn)生葡萄糖和松二糖的等摩爾混 合物（CS240545)。另外，它還可W通過嗜熱脂肪芽抱桿菌的環(huán)麥芽糖糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶對 淀粉與果糖的混合物的作用而產(chǎn)生（JP 5252974/93 ;化ibuya (涉谷）等人，2004, J. Appl. Glycosci.(應(yīng)用糖類科學(xué)雜志），51,223-227)。收率僅為45%并且該方法包括兩個(gè)酶步 驟。
[0005] 最終，提議使用來源于多糖奈瑟球菌（化AS)的重組淀粉藏糖酶將藏糖轉(zhuǎn)化為松 二糖（Wang (王）等人，2012,化Od Chemistry (食品化學(xué)），132,773-779)。收率為 56%并 且該方法需要一種重組酶。
[0006] 本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知松二糖：
[0007] -具有0. 5的相對較弱的甜化能力（將藏糖值指定為1)和低的致離性，
[000引-可W容易地結(jié)晶，
[0009] -是高度可溶的。
[0010] 另外，松二糖是一種a-葡糖巧酶抑制劑，在蓬普氏病（Pomp' S disease)的診斷 中是有用的。
[0011] 它在食品、化妝品、藥物和診斷領(lǐng)域中也是引人關(guān)注的。
[0012] 松二糖還是一種信息分子。與其他單糖一起，松二糖因此已經(jīng)被用于模擬光合作 用中的不同藏糖信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
[0013] 松二糖還可能涉及在植物防御機(jī)制中，經(jīng)由MAPK(絲裂原活化蛋白激酶）的活化 產(chǎn)生防御性物質(zhì)。
[0014] 因此，用于產(chǎn)生松二糖的替代性方法是有用且令人希望的，特別是在工業(yè)水平具 競爭性的方法。
[001引發(fā)明概述
[0016] 急于研發(fā)一種比現(xiàn)有技術(shù)中描述的那些有效得多且便宜得多的生產(chǎn)方法，在其研 究過程中，本申請公司已經(jīng)鑒定了一種具有產(chǎn)松二糖能力的新穎菌株。
[0017] 本發(fā)明因此涉及一種能夠產(chǎn)生松二糖的普城沙雷菌細(xì)菌菌株。該一菌株在2012 年3月7日在編號(hào)1-4604下存放于CNCM[法國國家微生物菌種保藏中也Optional Collection of Microorganism Cultures)]中。
[0018] 它還涉及一種普城沙雷菌菌株，其特征在于它能夠產(chǎn)生松二糖，并且其特征還在 于它通過1-4604菌株的培養(yǎng)、誘變或遺傳修飾獲得自所述菌株。
[0019] 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的普城沙雷菌菌株能夠W至少20 %、30 %、40 %或50 %的松 二糖/藏糖重量收率產(chǎn)生松二糖。
[0020] 本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)松二糖的方法，該方法包括培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的菌株并且 回收松二糖，W及任選地純化松二糖。
[0021] 優(yōu)選地，將該菌株在5. 5與7之間的抑下，從0. 5至1. 5vvm的曝氣下，在250與 700巧m之間的攬拌條件下，并且在從25C至38C的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。W另外優(yōu)選的方式， 將該菌株在維持為6的抑，從27C至3(TC的溫度，250與35化pm之間的攬拌條件，W及Ivvm 的曝氣下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0022] 優(yōu)選地，在生產(chǎn)培養(yǎng)基中的起始藏糖濃度在100與300g^之間，優(yōu)選是200g^。
[0023] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，該生產(chǎn)培養(yǎng)基包括2至6g^的酵母提取物或10至30g/ 1的玉米漿（例如由本申請公司出售的索羅斯*( Solulys*' (MSE)，優(yōu)選是大約Ag/ 1的酵母提取物。優(yōu)選地，松二糖的純化包括一個(gè)發(fā)酵果汁離也（fermentation must centri化gation)步驟，用粉末狀炭黑處理和上清液的過濾的步驟，一個(gè)除鹽步驟，一個(gè)用 IkD的截留闊值進(jìn)行超濾的步驟，W及然后的一個(gè)濾液結(jié)晶步驟。
[0024] 本發(fā)明還涉及一種能夠獲得或借助根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的富松二糖組合物。優(yōu) 選地，它包括按DP2的總重量計(jì)至少80%的松二糖、按DP2的總重量計(jì)0. Ol%至10%的海 藻糖W及按DP2的總重量計(jì)0. Ol %至5%的異麥芽麗糖。
[00巧]本發(fā)明涉及一種用于制備食品組合物的方法，該方法包括提供借助根據(jù)本發(fā)明的 方法獲得的松二糖并且將獲得的松二糖慘入進(jìn)食品組合物中。本發(fā)明還涉及一種用于制備 食品組合物的方法，該方法包括提供借助根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的富松二糖組合物并且將 獲得的組合物慘入進(jìn)食品組合物中。
[0026] 最終，本發(fā)明涉及一種用于制備能夠獲得或借助根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的富松二 糖組合物的方法，目的在于食品、化妝品、藥物、診斷及植物檢疫領(lǐng)域。
[0027] 發(fā)明詳細(xì)說明
[0028] 完全出人意料地，本 申請人:已經(jīng)成功地在來源于±壤采樣活動(dòng)的非常大量的微生 物中鑒定并分離了一種能夠有效地產(chǎn)生松二糖的菌株。
[0029] 被鑒定的菌株是一種普城沙雷菌細(xì)菌并且在此被叫做1-4604。它在編號(hào)1-4604 下于2012年3月7體提交于CNCM。隨后可W將該一菌株在本申請中指定為"1-4604"。
[0030] 該一菌株具有大量產(chǎn)生松二糖的有利特性。的確，它使得W超過35%的松二糖/ 藏糖重量收率獲得松二糖成為可能。更確切地說，當(dāng)使用糖蜜基質(zhì)時(shí)，觀察到大約38 %的平 均松二糖/藏糖收率。當(dāng)使用藏糖基質(zhì)時(shí)，該一收率增加至超過50%。
[0031] 相對于其產(chǎn)松二糖能力，該一菌株絕對是獨(dú)創(chuàng)的。的確，諸位發(fā)明人還已經(jīng)測試了 同一屬的H種菌株，即普城沙雷菌ATCC 15928、無花果沙雷菌GRIMONT 4024、W及無花果 沙雷菌DSM 4569。通過比較測試的該些菌株都沒有顯示出產(chǎn)生松二糖的絲毫能力。
[0032] 因此，本發(fā)明涉及該1-4604菌株并且涉及例如通過其培養(yǎng)、基因工程化或誘變來 源于該一菌株的細(xì)菌，該細(xì)菌保留產(chǎn)松二糖特性。誘變可W是位點(diǎn)定向的和/或隨機(jī)的。具 體地說，根據(jù)本發(fā)明的普城沙雷菌菌株具有W至少20 %、30 %、40 %或50 %的松二糖/藏糖 重量收率產(chǎn)生松二糖的能力。優(yōu)選地，收率是至少30%。
[0033] 本發(fā)明涉及一種組合物，該組合物包括一種根據(jù)本發(fā)明的普城沙雷菌菌株（特別 是1-4604菌株）W及任選地一種培養(yǎng)基。優(yōu)選地，該培養(yǎng)基適于由根據(jù)本發(fā)明的普城沙雷 菌菌株（特別是1-4604菌株）生產(chǎn)松二糖。具體地說，該一培養(yǎng)基包括藏糖。理想地，它 包括大約100至300g^、大約100至200g^或大約200g^的藏糖。更確切地說，該培養(yǎng) 基可W包括藏糖并且還有酵母提取物和/或玉米漿（例如由本申請公司出售的柴羅斯K 048巧。
[0034] 在本文件中應(yīng)該理解的是，術(shù)語"大約"意指±10%，優(yōu)選是±5%。例如，對于100 的值，"大約100"意指在90與110之間，優(yōu)選在95與105之間。
[00巧]本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的普城沙雷菌菌株（特別是1-4604菌株）在發(fā)酵反應(yīng)中 的用途。具體地說，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的普城沙雷菌菌株（特別是1-4604菌株）用于 生產(chǎn)松二糖的用途。
[0036] 本發(fā)明還涉及一種用于生產(chǎn)松二糖的方法，該方法包括培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的菌株并 且回收松二糖，W及任選地純化松二糖。具體地說，該菌株的培養(yǎng)在藏糖的存在下，在適于 生產(chǎn)松二糖的發(fā)酵條件下進(jìn)行。
[0037] 優(yōu)選地，在生產(chǎn)或發(fā)酵步驟之前，該菌株已經(jīng)經(jīng)受預(yù)培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)步驟。預(yù)培養(yǎng) 和傳代培養(yǎng)基包括藏糖，例如從大約50至ISOg^的藏糖，優(yōu)選大約IOOg^。該些培養(yǎng)基還 包括營養(yǎng)素。具體地說，它們可W包括酵母提取物和/或玉米漿（例如由本申請公司出售 的索羅if? 048E)。
[00測例如，它們可W包括5-15g/l的酵母提取物和/或5至30g/l的索羅if 048E。 具體地說，它們可W包括大約IO-ISg^的酵母提取物，或大約IO-ISg^的酵母提取物和大 約胸索羅斯* 04祀，或大約30g/l的紫羅斯* 04祀。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，它們包 括大約l0-15g/l的酵母提取物。預(yù)培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)步驟在從25C至38°，優(yōu)選從27C至 3(TC，并且特別是在大約3(TC的溫度下進(jìn)行。預(yù)培養(yǎng)步驟可W持續(xù)從10至30h，優(yōu)選大約15 至25h。傳代培養(yǎng)步驟可W持續(xù)從5至25h，優(yōu)選大約10至20h。起始抑可W在大約5. 5與 大約7之間。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，起始抑是大約7。攬拌可W在大約100與2(K)巧m(每 分鐘轉(zhuǎn)數(shù)）之間。它優(yōu)選是大約150和17化pm。
[0039] 優(yōu)選地，藏糖W大約100與大約300g^之間的初始濃度存在于生產(chǎn)培養(yǎng)基中。優(yōu) 選地，它W大約100至200g/l的初始濃度存在。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，它W大約200g/l的 初始濃度存在?？蒞將藏糖W純化形式或W糖蜜的形式添加。可W在生產(chǎn)或發(fā)酵的開始， 在生產(chǎn)或發(fā)酵過程中若干次，或在生產(chǎn)或發(fā)酵過程中連續(xù)地將其添加至培養(yǎng)基中。在一個(gè) 優(yōu)選實(shí)施例中，在生產(chǎn)或發(fā)酵的開始將其添加至培養(yǎng)基中。
[0040] 關(guān)于抑條件，在松二糖生產(chǎn)的優(yōu)化過程中，已經(jīng)確定抑可W在大約5. 5與7之間， 優(yōu)選在大約5. 5與大約6. 5之間，甚至更優(yōu)選在大約6處。優(yōu)選地，在生產(chǎn)步驟中維持抑。 在一個(gè)實(shí)施例中，在生產(chǎn)步驟過程中，將抑維持在大約抑6處。
[0041] 關(guān)于攬拌條件，伴隨攬拌，特別是伴隨在大約250與大約70化pm之間，優(yōu)選在300 與50化pm之間的攬拌進(jìn)行培養(yǎng)?？蒞使用磁力棒或本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的任何其 他手段進(jìn)行攬拌。在一個(gè)實(shí)施例中，伴隨大約30化pm的攬拌進(jìn)行培養(yǎng)。
[0042] 關(guān)于曝氣條件，伴隨從0. 5至1. 5vvm(每分鐘每體積的空氣量）的曝氣進(jìn)行培養(yǎng)。 在一個(gè)實(shí)施例中，伴隨大約Ivvm的曝氣進(jìn)行培養(yǎng)。
[0043] 關(guān)于溫度條件，在大約25C與大約38C之間的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施例 中，在27°C與3(TC之間的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0044] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，該生產(chǎn)培養(yǎng)基包括2至6g^的酵母提取物或10至30g/l 的索羅斯* 048E，優(yōu)選是大約4g^的酵母提取物。
[0045] 可W通過受限于藏糖的總消耗的最大時(shí)間段確定培養(yǎng)時(shí)間段。優(yōu)選地，生產(chǎn)培養(yǎng) 持續(xù)至少20h，典型地超過30h。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，生產(chǎn)培養(yǎng)持續(xù)在30與5化之間，優(yōu) 選是大約40h。
[0046] 優(yōu)選地，在觀察如W上詳細(xì)描述的一個(gè)或多個(gè)發(fā)酵條件的同時(shí)進(jìn)行生產(chǎn)步驟。優(yōu) 選地，觀察所有條件。
[0047] 發(fā)酵步驟后，可W通過本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員本身已知的任何方法從發(fā)酵培養(yǎng)基 中回收生物質(zhì)；例如，可W通過微過濾或離也，或經(jīng)由用水溶液的連續(xù)濃度-稀釋物洗涂來 從發(fā)酵罐中提取生物質(zhì)并簡單濃縮。
[0048] 松二糖收獲步驟后，該方法可W包括一個(gè)松二糖純化步驟。該一純化步驟可W包 括一個(gè)發(fā)酵果汁離也步驟，回收上清液。該一上清液可W經(jīng)受另外的純化步驟。該些純化 步驟可W選自炭黑處理步驟、過濾步驟、超濾步驟、除鹽步驟、結(jié)晶步驟及其組合。在一個(gè)具 體實(shí)施例中，純化包括一個(gè)炭黑處理步驟、一個(gè)過濾步驟、一個(gè)除鹽步驟、一個(gè)用IkD的截 留闊值進(jìn)行超濾的步驟W及一個(gè)結(jié)晶步驟。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，它包括該些W其出現(xiàn)在 列表中的順序進(jìn)行的步驟。
[0049] 本發(fā)明還涉及一種能夠獲得或通過根據(jù)本發(fā)明的普城沙雷菌菌株（特別是 1-4604菌株）的發(fā)酵獲得的發(fā)酵性來源的松二糖。因此，本發(fā)明涉及能夠獲得或借助根據(jù) 本發(fā)明的生產(chǎn)方法獲得的松二糖。
[0050] 本發(fā)明還涉及一種富松二糖組合物，該松二糖能夠獲得或通過根據(jù)本發(fā)明的普城 沙雷菌菌株（特別是1-4604菌株）的發(fā)酵，或換言之，借助根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法獲得。 該一組合物包括按DP2的總重量計(jì)至少80%的松二糖，優(yōu)選至少85%、90%或95%。術(shù)語 "DP2"旨在意指"二糖"。該組合物還可W包括海藻糖和/或異麥芽麗糖。海藻糖優(yōu)選W按 DP2的總重量計(jì)在0. 01%與10%之間的比例存在于該組合物中。異麥芽麗糖優(yōu)選W按DP2 的總重量計(jì)在0. 01%與5%之間的比例存在于該組合物中。優(yōu)選地，該組合物包括海藻糖 和異麥芽麗糖。其他雜質(zhì)也可W存在，例如葡糖化甘油酸、果糖、2-麗戊二酸、巧樣酸、玻巧 酸和/或葡糖化乳酸。
[0051] 松二糖在食品工業(yè)中是特別有用的。具體地說，可W將其慘入進(jìn)飲料、糖果產(chǎn)品、 谷物棒、巧克力味產(chǎn)品等中。因此，本發(fā)明涉及一種食品組合物，該食品組合物包括一種富 松二糖組合物，該松二糖能夠獲得或通過根據(jù)本發(fā)明的普城沙雷菌菌株（特別是1-4604菌 株）的發(fā)酵獲得。
[0052] 最終，本發(fā)明涉及一種用于制備食品組合物的方法，該方法包括提供借助根據(jù)本 發(fā)明的方法獲得的松二糖并且將獲得的松二糖慘入進(jìn)食品組合物中。優(yōu)選地，該食品組合 物是一種飲料、糖果產(chǎn)品、谷物棒或巧克力味產(chǎn)品。
[0053] 在食品、化妝品、藥物、診斷及植物檢疫領(lǐng)域中利用該一組合物也是可能的。
[0054] 借助W下意在示意性的且非限制性的實(shí)例將更加清楚地理解本發(fā)明。
[00對實(shí)例
[0056] 實(shí)例1-通過1-4604菌株從藏糖生產(chǎn)松二糖W及與同一屬和種的菌株的比較
[0057] 用在本發(fā)明中鑒定的1-4604菌株并且用同一屬和種的其他菌株測試從藏糖發(fā)酵 松二糖，特別是W下菌株：
[0058] 普城沙雷菌ATCC 15928
[0059] 無花果沙雷菌GRIMONT 4024
[0060] 無花果沙雷菌DSM 4569
[0061] 1.結(jié)果
[0062] 1. 1.用1-4604菌株進(jìn)行發(fā)酵
[0063]
【權(quán)利要求】
1. 一種普城沙雷菌菌株，在2012年3月7日在編號(hào)1-4604下存放于CNCM[法國國家 微生物菌種保藏中心]中。
2. -種普城沙雷菌菌株，其特征在于它能夠產(chǎn)生松二糖，并且其特征還在于它通過如 在權(quán)利要求1中所述的菌株的培養(yǎng)、誘變或遺傳修飾獲得自所述菌株。
3. 如在權(quán)利要求1和2的任一項(xiàng)中所述的菌株，其特征在于它能夠以至少20%、30%、 40 %或50%的松二糖/蔗糖重量收率產(chǎn)生松二糖。
4. 在權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的菌株用于生產(chǎn)松二糖的用途。
5. -種用于生產(chǎn)松二糖的方法，該方法包括培養(yǎng)如在權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的 菌株并且回收松二糖，以及任選地純化松二糖。
6. 如在權(quán)利要求5中所述的方法，其特征在于將該菌株在5. 5與7之間的pH下，從0. 5 至1. 5vvm的曝氣下，在250與700rpm之間的攪拌條件下，并且在從25°C至38°C的溫度下 進(jìn)行培養(yǎng)。
7. 如在權(quán)利要求5或6中所述的方法，其特征在于將該菌株在維持為6的pH，從27°C 至30°C的溫度，250與350rpm之間的攪拌條件，以及l(fā)vvm的曝氣下進(jìn)行培養(yǎng)。
8. 如在權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中在該生產(chǎn)培養(yǎng)基中的起始蔗糖濃度 在100與300g/l之間，優(yōu)選200g/l。
9. 如在權(quán)利要求5至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中該生產(chǎn)培養(yǎng)基包括2至6g/l的酵母 提取物或10至30g/l的索羅斯（Solulys)048E，優(yōu)選是大約4g/l的酵母提取物。
10. 如在權(quán)利要求5至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中松二糖的純化包括一個(gè)發(fā)酵果汁離 心步驟，用粉末狀炭黑處理和上清液的過濾的步驟，一個(gè)除鹽步驟，一個(gè)用lkD的截留閾值 進(jìn)行超濾的步驟，以及然后的一個(gè)濾液結(jié)晶步驟。
11. 一種富松二糖組合物，借助如在權(quán)利要求5至9中任一項(xiàng)所述的方法獲得。
12. 如在權(quán)利要求11中所述的組合物，該組合物包括按DP2的總重量計(jì)至少80%的松 二糖、按DP2的總重量計(jì)0.01 %至10%的海藻糖以及按DP2的總重量計(jì)0.01 %至5%的異 麥芽酮糖。
13. -種用于制備食品組合物的方法，該方法包括提供一種借助如在權(quán)利要求5至10 中任一項(xiàng)所述的方法獲得的富松二糖組合物并且將所獲得的組合物摻入進(jìn)該食品組合物 中。
14. 一種用于制備借助如在權(quán)利要求5至9中任一項(xiàng)所述的方法獲得的富松二糖組合 物的方法，目的在于食品、化妝品、藥物、診斷及植物檢疫領(lǐng)域。
【文檔編號(hào)】A23L1/09GK104302758SQ201380025796
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年5月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月16日
【發(fā)明者】索菲·德弗勒坦, 達(dá)民·雷克布 申請人:羅蓋特兄弟公司