一種高效提取厭氧顆粒污泥微生物總dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于環(huán)境分子生物學【技術領域】，具體涉及一種高效提取厭氧顆粒污泥微生物總DNA的方法，步驟如下：菌體離心；固體物用DNA貯存液I洗后加入DNA貯存液Ⅰ、溶菌酶溫育，加入貯存液Ⅱ、貯存液Ⅲ、貯存液Ⅳ溫育；加入酚、氯仿和異戊醇混合液，輕柔8字混勻；離心取上清，加入氯仿和異戊醇混合液，輕柔8字混勻；離心取上清，加入異丙醇，輕柔混勻，－20℃，靜置30min；室溫離心；75%乙醇洗一遍，室溫離心12000r/min，5min；加入貯存液Ⅴ重懸，4℃過夜溶解，即得厭氧顆粒污泥微生物總DNA。本發(fā)明簡化了微生物總DNA提取步驟，實現(xiàn)了快速、高效的提取厭氧顆粒污泥的微生物總DNA。
【專利說明】一種高效提取厭氧顆粒污泥微生物總DNA的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境分子生物學【技術領域】，具體涉及一種高效提取厭氧顆粒污泥微生物總DNA的方法。
【背景技術】
[0002]顆粒污泥由于具有較好的沉降性能，容積負荷高，抗沖擊負荷能力強等優(yōu)點，目前已成為難降解物質(zhì)廢水生物處理的主體。研究顆粒污泥中的微生物群落對于探討廢水處理的反應機理、工藝改進、優(yōu)化控制都具有重要的作用。但是，由于傳統(tǒng)的分析方法的限制，不能充分揭示微生物群落結構和空間分布的有關信息。目前，借助分子生物學技術可以有效分析微生物的群落組成、結構多樣性和種群變化。而大多數(shù)分子生物學實驗都是以提取研究對象的基因組總DNA為前提，因此，建立高效、可靠的微生物總DNA提取方法就顯得尤為重要。
[0003]有關從水樣、土壤、活性污泥和海洋沉積物中提取微生物DNA的方法已有大量報道，但是從厭氧顆粒污泥中提取DNA的方法還很少見。
[0004]迄今為止，國內(nèi)外對活性污泥樣本DNA提取方法的研究較少，且大多研究只比較少數(shù)方法，說服力不強。另外，對一些方法的適用性還存在異議，如Aguilera等發(fā)現(xiàn)對于沉積物當中的嗜酸性微生物，運用珠磨勻漿法可以獲得95%以上的高細胞裂解率；而鄭雪松等叫發(fā)現(xiàn)對于活性污泥的微生物，珠磨勻漿法得到的DNA產(chǎn)量最低，且含有大量的蛋白質(zhì)和酚類雜質(zhì)。由于顆粒污泥中除具有帶有代謝活性的微生物群體外，還具有內(nèi)源代謝、自身氧化的殘留物；污水帶入的難降解的有機物和無機物等物質(zhì)，其中存在的腐殖物質(zhì)等容易干擾DNA的檢測，這些污染可能抑制PCR中的Taq DNA聚合酶的活性，干擾限制性內(nèi)切酶的消化，降低轉(zhuǎn)化效率和DNA`的雜交特異性等，因此高純度的DNA對后續(xù)的工作有著重要影響。
[0005]但是，目前報道的厭氧顆粒污泥提取微生物總DNA的方法有很多缺點，如:提取的DNA提取總量少、純度低，含有PCR酶抑制劑，步驟繁瑣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種可用于厭氧顆粒污泥的微生物總DNA提取的方法。該方法具有DNA提取效率高、純度高，不含PCR酶抑制劑等優(yōu)點。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術方案:
[0008]一種提取厭氧顆粒污泥微生物總DNA的方法，包括下列步驟:
[0009]I)菌體離心，
[0010]量取一定體積的菌體，放入離心機離心；棄去上層清夜,底層固體物用DNA貯存液I洗2遍；加入DNA貯存液I，混勻；
[0011]2)加入溶菌酶，混勻，30~40°C溫育0.5~2h，加入貯存液II，混勻，30~40°C溫育0.5~2h ;[0012]3)加入貯存液III，混勻；
[0013]4)加入貯存液IV，混勻，60~70°C溫育5~15min ；
[0014]5)加入酹、氯仿和異戍醇混合液,輕柔8字混勻5~15min ;室溫靜置5~15min ；離心；
[0015]6)取上清，加入氯仿和異戊醇混合液，輕柔8字混勻5~15min ;室溫靜置5~15min ;離心；
[0016]7)取上清，加入異丙醇，輕柔混勻，-20°C，靜置30min ;室溫離心；
[0017]8) 75%乙醇洗一遍，晾干；室溫離心；
[0018]9)加入貯存液V重懸，4°C過夜溶解，即得厭氧顆粒污泥微生物總DNA。
[0019]優(yōu)選的，步驟I)所述的菌體離心為，在7000~9000r/min速度離心3~8min ;更優(yōu)選的，在8000r/min速度離心5min。
[0020]優(yōu)選的，步驟I)所述的固體物用DNA貯存液I洗2遍，DNA貯存液I每次使用量為菌體體積的5~10倍；步驟I)所述的加入DNA貯存液I，加入量為菌體體積的10~15
倍。
[0021]優(yōu)選的，步驟2)所述的溶菌酶的加入量為0.05~0.2g/ml菌體；更優(yōu)選的，溶菌酶的加入量為0.01g/ml菌體。
[0022]優(yōu)選的，步驟2)所述的貯存液II的加入量為30~80 μ L/ml菌體。更優(yōu)選的，步驟2)所述的貯存液II的加入量為50 μ L/ml菌體。
[0023]優(yōu)選的，步驟3)所述的貯存液III的加入量為70~120 μ L/ml菌體。更優(yōu)選的，步驟3)所述的貯存液III的加入量為100 μ L/ml菌體。
[0024]優(yōu)選的，步驟4)所述的貯存液IV的加入量為60~100 μ L/ml菌體。更優(yōu)選的，步驟4)所述的貯存液III的加入量為80 μ L/ml菌體。
[0025]優(yōu)選的，步驟4)中，65°C溫育lOmin。
[0026]優(yōu)選的，步驟5)中，酚、氯仿和異戊醇混合液的加入量為700~900μ L/ml菌體；更優(yōu)選800 μ L/ml菌體。酚:氯仿:異戊醇=22~28: 20~26: 1，體積比。更優(yōu)選的，酹:氯仿:異戍醇=25: 24: I,體積比。
[0027]優(yōu)選的，步驟6)中，氯仿和異戊醇混合液的加入量為700~900 μ L/ml菌體；更優(yōu)選800 μ L/ml菌體。氯仿:異戍醇=20~26: I,體積比。更優(yōu)選的，氯仿:異戍醇=24: I，體積比。
[0028]優(yōu)選的，步驟5)和6)所述的離心為11000~13000r/min、2~8 °C,離心5~15min。更優(yōu)選的，步驟5)和6)所述的離心為12000r/min、4°C,離心lOmin。
[0029]優(yōu)選的，步驟7)所述的異丙醇加入量為700~900 μ L、/ml菌體；更優(yōu)選，異丙醇加入量為800 μ L/ml菌體。優(yōu)選的，步驟7)和8)所述的室溫離心為12000~14000r/min離心5~15min。更優(yōu)選的,步驟7)所述的室溫離心為13000r/min離心IOmin ;步驟7)和
8)所述的室溫離心為12000r/min, 5min。
[0030]優(yōu)選的，步驟9)中貯存液V的加入量為30 μ L/ml菌體；更優(yōu)選的，貯存液V的加入量為30 μ L/ml菌體。
[0031]本發(fā)明所述的菌體為黑色顆粒狀厭氧活性污泥，顆粒加入1.5ml的EP管確定體積。[0032]ImL菌體離心,8000r/min, 5min,DNA常用忙存液I洗2遍。加入565mL忙存液I，混勻。加入0.1g溶菌酶，混勻，37°C溫育lh，加入5(^1^貯存液11，混勻，371:溫育lh。加入100 μ L貯存液III，混勻，加入80 μ L貯存液IV，混勻，65 °C溫育lOmin。加入800yL酚:氯仿:異戍醇，輕柔8字混勻，IOmin0離心12000r/min, 4°C, IOmin0取上清,加入800 μ L酹:氯仿:異戊醇混合液(酚:氯仿:異戊醇=25: 24: 1，體積比)，輕柔8字混勻，lOmin。離心UOOOr/mir^fC, lOmin。取上清,加入800 μ L氯仿:異戍醇混合液(氯仿:異戍醇=24:1,體積比),輕柔8字混勻，IOmin,離心12000r/min,4°C, lOmin。取上清,加入800 μ L異丙醇，輕柔混勻，一 20°C,30min。室溫離心13000r/min, lOmin。75%乙醇洗一遍，晾干。室溫離心12000r/min，5min。30 μ L貯存液V重懸，4°C過夜溶解，備用。
[0033]提取DNA 貯存液 1: lmmol EDTA+1OmmoI Tris-Hcl 配制成 100ml 溶液；EDTA 為乙二胺四乙酸Jris-Hcl為三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液；
[0034]提取DNA 貯存液 I1:20mg/mL 蛋白酶 K20 μ L+10%SDS10ml 配制成 100ml 溶液；SDS
為十二烷基磺酸鈉；
[0035]提取DNA 貯存液III:5mol NaCl+0.l%CTAB10ml 配制成 100ml 溶液；CTAB 為十六烷
基三甲基溴化銨；
[0036]提取DNA 貯存液IV:10%CTAB10ml+0.8mol NaCl50ml 配制成 100ml 溶液；[0037]提取DNAIC存液V:lmmol EDTA+1OmmoI Tri s~HC1 +2mmo1 BSA配制成 100ml 溶液；
BSA為牛血清白蛋白；
[0038]本發(fā)明中，如果沒有特殊說明，溶劑均為水。本發(fā)明未詳述的部分，均可采用現(xiàn)有技術。
[0039]本發(fā)明的有益效果在于:
[0040]1、本發(fā)明制備的提取液為溶菌酶、蛋白酶K、SDS，利于微生物細胞壁裂解。
[0041]2、本發(fā)明制備的提取液中含有BSA，可以促進PCR反應的穩(wěn)定性。
[0042]3、本發(fā)明制備的提取液配方組成，是實驗室普遍采用的常規(guī)試劑，經(jīng)濟性好。
[0043]4、本發(fā)明制備的提取液無毒、無刺激性氣味，操作安全。
[0044]5、本發(fā)明簡化了微生物總DNA提取步驟，實現(xiàn)了快速、高效的提取厭氧顆粒污泥的微生物總DNA。
[0045]6、本發(fā)明制備的提取液提取效果好，蛋白質(zhì)、酚類等雜質(zhì)殘留較少。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0046]圖1為實施例1的宏基因組DNA ；
[0047]圖2為實施例2的宏基因組DNA。
【具體實施方式】
[0048]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0049]實施例1
[0050]活性顆粒污泥樣品取自山東省禹城市福田藥業(yè)有限公司污水處理廠。
[0051]ImL菌體離心，8000r/min,5min, DNA常用忙存液I洗2遍。加入565mL|C存液I，混勻。加入0.1g溶菌酶，混勻，37°C溫育lh，加入501^貯存液11，混勻，371:溫育lh。加入100 μ L貯存液III，混勻，加入80 μ L貯存液IV，混勻，65°C溫育lOmin。取上清，加入SOOyL酚:氯仿:異戊醇混合液(酚:氯仿:異戊醇=25: 24: 1，體積比)，輕柔8字混勻，lOmin。離心12000r/min,4°C, lOmin。取上清,加入800 μ L氯仿:異戍醇混合液(氯仿:異戍醇=24:1,體積比),輕柔8字混勻，IOmin,離心12000r/min,4°C, lOmin。取上清,加入800 μ L異丙醇，輕柔混勻，-20°C，30min。室溫離心13000r/min，IOmin0 75%乙醇洗一遍，晾干。室溫離心12000r/min，5min。30 μ L貯存液V重懸，4°C過夜溶解。取I μ L宏基因組DNA，稀釋50倍，用紫外分光光度計進行質(zhì)量檢測。取5 μ L宏基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA條帶。
[0052]總DNA大小約21kb，0D260/0D280為1.89。其瓊脂糖電泳檢測結果顯示，DNA條帶較清晰明亮，見圖1。檢測結果表明DNA提取總量高、純度高。使用公知的檢測方法。
[0053]實施例2
[0054]活性顆粒污泥樣品取自山東省禹城市保齡寶股份有限公司污水處理廠。
[0055]ImL菌體離心,8000r/min, 5min,DNA常用忙存液I洗2遍。加入565mL忙存液I，混勻。加入0.1g溶菌酶，混勻，37°C溫育lh，加入501^貯存液11，混勻，371:溫育lh。加Λ IOOyL貯存液III，混勻，加入80 μ L貯存液IV，混勻，65°C溫育lOmin。加入800 μ L酚:氯仿:異戊醇混合液(酚:氯仿:異戊醇=25: 24: 1，體積比)，輕柔8字混勻，lOmin。離心UOOOr/mir^fC, lOmin。取上清,加入800 μ L氯仿:異戍醇混合液(氯仿:異戍醇=24:1,體積比),輕柔8字混勻，IOmin,離心12000r/min,4°C, lOmin。取上清,加入800 μ L異丙醇，輕柔混勻，一 2 0°C,30min。室溫離心13000r/min, lOmin。75%乙醇洗一遍，晾干。室溫離心12000r/min，5min。30 μ L貯存液V重懸，4°C過夜溶解。取I μ L宏基因組DNA，稀釋50倍，用紫外分光光度計進行質(zhì)量檢測。取5 μ L宏基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA條帶。
[0056]總DNA大小約21kb，0D260/0D280為1.85。其瓊脂糖電泳檢測結果顯示，DNA條帶
較清晰明亮，見圖2。檢測結果表明DNA提取總量高、純度高。
[0057]上述雖然對本發(fā)明的【具體實施方式】進行了描述，但并非對本發(fā)明保護范圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發(fā)明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍以內(nèi)。
【權利要求】
1.一種提取厭氧顆粒污泥微生物總DNA的方法，包括下列步驟: 1)菌體離心， 量取一定體積的菌體，放入離心機離心；棄去上層清夜,底層固體物用DNA貯存液I洗2遍；加入DNA貯存液I，混勻； 2)加入溶菌酶，混勻，30~40°C溫育0.5~2h，加入貯存液II，混勻，30~40°C溫育0.5 ~2h ; 3)加入貯存液III，混勻， 4)加入貯存液IV，混勻，60~70°C溫育5~15min； 5)加入酹、氯仿和異戍醇混合液,輕柔8字混勻5~15min;室溫靜置5~15min ;離心； 6)取上清,加入氯仿和異戍醇混合液,輕柔8字混勻5~15min;室溫靜置5~15min ；離心； 7)取上清，加入異丙醇，輕柔 混勻，-20°C，靜置30min;室溫離心； 8)75%乙醇洗一遍，晾干；室溫離心； 9)加入貯存液V重懸，4°C過夜溶解，即得厭氧顆粒污泥微生物總DNA。
2.如權利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總DNA的方法，其特征在于，步驟I)所述的菌體離心為，在7000~9000r/min速度離心3~8min。 步驟I)所述的固體物用DNA貯存液I洗2遍，DNA貯存液I每次使用量為菌體體積的5~10倍；步驟I)所述的加入DNA貯存液I，加入量為菌體體積的10~15倍。
3.如權利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總DNA的方法，其特征在于，步驟2)所述的溶菌酶的加入量為0.05~0.2g/ml菌體。
4.如權利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總DNA的方法，其特征在于，步驟2)所述的貯存液II的加入量為30~80 μ L/ml菌體。
5.如權利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總DNA的方法，其特征在于，步驟3)所述的貯存液III的加入量為70~120 μ L/ml菌體。
6.如權利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總DNA的方法，其特征在于，步驟4)所述的貯存液IV的加入量為60~100 μ L/ml菌體，65°C溫育lOmin。
7.如權利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總DNA的方法，其特征在于，步驟5)中,酚、氯仿和異戊醇混合液的加入量為700~900 μ L/ml菌體；酚:氯仿:異戊醇=22~28: 20~26: 1，體積比。 步驟6)中，氯仿和異戍醇混合液的加入量為700~900 μ L/ml菌體；氯仿:異戍醇=20~26: 1，體積比。
8.如權利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總DNA的方法，其特征在于，步驟5)和6)所述的離心為11000~13000r/min、2~8°C，離心5~15min。
9.如權利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總DNA的方法，其特征在于，步驟7)所述的異丙醇加入量為700~900 μ L、/ml菌體； 步驟7)和8)所述的室溫離心為12000~14000r/min,離心5~15min。
10.如權利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總DNA的方法，其特征在于，步驟9)中貯存液V的加入量為30 μ L/ml菌體。
【文檔編號】C12N15/10GK103710337SQ201310722060
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權日:2013年12月24日
【發(fā)明者】姬丹丹, 臧立華, 薛嶸, 李肖玲 申請人:齊魯工業(yè)大學