檢測雌激素受體β基因RsaI多態(tài)性的方法和引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于雌激素受體β基因RsaI多態(tài)性焦磷酸測序檢測的引物和方法，所述引物包括從樣本核酸中擴增雌激素受體β基因RsaI核酸片段的特異性引物和對獲得的核酸片段進行焦磷酸測序的引物，采用焦磷酸測序技術(shù)，通過本發(fā)明的特異性的擴增引物和焦磷酸測序引物，可檢測出與激素依賴性疾病相關(guān)的雌激素受體β基因RsaI多態(tài)性，特異性好，準確度高。可以用于臨床作為原因不明月經(jīng)過少及其他一些激素依賴性相關(guān)疾病的早期預(yù)防、早期診斷的輔助性指標及篩選。
【專利說明】檢測雌激素受體β基因Rsal多態(tài)性的方法和引物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種用于雌激素受體β基因Rsa I多態(tài)性焦磷酸檢測的引物序列，采用焦磷酸測序法技術(shù)，能對人類雌激素受體β基因多態(tài)性進行檢測，特異性好，準確度高。
【背景技術(shù)】
[0002]年輕女性月經(jīng)過少是一種常見的婦科癥狀。其危害是影響孕卵在子宮內(nèi)膜種植，導(dǎo)致反復(fù)流產(chǎn)、不孕等，是閉經(jīng)的前驅(qū)癥狀。雌激素是調(diào)節(jié)月經(jīng)的主要激素，但臨床上發(fā)現(xiàn)一類病人其雌激素水平正常， 無內(nèi)外科及先天性疾病，這種疾病被稱為原因不明月經(jīng)過少。同時，對大量原因不明月經(jīng)過少患者進行宮腔鏡檢查發(fā)現(xiàn)，月經(jīng)過少患者中有許多人的子宮內(nèi)膜光滑且薄，表現(xiàn)為生長發(fā)育不良。與傳統(tǒng)的子宮內(nèi)膜損傷、疤痕學(xué)說并不吻合，此外此類患者體內(nèi)雌激素水平正常。Nilsson等認為雌激素受體(estrogen receptor, ER)基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)可能導(dǎo)致基因在轉(zhuǎn)錄、翻譯水平失調(diào)，導(dǎo)致ER表達功能異常。研究發(fā)現(xiàn)雌激素受體(estrogen receptor, ER)有ERa和ER^兩種亞型。人雌激素受體β基因(estrogen receptor β，ER β )有第5外顯子的配體結(jié)合區(qū)Rsa I和第8外顯子3’非編碼區(qū)Alu I常見多態(tài)性位點。ERP基因的這種多態(tài)性可能會導(dǎo)致不同個體ERi3的表達水平或功能上的差異，進而影響體內(nèi)雌激素生物學(xué)作用的發(fā)揮，所以從ERi3基因多態(tài)性角度探討原因不明月經(jīng)過少的發(fā)病機制，為進一步深入研究提供理論依據(jù)。
[0003]在臨床實驗室中，目前檢測雌激素受體β基因Rsa I多態(tài)性的常用方法為限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RELP)法,利用限制性內(nèi)切酶能識別DNA分子的特異序列，并在特定序列處切開DNA分子，即產(chǎn)生限制性片段的特性，該方法的缺陷在于檢測靈敏度低且只能檢測大概型別，不能具體到突變比例。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種用于雌激素受體β基因Rsa I多態(tài)性焦磷酸測序檢測的引物，所述引物包括從樣本核酸中擴增雌激素受體β基因Rsa I核酸片段的特異性引物和對獲得的核酸片段進行焦磷酸測序的引物，其中從樣本核酸中擴增雌激素受體β基因Rsa I核酸片段的特異性引物序列為:
[0005]Rsa I F:5/ -TGGAAACTAAGTTGCGCAGCT-3' (SEQ ID N0.1)
[0006]Rsa I R:5/ -TGCCCTGCAAGTGTGAGATTT-3' (SEQ ID N0.2)
[0007]對獲得的核酸片段進行焦磷酸測序的引物序列為:
[0008]Rsa I S:5/ -AGCCTGTTCGACCAA-3' (SEQ ID N0.3)。
[0009]進一步的，所述的Rsa IR的5'端用生物素標記。
[0010]進一步地，焦磷酸測序采用正向測序。
[0011]本發(fā)明還提供一種檢測雌激素受體β基因Rsa I多態(tài)性的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0012](I)提取樣品中的核酸；
[0013](2)提取的核酸加入PCR擴增反應(yīng)液進行DNA擴增，PCR擴增的引物序列為:
[0014]Rsa I F:5/ -TGGAAACTAAGTTGCGCAGCT-3' (SEQ ID N0.1)
[0015]Rsa I R:5/ -TGCCCTGCAAGTGTGAGATTT-3' (SEQ ID N0.2)
[0016](3)取PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，檢測是否擴增成功；
[0017](4)對擴增成功的PCR產(chǎn)物進行焦磷酸測序 ，所述的測序引物為:
[0018]Rsa I S:5/ -AGCCTGTTCGACCAA-3' (SEQ ID N0.3)。
[0019]進一步地，所述PCR擴增反應(yīng)液包括5 XBuffer 12 μ 1，dNTP3y I, Taq酶3μ 1，上游引物3 μ 1，下游引物3 μ 1，純水24 μ I。
[0020]進一步地，PCR擴增的反應(yīng)條件是95°C 5分鐘，98°C 10秒；56°C 20秒；68°C 30秒，40個循環(huán)，68 °C 2分鐘。
[0021]本發(fā)明還提供一種檢測雌激素受體β基因Rsa I多態(tài)性的試劑盒，包括樣本DNA提取試劑、PCR擴增反應(yīng)液、單鏈核苷酸模板純化系統(tǒng)和焦磷酸測序體系，其中所述的PCR擴增的引物序列為:
[0022]Rsa I F:5/ -TGGAAACTAAGTTGCGCAGCT-3' (SEQ ID N0.1)
[0023]Rsa I R:5/ -TGCCCTGCAAGTGTGAGATTT-3' (SEQ ID N0.2)
[0024]所述的焦磷酸測序的引物序列為:
[0025]Rsa I S:5/ -AGCCTGTTCGACCAA-3' (SEQ ID N0.3)。
[0026]進一步地，所述的DNA提取試劑包括紅細胞裂解液和核酸提取液。
[0027]進一步地，所述的PCR擴增反應(yīng)液還包括5 X Buffer、dNTP、Taq酶和純水。
[0028]進一步地，所述的焦磷酸反應(yīng)體系還包括75%乙醇、Denaturation Solution、Binding Buffer、Annealing Buffer、IXWash Buffer、Streptavidin Sepharase HighPerformanceλ PyroMark Gold Q96Reagents 和 DMSO。
[0029]本發(fā)明將測序技術(shù)應(yīng)用于雌激素受體β基因多態(tài)性位點的檢測，設(shè)計出特異性擴增引物對包括ERi3基因多態(tài)性位點在內(nèi)的序列進行擴增，Rsa I擴增片段長度為438bp。并利用焦磷酸測序引物對PCR擴增產(chǎn)物進行焦磷酸測序分析，可檢測出與激素依賴性疾病相關(guān)的雌激素受體β基因Rsa I多態(tài)性，這不僅能檢測到多態(tài)性位點的具體突變情況，也能根據(jù)圖譜辨別出突變比例，使檢測結(jié)果更加具體化。本發(fā)明所述特異性好，準確度高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1是樣本I的測序圖。
[0031]圖2是樣本2的測序圖。
[0032]圖3是樣本3的測序圖。
【具體實施方式】
[0033]下面結(jié)合具體實施例和附圖，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當注意的是，實施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒炄藛T常規(guī)采用方法:譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學(xué)實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。[0034]實施例1檢測雌激素受體β基因Rsa I多態(tài)性的引物和試劑盒
[0035]從樣本核酸中擴增雌激素受體β基因Rsa I核酸片段的特異性引物序列為:
[0036]Rsa I F:5/ -TGGAAACTAAGTTGCGCAGCT-3' (SEQ ID N0.1)
[0037]Rsa I R:5/ -TGCCCTGCAAGTGTGAGATTT-3' (SEQ ID N0.2)
[0038]對獲得的核酸片段進行焦磷酸測序的引物序列為:
[0039]Rsa I S:5/ -AGCCTGTTCGACCAA-3' (SEQ ID N0.3)。
[0040]在一個優(yōu)選方案中， 其中Rsa IR的Y端用生物素標記引物。
[0041]檢測雌激素受體β基因Rsa I多態(tài)性的試劑盒，其包括樣本DNA提取試劑、PCR擴增反應(yīng)液、單鏈核苷酸模板純化系統(tǒng)和焦磷酸測序體系，所述PCR擴增反應(yīng)液包括用于擴增待檢雌激素受體β基因Rsa I區(qū)段的兩對擴增引物Rsa IF7Rsa IR，所述焦磷酸測序體系包括用于焦磷酸測序的測序引物Rsa IS，引物序列分別為:
[0042]Rsa I F:5/ -TGGAAACTAAGTTGCGCAGCT-3' (SEQ ID N0.1)
[0043]Rsa I R:5/ -TGCCCTGCAAGTGTGAGATTT-3' (SEQ ID N0.2)
[0044]Rsa I S:5/ -AGCCTGTTCGACCAA-3' (SEQ ID N0.3)。
[0045]所述的DNA提取試劑包括紅細胞裂解液和核酸提取液。
[0046]所述的PCR擴增反應(yīng)液還包括5 X Buffer、dNTP、Taq酶和純水。
[0047]所述的焦憐酸反應(yīng)體系還包括75%乙醇、Denaturation SolutioruBindingBuffer、Annealing Buffer、I X Wash Buffer、Streptavidin Sepharase HighPerformanceλ PyroMark Gold Q96Reagents (E\S\dNTP)和 DMSO。
[0048]實施例2檢測雌激素受體β基因Rsa I多態(tài)性的方法
[0049]通過本發(fā)明的特異性的擴增引物和焦磷酸測序引物，可檢測出與激素依賴性疾病相關(guān)的雌激素受體β基因Rsa I多態(tài)性，具體步驟如下:
[0050]1.1核酸提取
[0051]試劑:紅細胞裂解液，核酸提取液。
[0052]操作步驟:取500ul全血，放入到1.5ml的離心管中，加入Iml紅細胞裂解液。上下翻轉(zhuǎn)，使完全混勻，旋轉(zhuǎn)搖動15秒后放入離心機中離心，離心速率為5000rpm, IOmin.。倒掉上層液，可見離心管底部有血色沉淀。加入500ul紅細胞裂解液，重復(fù)此裂解步驟一次。離心5000rpm，5min，最后用移液管吸凈所有上層液棄去，以使離心管底部的血色沉淀不再殘留有裂解液，在沉淀里加入60ul核酸提取液(取之前反復(fù)吹打)，用槍頭混勻，金屬浴IOO0C 10 分鐘，12000rpm，5min，取上清 _20°C保存待用。
[0053]1.2PCR 擴增
[0054]PCR 擴增反應(yīng)液:5XBufferl2y l，dNTP3y l，Taq 酶 3μ 1，上游引物 3μ 1，下游引物3 μ I，純水24 μ I，加2 μ I DNA提取物。到48 μ I擴增體系中，總體積為50 μ I。反應(yīng)條件為95°C 5分鐘，98°C 10秒；56°C 20秒；68°C 30秒，40個循環(huán)，68°C 2分鐘。所述的上下游引物為:
[0055]Rsa I F:5/ -TGGAAACTAAGTTGCGCAGCT-3' (SEQ ID N0.1)
[0056]Rsa I R:5/ -TGCCCTGCAAGTGTGAGATTT-3' (SEQ ID N0.2)。
[0057]1.3 電泳
[0058]取PCR擴增產(chǎn)物3 μ I進行瓊脂糖電泳，檢測是否擴增成功。若擴增成功，則選擇目的條帶清晰較亮的進行后續(xù)焦磷酸測序反應(yīng)。
[0059]1.4焦磷酸測序
[0060]試劑:75%乙醇，Denaturation Solution, Binding Buffer (Qiagen 公司)，Annealing Buffer,I Xffash Buffer, Streptavidin Sepharase High Performance (GEHealthcare Life Sciences 公司)，PyroMark Gold Q96Reagents (E\S\dNTP), DMSO。
[0061]步驟:按照PyroMark Q96 (美國QIAGEN公司)操作說明書進行操作。
[0062]所述的測序引物為:
[0063]Rsa I S:5/ -AGCCTGTTCGACCAA-3' (SEQ ID N0.3)。
[0064]1.5實驗結(jié)果分析
[0065]檢測過程中，四種dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)依序被加入反應(yīng)體系中。在每一輪測序反應(yīng)中，只加入其中一種。如被加入的dNTP與DNA模板配對，DNA聚合酶可以催化該dNTP與引物的3'端形成共價鍵，dNTP的焦磷酸基團(PPi)就被釋放出來。加入的dNTP和釋放出來的PPi的摩爾數(shù)目是相等的。接著，ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)催化APS和PPi形成ATP，此ATP和PPi的摩爾數(shù)目也是一致的。利用ATP作為能源，熒光素酶(Iuciferase)可將突光素氧化為氧化突光素(oxyluciferin),進而發(fā)出與ATP量成正比的可見光信號。光信號由CCD攝像機檢測，并由pyrogramTM轉(zhuǎn)為波形訊號。每個波峰的高度(光信號)與反應(yīng)中加入的核苷酸數(shù)目成正比。
[0066]實施例3臨床樣本的檢測
[0067]利用本發(fā)明所述的引物、試劑盒和方法測定3份臨床樣本的多態(tài)性，結(jié)果如圖1至3所示。經(jīng)測序圖譜分析，樣本I為A/A型，樣本I的β第5外顯子的配體結(jié)合區(qū)Rsa I酶切位點的序列為GTAC。樣本2為A/G型，樣本2的β第5外顯子的配體結(jié)合區(qū)Rsa I酶切位點的序列即有正常的GTAC，又有突變的GTGC。樣本3為G/G型，樣本3的β第5外顯子的配體結(jié)合區(qū)Rsa I酶切位點的序列突變?yōu)镚TGC。這與利用限制性片段長度多態(tài)性方法測定結(jié)果一致。說明本發(fā)明測定結(jié)果準確，且本發(fā)明能夠根據(jù)圖譜辨別出突變比例，更優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)中利用限制性片段長度多態(tài)性方法測定雌激素受體β基因Rsa I多態(tài)性的技術(shù)。
【權(quán)利要求】
1.用于雌激素受體β基因RsaI多態(tài)性焦磷酸測序檢測的引物，所述引物包括從樣本核酸中擴增雌激素受體β基因Rsa I核酸片段的特異性引物和對獲得的核酸片段進行焦磷酸測序的引物，其特征在于， 從樣本核酸中擴增雌激素受體β基因Rsa I核酸片段的特異性引物序列為:
Rsa I F:5’-TGGAAACTAAGTTGCGCAGCT-3’ (SEQ ID N0.1)
Rsa I R:5’-TGCCCTGCAAGTGTGAGATTT-3’ (SEQ ID N0.2) 對獲得的核酸片段進行焦磷酸測序的引物序列為:
Rsa I S:5' - AGCCTGTTCGACCAA-3’ (SEQ ID N0.3)。
2.如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，所述的RsaI R端用生物素標記。
3.如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，所述的焦磷酸測序采用正向測序。
4.一種檢測雌激素受體β基因Rsa I多態(tài)性的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)提取樣品中的核酸； (2)提取的核酸加入PCR擴 增反應(yīng)液進行核酸擴增，PCR擴增的引物序列為:
Rsa I F:5’-TGGAAACTAAGTTGCGCAGCT-3’ (SEQ ID N0.1)
Rsa I R:5’-TGCCCTGCAAGTGTGAGATTT-3’ (SEQ ID N0.2) (3)取PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，檢測是否擴增成功； (4)對擴增成功的PCR產(chǎn)物進行焦磷酸測序，所述的測序引物為:
Rsa I S:5' - AGCCTGTTCGACCAA-3’ (SEQ ID N0.3)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增反應(yīng)液包括5XBuffer12 μ I, dNTP 3μ I, Taq酶3μ 1，上游引物3μ 1，下游引物3μ 1，純水24μ I。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，PCR擴增的反應(yīng)條件是95°C5分鐘，98°C 10秒；56°C 20秒；68°C 30秒，40個循環(huán)，68 °C 2分鐘。
【文檔編號】C12N15/11GK103740819SQ201310721806
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】葛蟬, 孫翠蓮, 王淑一 申請人:濟南艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司