一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆mon89788的實(shí)時(shí)熒光pcr方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆MON89788的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，包括：制樣與DNA提取、實(shí)時(shí)熒光PCR和結(jié)果判定等步驟，本發(fā)明建立的轉(zhuǎn)基因大豆MON89788實(shí)時(shí)熒光PCR方法，提高了檢測(cè)的靈敏度與特異性，檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.1%，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，能夠很好地適用于進(jìn)出口和國(guó)內(nèi)的轉(zhuǎn)基因大豆MON89788及其制品的監(jiān)測(cè)需求。同時(shí)，本發(fā)明中使用的陽(yáng)性對(duì)照品是根據(jù)大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin與轉(zhuǎn)基因大豆MON89788品系特異性序列設(shè)計(jì)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子，相對(duì)于傳統(tǒng)的植物原材料標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，具有純度高、易獲得、經(jīng)濟(jì)高效等優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788的實(shí)時(shí)熒光PCR方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788的實(shí)時(shí)熒光PCR方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大豆是我國(guó)乃至全世界重要的經(jīng)濟(jì)與糧食作物，是食用油和植物蛋白最豐富、最廉價(jià)的來(lái)源。為了提高大豆的產(chǎn)量，滿足人們對(duì)大豆的需求量，科研人員采用基因工程與分子輔助育種方法，培育了一些高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和抗逆以及適合農(nóng)場(chǎng)機(jī)械化種植的轉(zhuǎn)基因大豆品種。國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(ISAAA)的年度報(bào)告顯示，2012年，全球約81%的大豆產(chǎn)量為轉(zhuǎn)基因大豆。上世紀(jì)末中國(guó)就已開(kāi)始耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆的進(jìn)口，轉(zhuǎn)基因大豆及其相關(guān)的加工產(chǎn)品越來(lái)越多地進(jìn)入到食品與飼料鏈中。轉(zhuǎn)基因作物在解決全世界日益嚴(yán)重的糧食危機(jī)的同時(shí)，也帶來(lái)了食品安全和環(huán)境安全方面的諸多爭(zhēng)議，世界各國(guó)都在逐步加強(qiáng)對(duì)重要目標(biāo)食品中轉(zhuǎn)基因大豆品系的監(jiān)測(cè)與標(biāo)識(shí)工作。
[0003]監(jiān)測(cè)與標(biāo)識(shí)工作的實(shí)施依賴于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)包括蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)和核酸檢測(cè)技術(shù)，其中實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，以其高特異性、高靈敏性和可定量等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越多的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)中。轉(zhuǎn)基因生物的PCR檢測(cè)主要是對(duì)轉(zhuǎn)基因植物外源插入片段的選擇性擴(kuò)增。根據(jù)擴(kuò)增的目標(biāo)核酸的位置的不同，PCR檢測(cè)策略可以分為四種，即篩選PCR檢測(cè)、基因特異性PCR檢測(cè)、構(gòu)建特異性PCR檢測(cè)和品系特異性PCR檢測(cè)。與前三種方法相比，品 系特異性PCR檢測(cè)是通過(guò)檢測(cè)外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)DNA序列，具有非常高的特異性和準(zhǔn)確性。品系特異性PCR檢測(cè)已經(jīng)成為目前轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法研究的重點(diǎn)，并逐步地為國(guó)際檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)際各檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室所采用。
[0004]不論采用基于核酸或蛋白質(zhì)的方法，在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)時(shí)均必須使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為陽(yáng)性對(duì)照或制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。目前，轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品檢測(cè)所需的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要來(lái)源于植物原材料，但是這類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備、貯存和測(cè)定過(guò)程受很多因素影響，很難維持恒定的量，很難保證測(cè)量的穩(wěn)定性，而且并非所有的轉(zhuǎn)基因品系都存在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，給轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)帶來(lái)很大困難，同時(shí)也制約了轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。相比之下，標(biāo)準(zhǔn)分子在很多方面具有優(yōu)勢(shì)，標(biāo)準(zhǔn)分子是一種含有外源目的基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因特異性片段的重組質(zhì)粒分子，具有易獲得，純度高，經(jīng)濟(jì)高效等優(yōu)點(diǎn)，近幾年，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子已逐漸成為一種可替代植物基因組DNA的一種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的研制具有廣闊的發(fā)展前景。
[0005]轉(zhuǎn)基因大豆M0N8978品系是美國(guó)孟山都公司研發(fā)抗草甘膦大豆品種，已先后在美國(guó)、加拿大、日本和哥斯達(dá)黎加四國(guó)商業(yè)化種植，并在菲律賓、澳大利亞、新西蘭、墨西哥等11個(gè)國(guó)家和地區(qū)批準(zhǔn)用于食品和飼料加工原料。我國(guó)雖然不種植轉(zhuǎn)基因大豆，但是每年進(jìn)口幾千萬(wàn)噸轉(zhuǎn)基因大豆用于食品或飼料加工原料，轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788已于2011年批準(zhǔn)進(jìn)口我國(guó)用作加工原料。為加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788的安全監(jiān)管，滿足轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)的需要，有必要開(kāi)發(fā)適用于轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的方法。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]發(fā)明目的:針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，使其檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.1%，并且可以同時(shí)進(jìn)行大批量樣品分析，能夠很好地適用于進(jìn)出口和國(guó)內(nèi)的轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788及其制品的監(jiān)測(cè)需求。
[0007]技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，包括以下步驟:
O制樣與DNA提取
取大豆或其加工產(chǎn)品的樣品，粉碎，用常規(guī)核酸提取方法提取DNA，確保DNA純度應(yīng)符合PCR檢測(cè)要求；
2)實(shí)時(shí)熒光PCR
反應(yīng)體系為 25μ L:2-5μ L 的 DNA 模板(100~200ng)，12.5μ L LightCycler 480Probes Master (商品化TaqMan實(shí)時(shí)突光定量PCR預(yù)混液(2X )中的一種),0.75 μ L引物M0N89788-FC10 μ mol/L),0.75 μ L 引物 M0N89788_R( 10 μ mol/L)，0.5 μ L 探針 Μ0Ν89788-Ρ(10 μ mol/L)，去離子水補(bǔ)齊體積；反應(yīng)條件為:預(yù)變性95°C IOmin ;變性95°C 15s，退火延伸60°C lmin，45個(gè)循環(huán)；同時(shí)設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照與空白對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PMD19T-M0N89788,陰性對(duì)照 為非轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA，空白對(duì)照為無(wú)菌水；
其中，引物與探針序?yàn)?引物 M0N89788-F:5，-CGCTTCAATCGTGGTTATCA-3 ’，引物M0N89788-R:5’ -CGAGCAGGACCTGCAGAAG-3’ ；探針 M0N89788-P:FAM-CTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGA-BHQ I ;質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD19T-M0N89788為克隆有SEQ ID N0.3所示序列的質(zhì)粒；
3)結(jié)果判定
質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn):空白對(duì)照無(wú)熒光增幅現(xiàn)象；陰性目標(biāo)DNA對(duì)照無(wú)熒光增幅現(xiàn)象；陽(yáng)性目標(biāo)DNA對(duì)照檢測(cè)Ct值小于或等于34 ;如有一項(xiàng)不符合者，重復(fù)步驟I)和2)。
[0008]結(jié)果判斷:待測(cè)樣品Ct值大于或等于40，設(shè)置的對(duì)照結(jié)果正常者，則判定該樣品未檢出轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788 ;待測(cè)樣品Ct值小于或等于36，設(shè)置的對(duì)照結(jié)果正常者，則判定該樣品檢出轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788 ;待測(cè)樣品Ct值在36~40之間，重復(fù)步驟2)，再次擴(kuò)增后的結(jié)果Ct值仍小于40，且設(shè)置的對(duì)照結(jié)果正常，則可判定該樣品檢出轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788 ;再次擴(kuò)增后結(jié)果Ct值大于40，且設(shè)置的對(duì)照結(jié)果正常，判定該樣品未檢出轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788。
[0009]所述的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD19T-M0N89788構(gòu)建過(guò)程如下:
I)根據(jù)SEQ ID N0.1所示的轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788的品系特異性序列和SEQ ID N0.2所示的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin特異性序列，基于PAS的方法，設(shè)計(jì)并合成出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的PCR引物，共計(jì)14條，具體如下:
引物 Al:5’ -CCTCCTCGGGAAAGTTACAACTCAA-3’ ；
引物 A2:5，-CGAGGGTTTTGGGGTGCCGTTTTCGTCAACCTTATTGAGTTGTAACTTTCCCGA-3，；
引物 A3:5，-AACGGCACCCCAAAACCCTCGTCTCTTGGTCGCGCCCTCTACTCCACCCCCATC-3，；
引物 A4:5’ -GGCAACGCTACCGGTTTCTTTGTCCCAAATGTGGATGGGGGTGGAGTAGAGGGC-3’ ；
引物 A5:5，-AAAGAAACCGGTAGCGTTGCCAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCACCTTCTAT-3，；引物 A6:5’ -AAGCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTGTCAGGGGCATAGAAGGTGAAGTTGAAGGA-3’ ；
引物 A7:5，-AAAAGGCTTGCAGATGGGCTTGCCTTCTTTCTCGCACCAATTGACACTAAGCCA-3，；
引物 A8:5，-GTTGAAAAGACCAAGATAACCTGCATGTGTTTGTGGCTTAGTGTCAATTGGTGC-3，；
引物 A9:5，-GGTTATCTTGGTCTTTTCAACGAAAACGAGTCTGGTGATCAAGTCGTCGCTGTT-3，；
引物 AlO:5，-CCACGATTGAAGCGCTAGAGCGGGATCAAACTCAACAGCGACGACTTGATCACC-3，；
引物 All:5，-GCTCTAGCGCTTCAATCGTGGTTATCAAGCTCCAAACACTGATAGTTTAAACTG-3，；
引物 A12:5，-CTTGATGGGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAGTGTTT-3，；
引物 A13:5，-GACAATCTGATCCCCATCAAGCTCTAGCTAGAGCGGCCGCGTTATCAAGCTTCT-3，；
引物 A14:5’ -TCGAGCAGGACCTGCAGAAGCTTGATAACGCGGCCG-3’。
[0010]2)將合成的14條引物分別稀釋至IOpmol/μ L,引物Α2~Α13各取10 μ L，混合均勻后再稀釋10倍作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為:3^1^引物41，3111^引物八14，25 μ L SapphireAmp Fast PCR Master Mix(2X ), 12 μ L模板,ddH20補(bǔ)足體積至50 μ L ;PCR擴(kuò)增條件:95°C,lmin ;94°C，30s，50°C，35s，72°C，40s，30 個(gè)循環(huán)；72°C,8min ;得到大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin片段和轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788的品系特異性片段連接在一起的重組DNA序列，長(zhǎng)437bp序列，序列如SEQ ID N0.3所示；
3)回收酶切后的重組DNA序列及質(zhì)粒載體pMD19-T，使用T4DNA連接酶16°C過(guò)夜反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，篩選陽(yáng)性克??；連接反應(yīng)體系為:
0.5μ L 卩顯19-1'載體，3.5 4 1^重組0嫩序列，14 1^ Τ4 DNA Ligase, I μ L 10ΧΤ4 DNA LigaseReaction Buffer, ddH20 補(bǔ)足體積至 10 μ L ;
4)按照AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD19T_M0N89788，測(cè)序驗(yàn)證；構(gòu)建出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PMD19T-M0N89788，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子置_20°C保存?zhèn)溆谩?br> `[0011]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明建立的轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788實(shí)時(shí)熒光PCR方法，提高了檢測(cè)的靈敏度與特異性，檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.1%，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，能夠很好地適用于進(jìn)出口和國(guó)內(nèi)的轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788及其制品的監(jiān)測(cè)需求。同時(shí)，本發(fā)明中使用的陽(yáng)性對(duì)照品是根據(jù)大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因與轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788品系特異性序列設(shè)計(jì)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子，相對(duì)于傳統(tǒng)的植物原材料標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，具有純度高、易獲得、經(jīng)濟(jì)高效等優(yōu)點(diǎn)。具有很好的實(shí)用性，能夠產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效應(yīng)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1是質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD19T-M0N89788構(gòu)建中PAS方法的原理；
圖2是構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD19T-M0N89788的示意圖譜；
圖3是轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法特異性分析中轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788品系特異性序列擴(kuò)增曲線圖，圖中，1:質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD19T_M0N89788 ；2:轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788 ；3:轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12 ；4:轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127 ；5:轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2 ；6:轉(zhuǎn)基因玉米M0N810 ；7:轉(zhuǎn)基因玉米T25 ；8:轉(zhuǎn)基因玉米BT176 ；9:轉(zhuǎn)基因玉米BTll ；10:轉(zhuǎn)基因大米Bt63 ；11:轉(zhuǎn)基因大米KF6 ；12:轉(zhuǎn)基因油菜GT73 ；13:轉(zhuǎn)基因油菜MS8 ；14:非轉(zhuǎn)基因大豆；15:空白對(duì)照；
圖4是轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法靈敏度分析中轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788品系特異性序列擴(kuò)增曲線圖，圖中，1:質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD19T_M0N89788 ；2~4的轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788含量分別是1%、0.5%、0.1% ；5:空白對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明:本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件操作，例如Sambrook等編著的分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述的條件，或按制造廠商所建議的條件。
[0014]以下實(shí)施例所使用的主要材料、試劑與儀器具體如下:
轉(zhuǎn)基因大豆 M0N89788、A2704-12、A5547-127、GTS40-3-2、轉(zhuǎn)基因玉米 M0N810、T25、BT176、BT11、轉(zhuǎn)基因大米Bt63、KF6轉(zhuǎn)基因油菜GT73、MS8、非轉(zhuǎn)基因大豆以及相關(guān)檢測(cè)樣品由江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心提供。
[0015]pMD19_T 載體、DL10000 DNA Marker>SapphireAmp Fast PCR Master Mix (2X)、T4 DNA連接酶及緩沖液購(gòu)自寶生物(大連)有限公司；DH5a感受態(tài)菌株、X_gal、氨芐青霉素(Amp)、IPTG、LB培養(yǎng)基購(gòu)自北京天根生物技術(shù)有限公司；TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR預(yù)混液LightCycler 480 Probes Master (2X )購(gòu)自南京萊普泰生物科技有限公司；質(zhì)粒DNA提取采用Axygen公司的AxyPr印質(zhì)粒DNA小量試劑盒(產(chǎn)品序號(hào):AP-MN-P_50);植物組DNA提取采用北京天根生物技術(shù)有限公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒(目錄號(hào):DP320-02);PCR引物與探針由上海輝睿生物技術(shù)有限公司合成；質(zhì)粒測(cè)序由南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司完成；其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。[0016]EPS-100電泳儀(上海天能科技有限公司)；基因擴(kuò)增儀(9902型，AppliedBiosystems公司);AQE-183_2全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(Syngene公司);Vorwerk攪拌器(德國(guó)Vorwerk公司)；GFL雜交爐(德國(guó)GFL公司)；J_E冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；MB_102恒溫震蕩金屬浴(日本Bioer公司)；NanoDrop 1000微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司);LightCyCler 480 II實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀(瑞士 Roche公司);其他儀器包括:培養(yǎng)箱、天平等。
[0017]實(shí)施例1:陽(yáng)性對(duì)照品的構(gòu)建
1、查閱國(guó)內(nèi)外轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788的品系特異性序列(SEQ ID N0.1)和大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin特異性序列(SEQ ID N0.2)。
[0018]2、構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的PCR引物序列設(shè)計(jì)
根據(jù)犾得的轉(zhuǎn)基因大? Μ0Ν8978的品系特異性序列彳目息和大?內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin特異性序列信息，基于PAS (PCR-based Accurate Synthesis)的方法(基因合成原理如圖1),設(shè)計(jì)并合成14條全長(zhǎng)拼接引物，引物序列如下:
引物 Al:5’ -CCTCCTCGGGAAAGTTACAACTCAA-3’ ；
引物 A2:5，-CGAGGGTTTTGGGGTGCCGTTTTCGTCAACCTTATTGAGTTGTAACTTTCCCGA-3，；
引物 A3:5，-AACGGCACCCCAAAACCCTCGTCTCTTGGTCGCGCCCTCTACTCCACCCCCATC-3，；
引物 A4:5’ -GGCAACGCTACCGGTTTCTTTGTCCCAAATGTGGATGGGGGTGGAGTAGAGGGC-3’ ；
引物 A5:5，-AAAGAAACCGGTAGCGTTGCCAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCACCTTCTAT-3，；引物 A6:5’ -AAGCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTGTCAGGGGCATAGAAGGTGAAGTTGAAGGA-3’ ；
引物 A7:5，-AAAAGGCTTGCAGATGGGCTTGCCTTCTTTCTCGCACCAATTGACACTAAGCCA-3，；
引物 A8:5，-GTTGAAAAGACCAAGATAACCTGCATGTGTTTGTGGCTTAGTGTCAATTGGTGC-3，；
引物 A9:5，-GGTTATCTTGGTCTTTTCAACGAAAACGAGTCTGGTGATCAAGTCGTCGCTGTT-3，；
引物 AlO:5，-CCACGATTGAAGCGCTAGAGCGGGATCAAACTCAACAGCGACGACTTGATCACC-3，；
引物 All:5，-GCTCTAGCGCTTCAATCGTGGTTATCAAGCTCCAAACACTGATAGTTTAAACTG-3，；
引物 A12:5，-CTTGATGGGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAGTGTTT-3，；
引物 A13:5，-GACAATCTGATCCCCATCAAGCTCTAGCTAGAGCGGCCGCGTTATCAAGCTTCT-3，；
引物 A14:5’ -TCGAGCAGGACCTGCAGAAGCTTGATAACGCGGCCG-3’。
[0019]3、轉(zhuǎn)基因大? M0N89788品系特異性序列和大?內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的擴(kuò)增
講合成的14條引物分別稀釋至IOpmol/μ L，引物Α2~Α13各取10 μ L，混合均勻后再稀釋10倍作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為:3μΙ^_Α1，3μΙ^_Α14，25μ?SapphireAmp Fast PCR Master Mix(2X ), 12 μ L 模板，ddH20 補(bǔ)足體積至 50 μ L。PCR 擴(kuò)增條件:95°C,lmin ;94°C，30s，50°C，35s，72°C，40s，30 個(gè)循環(huán)；72°C，8min。得到大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin片段和轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788的品系特異性片段連接在一起的重組DNA序列，長(zhǎng)437bp序列，序列如SEQ ID N0.3所示。
[0020]4、將PCR產(chǎn)物克隆至質(zhì)粒載體pMD19-T上
使用T4 DNA連接酶連接重組DNA序列及質(zhì)粒載體pMD19-T，16°C過(guò)夜反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，篩選陽(yáng)性克隆。連接反應(yīng)體系為:0.5μ L pMD19_T載體，3.5 μ L重組 DNA序列，IyL Τ4 DNA Ligase, I μ L 10ΧΤ4 DNA Ligase Reaction Buffer,ddH20補(bǔ)足體積至10 μ L,
5、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子DNA提取
按照AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD19T_M0N89788，送去測(cè)序驗(yàn)證。紫外分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果表明，提取的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子DNA的OD26tZOD28tl接近
1.8，符合PCR檢測(cè)的要求，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子置-20°C保存?zhèn)溆?。本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PMD19T-M0N89788的簡(jiǎn)要圖譜如圖2所示。
[0021]實(shí)施例2:轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的建立
1、制樣與DNA提取
稱取約200g大豆及其加工產(chǎn)品樣品，在經(jīng)已去除交叉污染的合適粉碎裝置中，將樣品均質(zhì)為粉末顆粒大小約0.5mm。使用相關(guān)核酸提取方法提取f 2g樣品DNA，DNA純度應(yīng)符合PCR檢測(cè)要求。
[0022]2、轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的引物與探針的設(shè)計(jì)
根據(jù)獲得轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788品系特異性序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)出特異性引物和探針。具體的引物與探針序如下:引物M0N89788-F:5’ -CGCTTCAATCGTGGTTATCA-3’，引物 M0N89788-R:5’ -CGAGCAGGACCTGCAGAAG-3’ ；探針M0N89788-P:5’ -FAM-CTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGA-BHQ1-3’。
[0023]3、轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的建立
反應(yīng)體系為254 1^，包括2-54 1^的0嫩模板(100~2001^)，12.5“1^ LightCycler 480Probes MasterC 2 X )，0.75 μ L正向引物(引物濃度10 μ mol/L)、0.75 μ L反向引物(引物濃度10μπιΟ1/υ，0.5yL探針(探針濃度lOymol/L)，去離子水補(bǔ)齊體積。反應(yīng)條件為:預(yù)變性95°C IOmin ;變性95°C 15s，退火延伸60°C lmin，45個(gè)循環(huán)。
[0024]同時(shí)設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照與空白對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PMD19T-M0N89788，陰性對(duì)照為非轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA，空白對(duì)照為無(wú)菌水。
[0025]4、轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的結(jié)果判定
(I)結(jié)果分析條件設(shè)定
閾值設(shè)置原則以基線剛好超過(guò)正常陰性目標(biāo)DNA對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，或可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。
[0026](2)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
空白對(duì)照:無(wú)熒光增幅現(xiàn)象。
[0027]陰性目標(biāo)DNA對(duì)照:無(wú)熒光增幅現(xiàn)象。
[0028]陽(yáng)性目標(biāo)DNA對(duì)照:檢測(cè)Ct值小于或等于34。
[0029]上述指標(biāo)有一項(xiàng)不符合者，應(yīng)重做實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。
[0030](3)結(jié)果判斷
PCR檢測(cè)時(shí)應(yīng)做平行實(shí)驗(yàn)，兩份平行測(cè)試樣品的結(jié)果應(yīng)保持一致。如果一個(gè)測(cè)試樣品的結(jié)果為陽(yáng)性而另一個(gè)為陰性時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行檢測(cè)。
[0031]待測(cè)樣品Ct值大于或等于40，設(shè)置的對(duì)照結(jié)果正常者，則可判定該樣品未檢出轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788 ；
待測(cè)樣品Ct值小于或等于36，設(shè)置的對(duì)照結(jié)果正常者，則可判定該樣品檢出轉(zhuǎn)基因大豆 M0N89788 ；
待測(cè)樣品Ct值在36~40之間，應(yīng)重做實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。再次擴(kuò)增后的結(jié)果Ct值仍小于40，且設(shè)置的對(duì)照結(jié)果正常，則可判定該樣品檢出轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788 ;再次擴(kuò)增后結(jié)果Ct值大于40，且設(shè)置的對(duì)照結(jié)果正常，可判定該樣品未檢出轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788。
[0032]應(yīng)用上述建立的轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，對(duì)江蘇進(jìn)口的70多批申報(bào)為含有轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788的貨物進(jìn)行了檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，符合申報(bào)內(nèi)容。同時(shí)對(duì)出口或進(jìn)行質(zhì)控的30個(gè)以上大豆及其加工品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均為陰性。此外參加了中美大豆聯(lián)合查驗(yàn)工作中的轉(zhuǎn)基因大豆品系項(xiàng)目的檢測(cè)，相同的比對(duì)檢測(cè)樣品轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。
[0033]實(shí)施例3:轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)
使用TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788、A2704-12、A5547-127、GTS40-3-2、轉(zhuǎn)基因玉米 M0N810、T25、BT176、BT11、轉(zhuǎn)基因大米 Bt63、KF6 轉(zhuǎn)基因油菜GT73、MS8等基因組DNA，使用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788品系特異性序列，每個(gè)樣品做雙平行，同時(shí)設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照與空白對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD19T-M0N89788，陰性對(duì)照為非轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA，空白對(duì)照為無(wú)菌水。
[0034]結(jié)果如圖3所示，只有轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788基因組DNA與陽(yáng)性對(duì)照成功擴(kuò)增出轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788品系特異性序列，其他11種DNA樣本及陰性對(duì)照、空白對(duì)照在45個(gè)循環(huán)內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線?？梢?jiàn)，針對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788品系特異性序列的引物與探針特異性良好。
[0035]實(shí)施例4:轉(zhuǎn)基 因大豆M0N89788實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法靈敏度試驗(yàn)將研磨好的純合M0N89788品系大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆干粉按照質(zhì)量百分比進(jìn)行混合，配制3個(gè)不同轉(zhuǎn)基因含量樣品，包括1%、0.5%和0.1%，使用TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒提取各組DNA，樣品DNA稀釋至50ng/ μ L，加入2 μ L DNA模板，使用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因大豆Μ0Ν89788品系特異性序列，每個(gè)樣品3次重復(fù)，同時(shí)設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PMD19T-M0N89788，陰性對(duì)照為無(wú)菌水。
[0036] 結(jié)果如圖4所示，當(dāng)熒光定量PCR體系中轉(zhuǎn)基因大豆Μ0Ν89788含量為1%、0.5%和0.1% (100大豆基因組DNA)時(shí)，存在明顯的擴(kuò)增曲線，所得Ct值分別為31.94±0.15、33.90±0.08、35.84±0.51，Ct值均小于36。結(jié)果表明當(dāng)轉(zhuǎn)基因含量為0.1%時(shí)擴(kuò)增良好，即建立的轉(zhuǎn)基因大豆Μ0Ν89788實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法靈敏度可達(dá)0.1%，能滿足實(shí)際檢測(cè)需要。
【權(quán)利要求】
1.一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，其特征在于，包括以下步驟: O制樣與DNA提取 取大豆或其加工產(chǎn)品的樣品，粉碎，用常規(guī)核酸提取方法提取DNA，確保DNA純度應(yīng)符合PCR檢測(cè)要求； 2)實(shí)時(shí)熒光PCR
反應(yīng)體系為 25 μ L:2_5 μ L 的 DNA 模板，12.5 μ L LightCycler 480 Probes Master,0.75 μ L 引物 M0N89788-F、0.75 μ L 引物 M0N89788-R，0.5 μ L 探針 Μ0Ν89788-Ρ，去離子水補(bǔ)齊體積；反應(yīng)條件為:預(yù)變性95°C IOmin ;變性95°C 15s，退火延伸60°C lmin，45個(gè)循環(huán)；同時(shí)設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照與空白對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PMD19T-M0N89788，陰性對(duì)照為非轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA，空白對(duì)照為無(wú)菌水； 其中，引物與探針序?yàn)?引物 M0N89788-F:5，-CGCTTCAATCGTGGTTATCA-3 ’，引物M0N89788-R:5’ -CGAGCAGGACCTGCAGAAG-3’ ；探針 M0N89788-P:FAM-CTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGA-BHQI ;質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD19T-M0N89788為克隆有SEQ ID N0.3所示序列的質(zhì)粒； 3)結(jié)果判定 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn):空白對(duì)照無(wú)熒光增幅現(xiàn)象；陰性目標(biāo)DNA對(duì)照無(wú)熒光增幅現(xiàn)象；陽(yáng)性目標(biāo)DNA對(duì)照檢測(cè)Ct值小于或等于34 ;如有一項(xiàng)不符合者，重復(fù)步驟I)和2)； 結(jié)果判斷:待測(cè)樣品Ct值大于或等于40，設(shè)置的對(duì)照結(jié)果正常者，則判定該樣品未檢出轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788 ;待測(cè)樣品Ct值小于或等于36，設(shè)置的對(duì)照結(jié)果正常者，則判定該樣品檢出轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788 ;待測(cè)樣品Ct值在36~40之間，重復(fù)步驟2)，再次擴(kuò)增后的結(jié)果Ct值仍小于40，且設(shè)置的對(duì)照結(jié)果正常，則可判定該樣品檢出轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788 ；再次擴(kuò)增后結(jié)果Ct值大于40，且設(shè)置的對(duì)照結(jié)果正常，判定該樣品未檢出轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，其特征在于，所述的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PMD19T-M0N89788構(gòu)建過(guò)程如下:
I)根據(jù)SEQ ID N0.1所示的轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788的品系特異性序列和SEQ ID N0.2所示的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin特異性序列，基于PAS的方法，設(shè)計(jì)并合成出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的PCR引物，共計(jì)14條，具體如下:
引物 Al:5’ -CCTCCTCGGGAAAGTTACAACTCAA-3’ ；
引物 A2:5，-CGAGGGTTTTGGGGTGCCGTTTTCGTCAACCTTATTGAGTTGTAACTTTCCCGA-3，；
引物 A3:5，-AACGGCACCCCAAAACCCTCGTCTCTTGGTCGCGCCCTCTACTCCACCCCCATC-3，；
引物 A4:5’ -GGCAACGCTACCGGTTTCTTTGTCCCAAATGTGGATGGGGGTGGAGTAGAGGGC-3’ ；
引物 A5:5，-AAAGAAACCGGTAGCGTTGCCAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCACCTTCTAT-3，；
引物 A6:5’ -AAGCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTGTCAGGGGCATAGAAGGTGAAGTTGAAGGA-3’ ；
引物 A7:5，-AAAAGGCTTGCAGATGGGCTTGCCTTCTTTCTCGCACCAATTGACACTAAGCCA-3，；
引物 A8:5，-GTTGAAAAGACCAAGATAACCTGCATGTGTTTGTGGCTTAGTGTCAATTGGTGC-3，；
引物 A9:5，-GGTTATCTTGGTCTTTTCAACGAAAACGAGTCTGGTGATCAAGTCGTCGCTGTT-3，；
引物 AlO:5，-CCACGATTGAAGCGCTAGAGCGGGATCAAACTCAACAGCGACGACTTGATCACC-3，；
引物 All:5，-GCTCTAGCGCTTCAATCGTGGTTATCAAGCTCCAAACACTGATAGTTTAAACTG-3，；引物 A12:5，-CTTGATGGGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAGTGTTT-3，；
引物 A13:5，-GACAATCTGATCCCCATCAAGCTCTAGCTAGAGCGGCCGCGTTATCAAGCTTCT-3，；
引物 A14:5’ -TCGAGCAGGACCTGCAGAAGCTTGATAACGCGGCCG-3’ ； 2)將合成的14條引物分別稀釋至10?11101/^1^，引物42113各取10μ L，混合均勻后再稀釋10倍作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為:3yL引物Al，3yL引物A14，25yLSapphireAmp Fast PCR Master Mix (2X ), 12 μ L 模板，ddH20 補(bǔ)足體積至 50 μ L ;PCR 擴(kuò)增條件:95°C,lmin ;94°C，30s，50°C，35s，72°C，40s，30 個(gè)循環(huán)；72°C,8min ;得到大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin片段和轉(zhuǎn)基因大豆MON89788的品系特異性片段連接在一起的重組DNA序列，長(zhǎng)437bp序列，序列如SEQ ID N0.3所示； 3)回收酶切后的重組DNA序列及質(zhì)粒載體pMD19-T，使用T4DNA連接酶16°C過(guò)夜反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，篩選陽(yáng)性克??；連接反應(yīng)體系為:.0.5μ L PMD19-T載體，3.5μ L重組DNA序列，I μ L Τ4 DNA Ligase, I μ L 10ΧΤ4 DNA LigaseReaction Buffer, ddH20 補(bǔ)足體積至 10 μ L ； 4)按照AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD19T_M0N89788，測(cè)序驗(yàn)證；構(gòu)建出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PMD19T-M`0N89788，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子置_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103725777SQ201310693528
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】黃明, 劉欣, 祝長(zhǎng)青, 黃繼超, 周興虎 申請(qǐng)人:南京佳邦食品有限公司