富含dha及dpa的油脂及其制備和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種富含多不飽和脂肪酸油脂及其制備和應(yīng)用，特別是指富含DHA及DPA的油脂及其制備和應(yīng)用。在一個(gè)含有發(fā)酵培養(yǎng)基的通氣發(fā)酵罐中，在機(jī)械攪拌的方式下培養(yǎng)裂壺藻；培養(yǎng)結(jié)束后收集藻體細(xì)胞；從藻體細(xì)胞中提取回收富含多不飽和脂肪酸的油脂；連續(xù)培養(yǎng)過程包括連續(xù)流加培養(yǎng)基質(zhì)、細(xì)胞的截留返回、發(fā)酵液的放流等工藝步驟。富含DHA及DPA的油脂可以用于制備普通食品添加劑、特殊膳食食品添加劑及藥品。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的細(xì)胞活性低、生產(chǎn)周期長等問題，具有細(xì)胞活性高、生長周期短、不飽和脂肪酸產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】富含DHA及DPA的油脂及其制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種富含多不飽和脂肪酸油脂及其制備和應(yīng)用，特別是指富含DHA及DPA的油脂及其制備和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]多不飽和脂肪酸是人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)，攝取不足會(huì)造成身體機(jī)能不適。它們可保持細(xì)胞膜的相對(duì)流動(dòng)性，保持細(xì)胞的正常生理功能，也可以降低甘油三酯，改善微循環(huán)，促進(jìn)腦和神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育，增強(qiáng)記憶和思維能力。長鏈多不飽和脂肪酸中最重要的有DHA (二十二碳六烯酸)和DPA (二十二碳五烯酸)。
[0003]DHA是人腦的主要組成物質(zhì)之一，約占大腦灰質(zhì)磷脂的24.3%_36.6%。DHA可促進(jìn)腦細(xì)胞的分裂、增殖、突起的生長和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成，有利于智力、學(xué)習(xí)和記憶能力的提高。
[0004]DHA具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能，體內(nèi)DHA的含量與嬰幼兒成長過程中的反應(yīng)靈敏程度、早產(chǎn)兒出生后的生長呈正相關(guān)。如果出生后，早產(chǎn)兒的膳食中不能提供足夠的DHA，就會(huì)對(duì)早產(chǎn)兒的生長發(fā)育帶來極為不利的影響。DHA在人的視網(wǎng)膜中含量豐富，是神經(jīng)和視覺發(fā)育的一種必要營養(yǎng)素，它可以提高嬰幼兒視覺的敏銳度。嬰幼兒膳食中若缺乏DHA，視網(wǎng)膜的DHA含量減少，對(duì)光的視覺敏感性會(huì)受到影響，視力會(huì)降低。
[0005]DHA可以降血壓，調(diào)節(jié)人體內(nèi)血脂和脂蛋白的正常代謝，降低血液粘稠度和血液中膽固醇水平，預(yù)防心血管疾病。DHA還是一種中樞神經(jīng)保護(hù)素的前體，能夠促進(jìn)人腦的綜合代謝活力同時(shí)減緩神經(jīng)退化性疾病的進(jìn)程，對(duì)老年人有防止老年癡呆癥的作用。近些年來有研究也發(fā)現(xiàn)了二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid,簡(jiǎn)稱DPA)對(duì)膽固醇的吸收和代謝方面的的生理功效，指出DPA可以降低血清總膽固醇和非高密度脂蛋白膽固醇，同時(shí)DPA和DHA對(duì)于大動(dòng)脈的功能也有一定的改善作用。
[0006]有關(guān)這些長鏈多不飽和脂肪酸的生理功能及其實(shí)際應(yīng)用的研究已有較多報(bào)道。傳統(tǒng)的長鏈多不飽和脂肪酸多是從深海魚油中提取的，但是由于從魚油中提取的PUFA含有強(qiáng)烈的魚腥味，而且魚油中脂肪酸成份復(fù)雜，DHA的分離提取過程不僅步驟多而且損失大，所以現(xiàn)在有很多專利是用來申請(qǐng)PUFA分離及純化方法的。而且近期也有研究調(diào)查指出，魚油中所含有的持續(xù)性有機(jī)污 染物(POPs)及其危害多年來一直被人們所忽視。持續(xù)性有機(jī)污染物(POPs)是指在海洋中需要幾十年或更長時(shí)間才能降解消失的污染物，如人們所熟悉的滴滴涕(DDT)、其它化學(xué)殺蟲劑、多氯聯(lián)苯類物質(zhì)(PCBs)、二惡英(Dioxin)和六氯苯(HCB)等等，這些物質(zhì)對(duì)人體的健康有極大的危害，可以干擾人體內(nèi)分泌系統(tǒng)、損害神經(jīng)系統(tǒng)、影響成年人的生育能力以及誘發(fā)和促進(jìn)癌細(xì)胞生長發(fā)育。此外魚油還含有如汞等重金屬化合物，對(duì)孕婦、哺乳期婦女和兒童有很大的傷害。目前多不飽和脂肪酸，特別是DHA的另一個(gè)來源是海洋微藻油。從海洋生物的食物鏈來看，藻類是魚類的最基本食物，研究表明魚體內(nèi)的多不飽和脂肪酸來源于藻類。
[0007]因此利用藻類工業(yè)化高效生產(chǎn)DHA具有重要的技術(shù)和市場(chǎng)需求。
[0008]微藻細(xì)胞可以采用以下培養(yǎng)方式:分批式培養(yǎng)、流加分批式培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。分批式培養(yǎng)是將底物基質(zhì)一次性投加到發(fā)酵罐中，將預(yù)先培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵罐中，在適宜的條件下培養(yǎng)，反應(yīng)完成后將全部反應(yīng)物料取出的操作方式。目前，發(fā)酵制品的生產(chǎn)中多采用這種方式。流加分批操作是指先將一定量的發(fā)酵底物基質(zhì)投加到發(fā)酵罐中，接種微生物并在適宜的條件下培養(yǎng)一段時(shí)間，之后開始按一定要求流加特定的底物基質(zhì)，當(dāng)反應(yīng)終止時(shí)取出全部的反應(yīng)物料的操作方式。連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)是指底物基質(zhì)不斷流加入發(fā)酵罐內(nèi)，同時(shí)又把反應(yīng)物料連續(xù)不斷的取出，發(fā)酵罐內(nèi)的反應(yīng)液體積保持恒定，反應(yīng)條件不隨時(shí)間變化的操作方式。分批式發(fā)酵因其設(shè)備制作費(fèi)用低，設(shè)備的通用性高，是發(fā)酵工業(yè)中使用廣泛的方法之一，但是反應(yīng)器的非生產(chǎn)周期長，每批發(fā)酵結(jié)束后都需進(jìn)行洗罐和滅菌，由于頻繁的高溫高壓滅菌，易使檢測(cè)裝置損傷及設(shè)備的腐蝕等損害，而且，種子逐級(jí)放大培養(yǎng)過程中任何一級(jí)發(fā)酵罐染菌均會(huì)造成經(jīng)濟(jì)損失和生產(chǎn)周期的延遲。分批發(fā)酵過程中隨培養(yǎng)的進(jìn)行，底物濃度下降，細(xì)胞濃度增加，產(chǎn)物濃度增加，細(xì)胞活性逐步降低。流加分批式發(fā)酵可以控制反應(yīng)器中底物基質(zhì)的濃度，確保細(xì)胞生長所需的條件，產(chǎn)率可提高。但分批式流加受罐體積所限，持續(xù)的時(shí)間短，仍然不能克服非生產(chǎn)周期長的問題。相比之下，連續(xù)發(fā)酵更容易實(shí)現(xiàn)機(jī)械化和自動(dòng)化節(jié)約勞動(dòng)力，減少人工操作帶來的污染，只在發(fā)酵之初對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行一次滅菌后便可長期運(yùn)行，避免頻繁滅菌對(duì)設(shè)備的損害，也省去了頻繁的種子培養(yǎng)過程。因?yàn)榈孜锘|(zhì)的不斷添加和反應(yīng)液的不斷排出，可控制發(fā)酵罐內(nèi)代謝產(chǎn)物的濃度，避免底物限制和代謝產(chǎn)物抑制作用，保持了細(xì)胞的活性和生長速率。 [0009]在本專利申請(qǐng)之前，尚未有利用連續(xù)培養(yǎng)方式進(jìn)行藻類多不飽和脂肪酸生產(chǎn)的中國專利，現(xiàn)有的專利均是利用分批或流加分批培養(yǎng)，如CN101979623A和ZL01806451.5。通過分批補(bǔ)充某種物質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生脂質(zhì)。但在這個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)中，誘導(dǎo)脂質(zhì)產(chǎn)生的營養(yǎng)限制條件使得培養(yǎng)過程缺少了細(xì)胞生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，影響了細(xì)胞濃度，造成產(chǎn)量的下降，因?yàn)榧?xì)胞在生長過程中，必需有足夠的營養(yǎng)物質(zhì)或溶解氧的供給才能維持細(xì)胞量的增長，而不是限定在某種水平或降低。同時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)過程中通過新陳代謝作用產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物，而這些物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的生長有負(fù)作用，可導(dǎo)致細(xì)胞生長速度下降，因此在現(xiàn)有的專利中，所要求的培養(yǎng)技術(shù)沒有消除培養(yǎng)系統(tǒng)中后期代謝所產(chǎn)生的毒副產(chǎn)物的積累問題，毒副產(chǎn)物一直保留在培養(yǎng)系統(tǒng)中，從而不能達(dá)到細(xì)胞的高效連續(xù)培養(yǎng)。
[0010]微藻油脂生產(chǎn)的目標(biāo)物為胞內(nèi)產(chǎn)物，而非胞外分泌物，發(fā)酵培養(yǎng)的主要目的是收獲高油脂含量的細(xì)胞，所以提高發(fā)酵液中的細(xì)胞生物量是優(yōu)化發(fā)酵條件的主要考慮因素之一。裂壺藻(Schizochytrium)在無性繁殖過程中，每個(gè)營養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過分裂釋放2_8個(gè)游動(dòng)孢子，這些孢子成熟后又經(jīng)過細(xì)胞分裂使細(xì)胞數(shù)目成倍增加。因此，最終細(xì)胞量的生產(chǎn)和脂肪酸的積累是和細(xì)胞的生長及活性相關(guān)。微生物發(fā)酵過程的連續(xù)培養(yǎng)通常都是在連續(xù)流入培養(yǎng)基的同時(shí)流出反應(yīng)液，以維持罐內(nèi)一定的反應(yīng)液體積、細(xì)胞濃度和營養(yǎng)物質(zhì)濃度，所以隨著反應(yīng)液不斷排出的同時(shí)也造成細(xì)胞的流失，短期內(nèi)罐內(nèi)可收集的細(xì)胞濃度是較低的。
[0011]發(fā)明目的
[0012]本發(fā)明的目的在于提供一種富含DHA及DPA的油脂及其制備和應(yīng)用，通過連續(xù)流加基質(zhì)和排出反應(yīng)液有利于解除發(fā)酵底物限制和產(chǎn)物抑制導(dǎo)致的細(xì)胞活性降低，避免細(xì)胞生長進(jìn)入停滯期和衰老期，有利于維持發(fā)酵罐內(nèi)細(xì)胞的活性和脂肪酸的積累；并將該富含DHA及DPA的油脂用于制備普通食品添加劑、特殊膳食食品添加劑、功能食品以及藥品。[0013]本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是:
[0014]富含DHA及DPA的油脂，該油脂中不飽和脂肪酸DHA和DPA分別占總脂肪酸質(zhì)量百分比的25-55%以及5-20%。
[0015]富含DHA及DPA的油脂的制備方法，在一個(gè)含有發(fā)酵培養(yǎng)基的通氣發(fā)酵罐中，在機(jī)械攪拌的方式下培養(yǎng)裂壺藻；培養(yǎng)結(jié)束后從發(fā)酵罐中收集藻體細(xì)胞；從所述的藻體細(xì)胞中提取回收所述的富含多不飽和脂肪酸的油脂；所述的培養(yǎng)為連續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)過程包括如下工藝步驟:
[0016]A、連續(xù)流加培養(yǎng)基質(zhì):培養(yǎng)基質(zhì)泵入發(fā)酵罐，發(fā)酵液由出料泵經(jīng)出料口泵出罐外；
[0017]B、細(xì)胞的截留返回:步驟A中的發(fā)酵液進(jìn)入封閉無菌的固液分離裝置進(jìn)行細(xì)胞與發(fā)酵培養(yǎng)基分離，分離后的細(xì)胞濃縮液泵回發(fā)酵罐；
[0018]C、發(fā)酵液的放流:當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)的細(xì)胞達(dá)到額定濃度時(shí)，將發(fā)酵罐內(nèi)的部分培養(yǎng)基排出。
[0019]富含DHA及DPA的油脂在制備普通食品添加劑、特殊膳食食品添加劑、藥品中的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明的具體技術(shù)構(gòu)思還有: [0021]步驟A是發(fā)酵過程中當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源濃度為5-20克/升時(shí)，開始將培養(yǎng)基質(zhì)泵入發(fā)酵罐并維持罐內(nèi)5-20克/升的碳源濃度。
[0022]所述的步驟A培養(yǎng)基質(zhì)中碳源的添加比例高于其他營養(yǎng)物質(zhì)，其他營養(yǎng)物質(zhì)選自氮源，維生素，磷酸鹽，微量元素及其混合物。
[0023]步驟B中細(xì)胞與發(fā)酵培養(yǎng)基的分離采用固液分離裝置。
[0024]步驟B中細(xì)胞濃縮液由發(fā)酵罐底部灌流回發(fā)酵罐內(nèi)。
[0025]優(yōu)選的實(shí)施方式是，所述的培養(yǎng)過程的溫度為20°C -35°C。
[0026]所述的連續(xù)培養(yǎng)過程發(fā)酵培養(yǎng)基的溶解氧含量為5%_60%飽和度。
[0027]所述的裂壺藻優(yōu)選裂壺藻CGMCCN0.7693。
[0028]本發(fā)明中所米用的裂壺藻(Schizochytrium sp.)CGMCCN0.7693已于2013年6月9日提交中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)保藏，該保藏單位的地址位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。
[0029]可以顯而易見的是，為縮短發(fā)酵周期、降低發(fā)酵成本，常見的技術(shù)實(shí)現(xiàn)方式是，所述的培養(yǎng)是將裂壺藻原始藻種經(jīng)活化、擴(kuò)大培養(yǎng)后制成種子液，將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0030]所述裂壺藻的活化傳代培養(yǎng)基采用如下組分組成:
[0031]葡萄糖10-30g/L，胰蛋白胨2-8g/L，酵母提取物l_5g/L，氯化鈉15_25g/L，硫酸鎂 l_5g/L，磷酸二氫鉀 0.5-5g/L,氯化鉀 0.Ι-lg/L,氯化鈣 0.01-0.6g/L,硫酸銨 0.5_3g/L,碳酸氫鈉0.01-0.05g/L,乙二胺四乙酸二鈉鹽10-60mg/L,硼酸10-34.2mg/L,氯化錳0.01-lmg/L，三氯化鐵 0.5-3mg/L，氰鈷胺素 5_50mg/L，氯化鋅 0.Ι-lmg/L，氯化 3_[ (4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基)-甲基]-5- (2-羥基乙基)-4-甲基噻唑0.5-10mg/L，氯化鈷0.01-0.lmg/L，硫酸銅 0.01-0.15mg/L，余量為水，瓊脂 10g/L, pH=6_7。
[0032]所述的裂壺藻的擴(kuò)培、發(fā)酵培養(yǎng)基、流加培養(yǎng)基質(zhì)采用如下組分組成:[0033]葡萄糖40_60g/L，酵母提取物5_20g/L，氯化鈉10_20g/L，硫酸鎂l_5g/L，磷酸二氫鉀0.5-5g/L,氯化鉀0.Ι-lg/L,氯化鈣0.01-0.6g/L,硫酸銨0.5_3g/L，碳酸氫鈉0.01-0.05g/L,氯化錳0.01-lmg/L,三氯化鐵0.5_3mg/L，氰鈷胺素5_50mg/L，氯化鋅0.1-lmg/L，氯化3-[ (4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基)-甲基]-5- (2-羥基乙基)-4-甲基噻唑 0.5-10mg/L,氯化鈷 0.01-0.lmg/L，硫酸銅 0.01-0.15mg/L，硼酸 10-34.2mg/L，乙二胺四乙酸二鈉鹽20-60mg/L，余量為水，pH=6-7?？梢燥@而易見的是，在發(fā)酵過程中按需添加適量消泡劑，以維持發(fā)酵過程的正常進(jìn)行。
[0034]本發(fā)明總脂的測(cè)定采用傳統(tǒng)的溶劑浸提法，根據(jù)經(jīng)典的Bligh-Dyer脂肪酸提取及酯化方法，稱取一定量的凍干細(xì)胞，與甲醇:氯仿:水=1:2:0.8的混合液一起攪拌30分鐘，離心后收集上清液，反復(fù)清洗數(shù)次后合并上清液，用氮?dú)獯蹈扇軇┑玫皆寮?xì)胞的脂，稱重，測(cè)得總脂含量。取適量油脂按一定比例加入KOH-甲醇溶液及一定量17烷酸的內(nèi)標(biāo)物與三氟化硼-乙醚，由此進(jìn)行甲酯化，從而得到多不飽和脂肪酸甲酯，進(jìn)行氣相色譜測(cè)定。 [0035]本發(fā)明所具備的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和取得的顯著技術(shù)進(jìn)步在于:
[0036]本發(fā)明在反應(yīng)液流出端口增加細(xì)胞捕獲反流裝置富集細(xì)胞，再將細(xì)胞濃縮液返回發(fā)酵罐。利用沉降-逆灌流偶聯(lián)的細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)方式，通過連續(xù)流加基質(zhì)和排出反應(yīng)液的方式，有利于解除發(fā)酵底物限制和產(chǎn)物抑制導(dǎo)致的細(xì)胞活性降低的問題，避免細(xì)胞生長進(jìn)入停滯期和衰老期，有利于維持發(fā)酵罐內(nèi)細(xì)胞的活性和脂肪酸的積累。進(jìn)而通過細(xì)胞本身的生長特性自然誘導(dǎo)脂質(zhì)產(chǎn)生，從而達(dá)到較高的多不飽和脂肪酸生產(chǎn)量。細(xì)胞截留返回避免了細(xì)胞流失，維持了發(fā)酵罐內(nèi)高細(xì)胞濃度，同時(shí)補(bǔ)充基質(zhì)，節(jié)省了發(fā)酵罐接種后的延遲期，縮短了生產(chǎn)周期。這一方法可維持發(fā)酵罐中較高的細(xì)胞濃度，高效生產(chǎn)所需的產(chǎn)物。
[0037]在現(xiàn)有技術(shù)中DHA及DPA已被文獻(xiàn)報(bào)道可應(yīng)用于制備食品添加劑、功能食品、保健品甚至預(yù)防心腦血管等藥品的制備，本發(fā)明中所述的富含DHA及DPA的油脂經(jīng)檢測(cè)符合相關(guān)的產(chǎn)品要求，且已有相關(guān)的產(chǎn)品出售，因此， 申請(qǐng)人:不再對(duì)其用于制備食品添加劑、功能食品、保健品甚至藥品的制備方法進(jìn)行贅述。
[0038]本發(fā)明中所米用的裂壺藻(Schizochytrium sp.)CGMCCN0.7693已于2013年6月9日提交中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)保藏。
【具體實(shí)施方式】
[0039]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求記載的內(nèi)容為準(zhǔn)，任何依據(jù)說明書做出的等效技術(shù)手段替換，均不脫離本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明中的固液分離裝置采用了簡(jiǎn)易的細(xì)胞沉降槽和中空纖維過濾膜，但不限于這兩種裝置，對(duì)于采用更先進(jìn)的沉降型固液分離裝置和膜過濾型固液分離裝置也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0040]實(shí)施例1
[0041]微藻藻種的保藏培養(yǎng):本實(shí)施例中的藻種選用裂壺藻(Schizochytriumsp.)CGMCCN0.7693。其在固體培養(yǎng)基上可以正常生長，所以藻種傳代活化采用半天然化學(xué)合成培養(yǎng)基進(jìn)行。所述的裂壺藻活化傳代培養(yǎng)基采用如下組分組成:
[0042]葡萄糖10g/L,胰蛋白胨2g/L,酵母提取物lg/L,氯化鈉15g/L,硫酸鎂lg/L,磷酸二氫鉀0.5g/L，氯化鉀0.lg/L，氯化鈣0.01g/L，硫酸銨0.5g/L，碳酸氫鈉0.01g/L,乙二胺四乙酸二鈉鹽10mg/L,硼酸10mg/L,氯化猛0.01mg/L,三氯化鐵0.5mg/L,氰鈷胺素5mg/L,氯化鋅0.lmg/L，氯化3-[ (4-氨基-2-甲基_5_嘧啶基)-甲基]_5_ (2-羥基乙基)_4_甲基噻唑0.5mg/L,氯化鈷0.01mg/L,硫酸銅0.01mg/L,瓊脂10g/L,余量為水，pH=6_7。
[0043]培養(yǎng)基配好后，121°C蒸汽滅菌20分鐘。轉(zhuǎn)接后的藻種于20-30°C培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)4天后，觀察菌落形態(tài)和顯微鏡鏡檢，以確保藻種無雜菌污染。
[0044]所述的裂壺藻的擴(kuò)培、發(fā)酵培養(yǎng)基、流加培養(yǎng)基質(zhì)采用如下組分組成:
[0045]葡萄糖40g/L,酵母提取物5g/L,氯化鈉10g/L,硫酸鎂lg/L,磷酸二氫鉀0.5g/L,氯化鉀0.lg/L,氯化鈣0.01g/L,硫酸銨0.5g/L，碳酸氫鈉0.01g/L,氯化錳0.01mg/L,三氯化鐵0.5mg/L,氰鈷胺素5mg/L，氯化鋅0.lmg/L,氯化3_[ (4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基)-甲基]-5_ (2-羥基乙基)-4_甲基噻唑0.5mg/L,氯化鈷0.01mg/L,硫酸銅0.01mg/L,硼酸10mg/L，乙二胺四乙酸二鈉鹽20mg/L，余量為水，pH=6_7。
[0046]將平板活化的藻種接種于裝有50ml活化傳代培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在溫度為30°C、轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘條件下?lián)u瓶培養(yǎng)36小時(shí)，以質(zhì)量百分含量為10%的接種量轉(zhuǎn)接入裝有100ml擴(kuò)培培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)過連續(xù)兩次的傳代擴(kuò)培后，接種到30°C的2L發(fā)酵罐中，pH控制在6-7之間，培養(yǎng)過程中酸堿度的控制由向發(fā)酵罐添加0.5M的氫氧化鈉溶液或0.5M的鹽酸溶液完成，通氣量為1.5L/min,攪拌轉(zhuǎn)速為350轉(zhuǎn)/分鐘。在發(fā)酵過程中按需添加適量消泡劑，以維持發(fā)酵過程的正常進(jìn)行。當(dāng)葡萄糖濃度降為10g/L時(shí)，開始進(jìn)行連續(xù)流加和細(xì)胞沉降逆灌流耦合。初始流加速度為0.3ml/min,調(diào)節(jié)通氣量和攪拌速度，控制溶氧量為10%。隨發(fā)酵進(jìn)行，發(fā)酵罐內(nèi)細(xì)胞濃度和耗糖速度增加，發(fā)酵過程中控制進(jìn)料泵的流速，維持罐內(nèi)葡萄糖濃度在10g/L左右。發(fā)酵罐泵出反應(yīng)液的出口處連接容積為1.5L的細(xì)胞沉降槽，所述微藻的沉降速率為2-3cm/min，沉降細(xì)胞回流速度為30ml/min，廢液以與料液相同的流加速度排出罐外，以避免發(fā)酵液的溢出。發(fā)酵罐內(nèi)細(xì)胞干重濃度達(dá)到39.56g/L時(shí)，放流三分之一體積的發(fā)酵液，并收集細(xì)胞。放流后，發(fā)酵罐以0.5ml/min的速度繼續(xù)流加培養(yǎng)基直到恢復(fù)原體積，并控制進(jìn)料泵的流速，維持罐內(nèi)葡萄糖濃度在10g/L。如此反復(fù)三次放流。三次放流收集藻細(xì)胞，富含DHA及DPA的油脂采用常規(guī)方法從藻細(xì)胞中提取，分別進(jìn)行分析測(cè)試。DHA的產(chǎn)量為9.47±0.97g/L, DPA的產(chǎn)量為3.11±0.77g/L。細(xì)胞內(nèi)主要脂肪酸的組成如下表所示。
[0047]
【權(quán)利要求】
1.富含DHA及DPA的油脂，其特征在于該油脂中不飽和脂肪酸DHA和DPA分別占總脂肪酸質(zhì)量百分比的25-55%以及5-20%。
2.富含DHA及DPA的油脂的制備方法，在一個(gè)含有發(fā)酵培養(yǎng)基的通氣發(fā)酵罐中，在機(jī)械攪拌的方式下培養(yǎng)裂壺藻；培養(yǎng)結(jié)束后從發(fā)酵罐中收集藻體細(xì)胞；從所述的藻體細(xì)胞中提取回收所述的富含多不飽和脂肪酸的油脂；其特征在于所述的培養(yǎng)為連續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)過程包括如下工藝步驟: A、連續(xù)流加培養(yǎng)基質(zhì):培養(yǎng)基質(zhì)泵入發(fā)酵罐，發(fā)酵液由出料泵經(jīng)出料口泵出罐外； B、細(xì)胞的截留返回:步驟A中的發(fā)酵液進(jìn)入封閉無菌的固液分離裝置進(jìn)行細(xì)胞與發(fā)酵培養(yǎng)基分離，分離后的細(xì)胞濃縮液泵回發(fā)酵罐； C、發(fā)酵液的放流:當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)的細(xì)胞達(dá)到額定濃度時(shí)，將發(fā)酵罐內(nèi)的部分培養(yǎng)基排出。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的富含DHA及DPA的油脂的制備方法，其特征在于所述的步驟A是發(fā)酵過程中當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源濃度為5-20克/升時(shí)，開始將培養(yǎng)基質(zhì)泵入發(fā)酵罐并維持罐內(nèi)5-20克/升的碳源濃度。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的富含DHA及DPA的油脂的制備方法，其特征在于所述的步驟A培養(yǎng)基質(zhì)中碳源的添加比例高于其他營養(yǎng)物質(zhì)，其他營養(yǎng)物質(zhì)選自氮源，維生素，磷酸鹽，微量元素及其混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的富含DHA及DPA的油脂的制備方法，其特征在于所述的步驟B中細(xì)胞與發(fā)酵培養(yǎng)基的分離采用固液分離裝置。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的富含DHA及DPA的油脂的制備方法，其特征在于所述的步驟B中細(xì)胞濃縮液由發(fā)酵罐底部灌流回發(fā)酵罐內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的富含DHA及DPA的油脂的制備方法，其特征在于所述的培養(yǎng)過程的溫度為20°C -35°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的富含DHA及DPA的油脂的制備方法，其特征在于所述的連續(xù)培養(yǎng)過程發(fā)酵培養(yǎng)基的溶解氧含量為5%-60%飽和度。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的富含DHA及DPA的油脂的制備方法，其特征在于所述的裂壺藻選用裂壺藻CGMCCN0.7693。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或9所述的富含DHA及DPA的油脂的制備方法，其特征在于所述的培養(yǎng)是將裂壺藻原始藻種經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后制成種子液，將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或9所述的富含DHA及DPA的油脂的制備方法，其特征在于所述的裂壺藻活化傳代培養(yǎng)基采用如下組分組成: 葡萄糖10_30g/L，胰蛋白胨2-8g/L，酵母提取物l_5g/L，氯化鈉15_25g/L，硫酸鎂l-5g/L,磷酸二氫鉀 0.5-5g/L,氯化鉀 0.Ι-lg/L,氯化鈣 0.01-0.6g/L,硫酸銨 0.5_3g/L,碳酸氫鈉0.01-0.05g/L,乙二胺四乙酸二鈉鹽10-60mg/L,硼酸10-34.2mg/L,氯化錳0.01-lmg/L，三氯化鐵 0.5-3mg/L，氰鈷胺素 5_50mg/L，氯化鋅 0.Ι-lmg/L，氯化 3_[ (4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基)-甲基]-5- (2-羥基乙基)-4-甲基噻唑0.5-10mg/L，氯化鈷0.01-0.lmg/L，硫酸銅 0.01-0.15mg/L，余量為水，瓊脂 10g/L, pH=6_7。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的富含DHA及DPA的油脂的制備方法，其特征在于所述的裂壺藻的擴(kuò)培、發(fā)酵培養(yǎng)基、流加培養(yǎng)基質(zhì)采用如下組分組成:葡萄糖40-60g/L，酵母提取物5-20g/L，氯化鈉10_20g/L，硫酸鎂l_5g/L，磷酸二氫鉀0.5-5g/L,氯化鉀0.Ι-lg/L,氯化鈣0.01-0.6g/L,硫酸銨0.5_3g/L，碳酸氫鈉.0.01-0.05g/L,氯化錳 0.01-lmg/L,三氯化鐵 0.5_3mg/L，氰鈷胺素 5_50mg/L，氯化鋅.0.1-lmg/L，氯化3-[ (4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基)-甲基]-5- (2-羥基乙基)-4-甲基噻唑 0.5-10mg/L,氯化鈷 0.01-0.lmg/L，硫酸銅 0.01-0.15mg/L，硼酸 10-34.2mg/L，乙二胺四乙酸二鈉鹽20-60mg/L，余量為水，pH=6-7。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的富含DHA及DPA的油脂在制備普通食品添加劑中的應(yīng)用。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的富含DHA及DPA的油脂在制備特殊膳食食品添加劑中的應(yīng)用。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的富含DHA及DPA的油脂在制備藥品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A23L1/30GK103642860SQ201310683597
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月13日
【發(fā)明者】姜悅, 陳璇, 柳澤深 申請(qǐng)人:潤科生物工程（福建）有限公司