鑒定魯氏接合酵母菌的實時熒光pcr試劑盒及寡核苷酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒定魯氏結合酵母菌的實時熒光PCR試劑盒及寡核苷酸。具體地，本發(fā)明提供了一組鑒定魯氏結合酵母菌的寡核苷酸，為序列表SEQ?ID?No：1至SEQ?ID?No：3所示的寡核苷酸，其中序列SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2分別為鑒定魯氏結合酵母菌的上游引物和下游引物，序列SEQ?ID?NO：3為鑒定魯氏結合酵母菌的熒光探針。本發(fā)明還提供了含有上述引物和探針的實時熒光PCR試劑盒及食品中魯氏結合酵母菌的實時熒光PCR鑒定方法，本發(fā)明對于魯氏結合酵母的鑒定靈敏度為10-4ng/μL以內。
【專利說明】鑒定魯氏接合酵母菌的實時熒光PCR試劑盒及寡核苷酸
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于涉及一種鑒定魯氏接合酵母菌的實時熒光PCR試劑盒及寡核苷酸，屬于檢驗檢疫領域。
【背景技術】
[0002]魯氏接合酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii)是最常見的嗜高滲透壓酵母菌。既是主要傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產菌，又是某些低水分活度食品及原料的腐敗菌。魯氏接合酵母菌是生產醬油、日本味噌和泰國發(fā)酵魚制品等發(fā)酵制品的重要菌種。在果汁、果醬、軟飲料、沙拉醬和調味番茄醬等中則是腐敗菌。
[0003]魯氏接合酵母菌傳統(tǒng)的檢測方法是基于形態(tài)特征、染色特征、生化特征等表型特征來鑒定。這些常規(guī)的方法在副溶血性弧菌研究工作中起到了重要作用，但現代科學技術的發(fā)展，傳統(tǒng)的依靠表型特征來鑒定魯氏結合酵母菌的方法，已遠遠不能滿足對該菌的快速鑒定的需要，暴露出許多不足之處:操作繁瑣，鑒定周期長，不利于口岸快速通關的要求；而且隨著分子生物學的日益發(fā)展，人們漸漸發(fā)現魯氏接合酵母菌的生理生化特性會發(fā)生變化，而傳統(tǒng)的鑒定方法無法很好地表現其遺傳特性。因此，迫切急需研究出能夠更加快速、準確無誤、檢測通量更高、人為影響因素盡可能減少，而且能獲得目標菌基因類型等多重信息的鑒定方法。
[0004]用于魯氏接合酵母菌分子鑒定 的方法在國內還很少見報道，實時熒光PCR技術充分結合了 PCR擴增和探針雜交的優(yōu)勢，具有高靈敏度、高特異性，重復性和穩(wěn)定性良好的優(yōu)點，一次上機即可完成結果檢測，容易自動化。
[0005]實時熒光PCR技術根據熒光能量傳遞原理，融合了 PCR技術的高效擴增、探針技術的高特異性、光譜技術的高敏感性和高精確性等優(yōu)點。它是利用熒光信號伴隨著PCR產物的增加而增強的原理，在PCR擴增過程中，連續(xù)不斷地檢測反應體系中熒光光信號的變化。根據熒光信號基線的平均值和平均標準差，在99.7%的置信度時計算出大于平均值的熒光信號即閾值，然后收集熒光信號增強到預定閾值時的PCR循環(huán)次數(即Ct值)。該參數和PCR反應體系中起始DNA模板量的對數值之間有嚴格的線性關系。利用陽性梯度稀釋標準品的Ct值繪制成標準曲線，再根據檢測樣品的Ct值就可以準確地測定靶標病原菌的起始模板拷貝數。
[0006]利用實時熒光PCR技術對魯氏接合酵母菌進行檢測，在國內外尚無相關報道。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明要解決的第一個技術問題是提供一組快速、可靠、靈敏度高、特異性強的鑒定魯氏接合酵母菌的寡核苷酸，包括引物和探針。
[0008]本發(fā)明要解決的第二個技術問題是提供一種特異、靈敏、高效的鑒定魯氏接合酵母菌的實時熒光PCR試劑盒。
[0009]本發(fā)明要解決的第三個技術問題是提供一種食品中魯氏接合酵母菌的實時熒光PCR鑒定方法。
[0010]為解決第一個技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案:
[0011]一組鑒定魯氏接合酵母菌的寡核苷酸，為序列表SEQ ID No:1至SEQ ID No:3所示的寡核苷酸，其中序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分別為鑒定魯氏接合酵母菌的上游引物和下游引物，序列SEQ ID NO:3為鑒定魯氏接合酵母菌的熒光探針，具體為:
[0012]上游引物:5，-CCAGACGCTGCCTGCTTCTA-3’，(SEQID NO:1)；
[0013]下游引物:5’-CCACGATAGTCGTATTAGG-3’，(SEQ ID NO:2)；
[0014]探針:5’-TGAGGTCAAACTTTGAGAA-3’，(SEQ ID NO:3);該探針的 5’ 端標記報告熒光基團FAM，3’端標記淬滅熒光基團BHQ1。
[0015]為解決第二個技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案:
[0016]本發(fā)明提供了一種鑒定魯氏接合酵母菌的實時熒光PCR試劑盒，包括以下組分:
[0017](I)實時熒光PCR反應液，其包括序列表SEQ ID N0.1所示的上游引物，序列表SEQID N0.2所示的下游引物，序列表SEQ ID N0.3所示的熒光探針，該探針的5’端標記報告熒光基團FAM，3’端標記淬滅熒光基團BHQl ；
[0018](2)陰性對照:無菌雙蒸水；
[0019](3)陽性對照:魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii) CGMCC2.1915。
[0020]進一步地，為了操作方便，本發(fā)明所使用的實時熒光PCR反應液還包括TaqManUniversal PCR Master Mix (2X )，其購自北京東方嘉誠科貿有限公司，產品包括PCR 反應緩沖液、dNTPs、Mg2+、AmpErase UNG 及 GeneCore HS DNA Polymaras 的 2x 混合液。
[0021]為解決第三個技術問題，本發(fā)明還提供了一種食品中魯氏結合酵母菌的實時熒光PCR鑒定方法，包括如下步驟:
[0022](I)從待檢食品中分離可疑目標菌落，然后進行微生物的純培養(yǎng)；
[0023](2)提取待鑒定菌株的基因組DNA作為模板；
[0024](3)進行實時熒光PCR反應，其中，所使用的引物為序列SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示的上游引物和下游引物，所使用的探針為序列SEQ ID NO:3所示的熒光探針，該探針的5’端標記報告熒光基團FAM，3’端標記淬滅熒光基團BHQl ；
[0025]表1實時熒光PCR反應體系
【權利要求】
1.一組鑒定魯氏結合酵母菌的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸如序列表SEQ IDN0.1至序列表SEQ ID N0.3所示；其中序列SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2分別為鑒定魯氏結合酵母菌的上游引物和下游引物，序列SEQ ID N0.3為鑒定魯氏結合酵母菌的熒光探針。
2.根據權利要求1所述的鑒定魯氏結合酵母菌的寡核苷酸，其特征在于，所述熒光探針序列SEQ ID NO:3的5’端標記報告熒光基團FAM，3’端標記淬滅熒光基團BHQ1。
3.權利要求1或2所述的鑒定魯氏結合酵母菌的寡核苷酸在制備鑒定魯氏結合酵母菌試劑盒中的應用。
4.一種鑒定魯氏結合酵母菌的實時熒光PCR試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括以下組分: (1)實時熒光PCR反應液，其包括序列表SEQID N0.1所示的上游引物，序列表SEQ IDN0.2所示的下游引物，序列表SEQ ID N0.3所示的熒光探針，該探針的5’端標記報告熒光基團FAM，3’端標記淬滅熒光基團BHQl ； (2)陰性對照； (3)陽性對照。
5.一種食品中魯氏結合酵母菌的實時熒光PCR鑒定方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)從待檢食品中分離可疑目標菌落，然后進行微生物的純培養(yǎng)； (2)提取待鑒定菌株的基因組DNA作為模板； (3)進行實時熒光PCR反應，其中，所使用的引物為序列SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示的上游引物和下游引物，所使用的探針為序列SEQ ID NO:3所示的熒光探針，該探針的5’端標記報告熒光基團FAM，3’端標記淬滅熒光基團BHQl ； (4)根據樣品的Ct值進行結果判定。
【文檔編號】C12N15/11GK103642929SQ201310683581
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月13日 優(yōu)先權日:2013年12月13日
【發(fā)明者】饒紅, 蔡雪鳳, 付溥博, 陳世瓊, 逄波, 郭錚蕾 申請人:北京市海淀區(qū)產品質量監(jiān)督檢驗所