一種添加殼聚糖制備交聯(lián)酶聚集體的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種添加殼聚糖制備交聯(lián)酶聚集體的方法，包括配制酶溶液、于酶溶液中加入殼聚糖和至少一種其它蛋白沉淀劑使酶蛋白聚集沉淀、用交聯(lián)劑交聯(lián)形成的酶聚集體和回收形成的交聯(lián)酶聚集體等步驟。本發(fā)明方法對(duì)于低濃度酶溶液也適用，所制備的交聯(lián)酶聚集體的活性高，是無(wú)載體固定化酶，可用于相應(yīng)的酶催化反應(yīng)中。
【專利說(shuō)明】一種添加殼聚糖制備交聯(lián)酶聚集體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種添加殼聚糖制備交聯(lián)酶聚集體的方法及由此制備的交聯(lián)酶聚集體，屬于生物化工領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]固定化酶與游離酶相比穩(wěn)定性高、易從反應(yīng)系統(tǒng)中分離、能重復(fù)使用、利于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化生產(chǎn)，獲得性能優(yōu)異的固定化酶對(duì)實(shí)現(xiàn)工業(yè)環(huán)境下酶的高效利用，促進(jìn)生物催化產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展具有重要意義。
[0003]酶的固定化方法根據(jù)是否需要載體可分為載體固定化法和無(wú)載體固定化法。載體固定化法由于惰性載體的引入，“稀釋”了酶的活性(在整個(gè)固定化酶重量中，載體一般占90%以上)，并且載體通常會(huì)影響底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散，所得固定化酶的單位酶活低。其次，有些載體比酶更昂貴，如Eupergit系列、碳納米管等，制備費(fèi)用高。還有，一些載體穩(wěn)定性差或具有毒性，易污染產(chǎn)品。因此，盡管研究人員在載體固定化方法的改進(jìn)及新型載體的開(kāi)發(fā)上作了許多工作，但真正投入工業(yè)化應(yīng)用的尚不多。
[0004]近年來(lái)，出現(xiàn)了一種無(wú)載體固定化酶的方法-交聯(lián)酶聚集體(cross-linkedenzyme aggregates)技術(shù)，該法最先由荷蘭Delft理工大學(xué)的Sheldon小組提出[CaoL，van Rantwijk F，Sheldon R A.Cross-linked enzyme aggregates:A simple andeffective method for the immobilization of penicillin acylase.0rganic Letters，2000,2(10):1361-1364.]，其原理為:向酶液中添加鹽、有機(jī)溶劑、非離子聚合物等沉淀劑，可以使酶蛋白通過(guò)非共價(jià)鍵形成超分子結(jié)構(gòu)-不溶性的物理聚集體，然后再利用交聯(lián)劑對(duì)聚集體進(jìn)行共價(jià)捆綁，就得到交聯(lián)酶聚集體，其結(jié)構(gòu)和活性在反應(yīng)體系中不易被破壞，可被回收重復(fù)使用。利用交聯(lián)酶聚集體技術(shù)可以提高酶對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性，調(diào)控酶的功能，并且可同時(shí)對(duì)多種酶聯(lián)合固定化。與載體固定化法相比，交聯(lián)酶聚集體技術(shù)所得固定化酶單位酶活高，這樣應(yīng)用時(shí)使用較小的反應(yīng)器即可，投資和操作費(fèi)用低。
[0005]在制備交聯(lián)酶聚集體時(shí)，需選擇合適的沉淀劑和沉淀?xiàng)l件，這樣才能取得好的沉淀效果，制出高活性的交聯(lián)酶聚集體[Schoevaart R, Wolbers M ff, Golubovic M, OttensM, Kieboom A P, van Rantwijk F, van der Wielen L A, Sheldon R A.Preparation,optimization, and structures of cross-1 inked enzyme aggregates (CLEAs).Biotechnology and Bioengineering,2004,87(6):754-762.]。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種添加殼聚糖制備交聯(lián)酶聚集體的方法，還提供按照本發(fā)明方法制備的交聯(lián)酶聚集體。用本發(fā)明方法制備交聯(lián)酶聚集體時(shí)，酶蛋白的聚集沉淀效果好，所得交聯(lián)酶聚集體的活性高。
[0007]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種添加殼聚糖制備交聯(lián)酶聚集體的方法，該方法包括以下步驟:[0008]步驟1:配制酶溶液；
[0009]步驟2:使酶溶液中的酶蛋白聚集沉淀；
[0010]步驟3:用交聯(lián)劑交聯(lián)形成的酶聚集體；
[0011]步驟4:回收形成的交聯(lián)酶聚集體。
[0012]其特征是在步驟2中通過(guò)添加殼聚糖和至少一種其它蛋白沉淀劑使酶溶液中的酶蛋白聚集沉淀。
[0013]其中所述的酶可以是任何酶或不同酶的組合物。例如蛋白酶、脂酶、青霉素?；?、脲酶、果膠酶、乳糖酶、海藻糖合酶、葡萄糖異構(gòu)酶、半乳糖苷酶、β -淀粉酶、普魯蘭酶、葡萄糖淀粉酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、過(guò)氧化物酶、漆酶、植酸酶、有機(jī)磷水解酶、氨基甲酸酯水解酶、擬除蟲(chóng)菊酯水解酶和它們的組合物。
[0014]所述的蛋白沉淀劑是指可以使酶通過(guò)非共價(jià)鍵形成聚集體而沉淀的物質(zhì)。例如硫酸銨、硫酸鈉等鹽類，丙酮、乙醇、異丙醇、叔丁醇、乳酸乙酯等有機(jī)溶劑，聚乙二醇(PEG)、葡聚糖等非離子型聚合物。殼聚糖能夠通過(guò)吸附、橋連等作用使蛋白絮凝沉淀，也可以看作是一種蛋白沉淀劑。
[0015]所述的交聯(lián)劑是能與所選的酶共價(jià)交聯(lián)的試劑。例如戊二醛、乙二醛、丁二醛、葡聚糖聚醒(dextran aldehyde)、雙醒淀粉等醒類物質(zhì),三輕甲基膦、京尼平、1-乙基-(3_ 二甲基氨基丙基)_碳二亞胺(EDC)、異氰酸鹽(或酯)、環(huán)氧化物、酸酐、偶氮化合物等。可以只用一種交聯(lián)劑，也可以用兩種或多種不同類型的交聯(lián)劑。
[0016]在步驟I所述的酶溶液中加入酶的保護(hù)劑。保護(hù)劑通?？梢赃x自酶的底物、底物類似物、酶反應(yīng)的產(chǎn)物、酶活抑制劑、聚乙二醇(PEG)等，也可以添加其它的蛋白質(zhì)，例如牛血清白蛋白(BSA)。
[0017]在步驟4后還可包括干燥所得交聯(lián)酶聚集體的步驟，以便能夠長(zhǎng)期貯存交聯(lián)酶聚集體。
[0018]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
[0019]1、添加殼聚糖可以提高其它蛋白沉淀劑對(duì)酶蛋白的沉淀效果，即使酶濃度較低時(shí)，也能使酶充分聚集沉淀。
[0020]2、當(dāng)使用可與氨基反應(yīng)的交聯(lián)劑(例如戊二醛)進(jìn)行交聯(lián)時(shí)，殼聚糖能夠和酶共交聯(lián)，降低交聯(lián)劑對(duì)酶活性的影響，提高所得交聯(lián)酶聚集體的活性。
【具體實(shí)施方式】
[0021]結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍。
[0022]按照下述步驟添加殼聚糖制備交聯(lián)酶聚集體:
[0023]步驟1:配制酶溶液。
[0024]所述的酶可以是一種酶，也可以是一種以上的酶組成的復(fù)合酶。當(dāng)所述的酶是海藻糖合酶時(shí)，可以通過(guò)脂肪桿菌(Pimelobacter sp.)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、棲熱菌(Thermus sp.)、亞棲熱菌(Meiothermus sp.)或含有海藻糖合酶基因的工程菌發(fā)酵而得。當(dāng)酶是固體形式的酶時(shí)，將酶以適宜的緩沖液或蒸餾水溶解，配成所需的濃度，如果有不溶物，再采用離心或 過(guò)濾的方法予以去除即可。當(dāng)酶是液體酶時(shí)，可以直接使用，也可以用適宜的緩沖液或蒸餾水稀釋至所需的濃度后使用。
[0025]步驟2:于酶溶液中添加殼聚糖和至少一種其它蛋白沉淀劑使酶溶液中的酶蛋白聚集沉淀。
[0026]可以按照文獻(xiàn)(SchoevaartR, Wolbers M ff, Golubovic M, Ottens M, KieboomA P，van Rantwijk F，van der Wielen L A，Sheldon R A.Preparation, optimization,and structures of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs).Biotechnology andBioengineering, 2004,87 (6):754-762.)方法針對(duì)不同的酶選擇合適的沉淀劑。
[0027]可以用不同脫乙酰度的殼聚糖，例如較低脫乙酰度殼聚糖(脫乙酰度≥70% )、中等脫乙酰度殼聚糖(脫乙酰度70~85% )和較高脫乙酰度殼聚糖(脫乙酰度85%以上)。對(duì)于殼聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量沒(méi)有限制，通常可由殼聚糖溶液粘度的高低反映出殼聚糖相對(duì)分子質(zhì)量的大小。根據(jù)所用殼聚糖的溶解性，選擇適當(dāng)?shù)娜芤海?.1~5% (v / v)濃度的醋酸、甲酸、鹽酸或檸檬酸等酸溶液或者水，將其溶解，配成所需濃度的殼聚糖溶液后使用。
[0028]對(duì)殼聚糖和其它蛋白沉淀劑的添加順序沒(méi)有要求，殼聚糖和其它蛋白沉淀劑的適宜添加量通過(guò)試驗(yàn)確定。
[0029]步驟3:用交聯(lián)劑交聯(lián)形成的酶聚集體。
[0030]添加完殼聚糖和其它蛋白沉淀劑并混勻后的酶溶液可以馬上加入交聯(lián)劑，也可以聚集沉淀一定時(shí)間后(通常2h以內(nèi))再加入交聯(lián)劑。
[0031]交聯(lián)劑與酶分子發(fā)生反應(yīng)，通常會(huì)影響酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使酶的活性降低甚至喪失。因此為了降低交聯(lián)反應(yīng)引起的酶活損失，可以在步驟I所述的酶溶液中加入酶的保護(hù)劑。交聯(lián)劑的種類和添加量，交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間、溫度和PH值，以及是否添加保護(hù)劑等都會(huì)影響所得交聯(lián)酶聚集體的酶活，可通過(guò)試驗(yàn)確定。對(duì)于海藻糖合酶，保護(hù)劑可選為麥芽糖、海藻糖或葡萄糖，可以只加入一種保護(hù)劑，也可以加入兩種或兩種以上的保護(hù)劑。
[0032]步驟4:回收形成的交聯(lián)酶聚集體。
[0033]步驟3結(jié)束后，可以采用離心或過(guò)濾的方法分離形成的交聯(lián)酶聚集體，將交聯(lián)酶聚集體充分清洗后即可貯存?zhèn)溆谩Ｈ绻枰脑?，還可以采用冷凍干燥、真空干燥、噴霧干燥或其它干燥方法將交聯(lián)酶聚集體干燥后備用。
[0034]由此獲得的本發(fā)明的交聯(lián)酶聚集體可用于相應(yīng)的酶催化反應(yīng)中。例如，當(dāng)酶為海藻糖合酶時(shí)，用本發(fā)明方法制備的交聯(lián)酶聚集體可用于轉(zhuǎn)化麥芽糖制備海藻糖。
[0035]在下述實(shí)施例1~實(shí)施例5中，均以海藻糖合酶為例。按下述方法測(cè)定海藻糖合酶的活性:將ImL酶液或酶懸浮液加入到ImL以IOmmol / L、pH7.0的磷酸緩沖液配制的20% (w / v)的麥芽糖溶液中，混勻后，將該混合物溶液于60°C保溫60min，然后于100°C加熱IOmin中止酶促反應(yīng)。反應(yīng)混合物冷卻后,8000r / min離心15min,取上清液,用高效液相色譜法測(cè)定生成的海藻糖含量。酶活力單位定義為:在上述反應(yīng)條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化麥芽糖生成1 μ mol海藻糖所需的酶量為I單位。
[0036]高效液相色譜法測(cè)定海藻糖的條件如下:
[0037]色譜柱:Hypersil NH2,4.6mm X 250mm,填料粒徑5μηι ;檢測(cè)器:示差折光檢測(cè)器；流動(dòng)相:乙腈/水=75 / 25(ν / V);柱溫:室溫；進(jìn)樣量:20μ L ;流速:1.0mL / min。
[0038]實(shí)施例1:僅用殼聚糖與協(xié)同使用殼聚糖比較[0039]在本實(shí)施例中，使用的殼聚糖記為殼聚糖A，其脫乙酰度為90 %，預(yù)先用0.5 %(V / v)的醋酸將其配成濃度為1% (w / V)的溶液，所得溶液粘度約320cP(25°C )。
[0040]用50mmol / L、pH7.0的磷酸緩沖液配制海藻糖合酶溶液，其蛋白含量為2mg/mL。取ImL海藻糖合酶溶液,加入0.lmL>l% (w / v)的殼聚糖A溶液,混勻,聚集沉淀lh,8000r / min離心lOmin，收集上清液，測(cè)酶活，計(jì)算上清酶活損失。另取ImL海藻糖合酶溶液，加入0.1mLU % (w / v)的殼聚糖A溶液，混勻，然后加入0.2g的PEG6000，振蕩或攪拌，使PEG溶解，聚集沉淀lh，8000r / min離心lOmin，收集上清液，測(cè)酶活，計(jì)算上清酶活損失。結(jié)果見(jiàn)表1。上清酶活損失定義為上清液中海藻糖合酶活性與起始酶液中海藻糖合酶活性的百分比。
[0041]表1只用與協(xié)同使用殼聚糖比較
【權(quán)利要求】
1.一種添加殼聚糖制備交聯(lián)酶聚集體的方法，該方法包括以下步驟: 步驟1:配制酶溶液； 步驟2:使酶溶液中的酶蛋白聚集沉淀； 步驟3:用交聯(lián)劑交聯(lián)形成的酶聚集體； 步驟4:回收形成的交聯(lián)酶聚集體。 其特征是在步驟2中通過(guò)添加殼聚糖和至少一種其它蛋白沉淀劑使酶溶液中的酶蛋白聚集沉淀。
2.權(quán)利要求1所述的制備交聯(lián)酶聚集體的方法，其特征是在步驟I所述的酶溶液中加入酶的保護(hù)劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2中任一權(quán)利要求所述的方法制備的交聯(lián)酶聚集體。
4.權(quán)利要求3所述的交聯(lián)酶聚集體，其中所述的酶為海藻糖合酶。
【文檔編號(hào)】C12N11/10GK103642786SQ201310680404
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月9日
【發(fā)明者】張峻, 陳穎, 鄭劍峰, 楊麗維, 陳曉云, 齊欣 申請(qǐng)人:天津市林業(yè)果樹(shù)研究所