一種用于檢測結(jié)直腸癌K-ras基因突變的核酸質(zhì)譜的制備方法及其產(chǎn)品的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測K-ras基因12、13密碼子突變的方法，該方法基于質(zhì)譜檢測核酸酶切指紋圖譜技術(shù)，包括PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物純化、逆轉(zhuǎn)錄和核酸酶切、酶切產(chǎn)物純化、質(zhì)譜儀檢測等步驟。基于該方法，檢測人K-ras基因12、13密碼子是否存在突變，可為臨床判斷患者預(yù)后，決定用藥方案提供參考。
【專利說明】—種用于檢測結(jié)直腸癌K-ras基因突變的核酸質(zhì)譜的制備方法及其產(chǎn)品
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因檢測領(lǐng)域，涉及一種用于檢測結(jié)直腸癌K-ras基因突變的核酸質(zhì)譜的制備方法及其產(chǎn)品，具體地是涉及利用核酸指紋質(zhì)譜方法來檢測一種K-ras基因12、13密碼子及其相關(guān)產(chǎn)品。
【背景技術(shù)】 [0002]K-ras基因(GenBank:NC_000012)是RAS基因超家族中的一種原癌基因，位于12號染色體短臂上，其編碼的蛋白是細(xì)胞表面受體如EGFR等信號傳導(dǎo)通路上的重要蛋白，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著關(guān)鍵作用。通過下游信號蛋白參與細(xì)胞周期調(diào)控，與腫瘤細(xì)胞的生存、增殖、遷移擴(kuò)散、血管生成密切相關(guān)。
[0003]在正常生理情況下，細(xì)胞受到外界刺激并激活EGFR等信號通路，野生型的KRAS蛋白被上游EGFR等酪氨酸激酶磷酸化，導(dǎo)致短暫激活，從而激活該信號通路中的下游信號蛋白，其后KRAS蛋白迅速失活。而K-ras基因的突變將導(dǎo)致蛋白功能異常，在無EGFR活化信號刺激下，突變的KRAS蛋白仍處于激活狀態(tài)，其功能狀態(tài)不可控，使腫瘤的持續(xù)增殖等。
[0004]近年來研究顯示K-ras基因活性物與細(xì)胞增殖、凋亡之間關(guān)系密切。突變K_ras基因使本應(yīng)正常死亡的細(xì)胞的生存期延長，可能的機(jī)制是K-ras基因增強(qiáng)了細(xì)胞分解過氧化氫的能力從而抑制凋亡。大約70%的腫瘤在不同程度上都與該基因12、13位密碼子突變有關(guān)。K-ras基因在結(jié)腸癌占44%，胰腺癌占90%。
[0005]目前已報(bào)道的K-ras基因突變集中于第12、13位密碼子，該區(qū)域共有7種單位點(diǎn)突變型(表1)。
[0006]表1:K_ras基因常見突變
[0007]

12-13位密碼子~1--
GGT-GGC野生型 WT
AGT-GGC突變型 12S
[0008]
CGT-GGCj 突變型 [12R
TGT-GGC突變型 12C
GAT-GGC突變型 12D
GCT-GGC突變型 12AGTT-GGCj 突變型 [I2V
GGT-GAC突變型 13D
[0009]新型的抗腫瘤靶向藥物是以與腫瘤生物學(xué)特性相關(guān)的細(xì)胞信號通路上關(guān)鍵因子為靶標(biāo)，通過改變這些關(guān)鍵因子的活性，影響整個(gè)通路的信號傳導(dǎo)，最終抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展。
[0010]其中，Cetuximab (愛必妥)和Panitumumab (帕尼單抗)等藥物,通過與內(nèi)源性配體(EGF、TGFa等)競爭性結(jié)合EGFR，阻斷EGFR介導(dǎo)的細(xì)胞通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。這些靶向藥物價(jià)格昂貴，但是對攜帶野生型K-ras基因的患者療效非常好。而K-ras基因若發(fā)生突變，將使KRAS蛋白在無EGFR影響下長期處于激活狀態(tài)，使腫瘤持續(xù)增殖，這也就意味著這些藥物失效。因此，如果攜有K-ras基因突變的患者服用相關(guān)藥物，治療效果不明顯，不僅造成巨額藥費(fèi)的浪費(fèi)，還耽誤了病情。
[0011]2008年6月在美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)年會上發(fā)布的臨床結(jié)果表明，K_ras突變型患者并不能從抗EGFR治療中獲益，并具有不良反應(yīng)危險(xiǎn)，而K-ras野生型患者就很有可能從這類藥物治療中獲益。同年10月，K-ras基因突變檢測被寫入《美國國立癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN)結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南》(2008年第3版)。該指南明確指出:所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者都應(yīng)檢測K-ras基因狀態(tài)，只有野生型患者才建議接受EGFR抑制劑(如Cetuximab> Panitumumab等)的治療。歐洲藥監(jiān)機(jī)構(gòu)和美國FDA都明確規(guī)定了在使用革巴向藥物Cetuximab和Pan itumumab治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌前必須檢測K_ras基因。我國的《結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2010年版)》也提示，“確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌時(shí)，檢測腫瘤組織K-ras基因狀態(tài)”。
[0012]所以，對K-ras基因突變進(jìn)行檢測，將有助于制定合理的用藥方案，也是未來腫瘤個(gè)體化治療的發(fā)展方向。
[0013]另一方面，近年研究發(fā)現(xiàn)在外周血液中能夠檢測到早期腫瘤細(xì)胞逸出的突變DNA，成為良好的腫瘤診斷、治療預(yù)后的生物標(biāo)記。Kimura等(2006年)報(bào)道能夠在循環(huán)血液中檢測到K-ras突變，認(rèn)為檢測這些外周血液中的突變DNA，可以知道患者體內(nèi)是否存在微小病灶、腫瘤手術(shù)后是否存在轉(zhuǎn)移、靶向藥物靶標(biāo)位點(diǎn)的分子學(xué)特征等，從而作出相應(yīng)治療方案。因此，檢測K-ras基因的突變，還將有助于評價(jià)治療效果，有助于對腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)測，有助于對腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)行早期診斷。
[0014]目前檢測K-ras基因突變的方法有多種，主要有兩大類，一類是非實(shí)時(shí)PCR，如測序法、限制性片段長度多態(tài)性法(RFLP)、DHPLC以及基于多重PCR和單堿基延伸的質(zhì)譜檢測等，雖然測序法為核酸序列分析的金標(biāo)準(zhǔn)，基于多重PCR和單堿基延伸的質(zhì)譜檢測也廣泛的運(yùn)用于基因多態(tài)和基因突變檢測實(shí)驗(yàn)中，但是這些方法步驟繁瑣，耗時(shí)長。另一類是實(shí)時(shí)PCR及其各類變化，如TaqMan探針、競爭性抑制實(shí)時(shí)PCR方法等。這類方法最大的缺陷在于，K-ras基因在12、13密碼子處共有7種突變類型，加上野生型共為8種基因型，以PCR的方法對這兩個(gè)密碼子進(jìn)行基因分型，共要進(jìn)行8個(gè)PCR反應(yīng)(如基于擴(kuò)增受阻突變體系(ARMS)的蝎子引物法)，操作上過于繁瑣，成本也較高。
[0015]綜上所述，目前檢測K-ras基因12、13密碼子是否發(fā)生突變，對腫瘤患者(特別是結(jié)直腸癌患者)能否使用特定的靶向抗癌藥物具有極其重要的臨床意義。而現(xiàn)有的檢測技術(shù)，或者步驟繁瑣，耗時(shí)過長，或者要分多個(gè)反應(yīng)進(jìn)行，成本較高。
[0016]因此，目前需要一種對K-ras基因突變的快速、簡便、準(zhǔn)確和高效的檢測方法，從而為結(jié)直腸癌的合理給藥治療提供便利。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017]本發(fā)明第一個(gè)目的提供一種制備K-ras基因12、13密碼子突變的核酸指紋圖譜的方法，它包括如下步驟:
[0018](I)PCR反應(yīng):使用特異性PCR引物，擴(kuò)增包含12、13密碼子在內(nèi)的K-ras基因DNA序列；
[0019](2) PCR產(chǎn)物純化:對步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化；
[0020](3)逆轉(zhuǎn)錄和核酸酶切:使用特定的逆轉(zhuǎn)錄酶和核酸酶，對步驟(2)得到的純化產(chǎn)物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和核酸酶切，獲得一系列長度不一、豐度不一的核酸片段；
[0021](4)純化:對步驟(3)得到的酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化；
[0022](5)質(zhì)譜儀檢測:將步驟(4)得到的純化產(chǎn)物上點(diǎn)在含有基質(zhì)的靶片上，上質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，得到K-ras基因DNA片段(含12、13密碼子)的核酸酶切指紋圖譜。
[0023]在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟I所述的PCR引物選自如SEQ ID NO: 1_2所示的序列，且步驟3所述的特定酶，包括但不限于RNaseA酶。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，上述PCR引物序列為核心序列，其在5’端可包括保護(hù)堿基序列，優(yōu)選5-15個(gè)堿基。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，保護(hù)堿基序列選自在SEQ NO:1的5’端加入aggaagagag,在SEQ ID NO: 2的5’端加入cagtaatacgactcactatagggagaaggct。例如，實(shí)際合成的引物序列如下:·[0024]5’-aggaagagagAAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3’
[0025]5’-cagtaatacgactcactatagggagaaggctTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3’
[0026]在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟5的純化包括在轉(zhuǎn)錄和酶切產(chǎn)物中加入超純水，混勻后，再加入樹脂，上下顛倒混勻15分鐘。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，其中所述質(zhì)譜儀是MALDI TOF MS 質(zhì)譜儀。
[0027]上述任一方案中，其中密碼子突變的類型選自12S、12R、12C、12D、12A、12V、13D，其中，
12-13 β密Ri表型命名
GGT-GGC野 4:.型WT
A6T-GGC突變.?12S
[0028]CGT-GGC突變摩—12R
TGT-GGC突變.?12C
GAT-GGC突變12D
GfiT-GGC突免切12A
GTT-GGC突變.型12V
[0029]
GGT-GAC究變 M13D[0030]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供建立K-ras基因12、13密碼子突變的核酸指紋特征圖譜庫的方法，至少包括:
[0031]上述步驟1-5，和:
[0032](6)將步驟5得到的K-ras基因12、13密碼子野生型及突變型的核酸指紋特征圖譜，通過計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行匯總和整理，得到所述的K-ras基因12、13密碼子的核酸指紋特征圖譜庫。
[0033]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述軟件是發(fā)明人自行研究開發(fā)的BioExplore軟件，其版權(quán)號為軟著登字第136879號、登記號2009SR10700。
[0034]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述方法所制備的K-ras基因12、13密碼子突變的核酸指紋特征圖譜庫。
[0035]本發(fā)明第四目的是提供一種利用上述特征圖譜庫進(jìn)行待測K-ras基因12、13密碼子突變檢測的方法，包括:
[0036](1) PCR反應(yīng):使用特異性PCR引物，擴(kuò)增包含12、13密碼子在內(nèi)的待測K_ras基因DNA序列；
[0037](2) PCR產(chǎn)物純化:對步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化；
[0038](3)逆轉(zhuǎn)錄和核酸酶切:使用特定的逆轉(zhuǎn)錄酶和核酸酶，對步驟(2)得到的純化產(chǎn)物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和核酸酶切，獲得一系列長度不一、豐度不一的核酸片段；
[0039](4)純化:對步驟(3)得到的酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化；
[0040](5)質(zhì)譜儀檢測:將步驟(4)得到的純化產(chǎn)物上點(diǎn)在含有基質(zhì)的靶片上，上質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，得到待測K-ras基因DNA片段(含12,13密碼子)的核酸酶切指紋圖譜；
[0041](6)將所得核酸指紋特征圖譜與核酸指紋特征圖譜庫進(jìn)行比較，從而判斷待測K-ras基因12、13密碼子的突變類型。
[0042]在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟3所述的特定酶,包括但不限于RNaseA酶。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，其中所述質(zhì)譜儀是MALDI TOF MS質(zhì)譜儀。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，步驟6通過BioExplore軟件進(jìn)行比較檢測。
[0043]本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供建立一種通過上述K-ras基因核酸指紋圖譜庫判斷該基因12、13密碼子突變類型的方法，該方法至少包括:
[0044]本發(fā)明上述第一目的的步驟(1)- (5)，和:
[0045](6)將步驟(5)得到的待測樣本的核酸酶切指紋圖譜，與野生型或突變型的核酸指紋特征圖譜庫進(jìn)行對比，看是否存在特征峰，即可判斷K-ras基因12、13密碼子的突變類型。
[0046]在一個(gè)實(shí)施方案中，上述方法可用于指導(dǎo)臨床用藥。
[0047]本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供能用于K-ras基因12、13密碼子基因型檢測的檢測產(chǎn)品，包括:
[0048](1)用于擴(kuò)增DNA的弓丨物對及其緩沖液；
[0049](2 )用于PCR產(chǎn)物純化的試劑；
[0050](3)用于逆轉(zhuǎn)錄及核酸酶切的逆轉(zhuǎn)錄酶和核酸酶及其緩沖液；
[0051](4)用于純化酶切產(chǎn)物的試劑；
[0052](5)用于比對核酸指紋特征圖譜的分析軟件。[0053]在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述引物是SEQ ID NO: 1-20
[0054]在另一實(shí)施方案中，其中所述軟件是BioExplore軟件，其版權(quán)號為(軟著登字第136879 號、登記號 2009SR10700)。
[0055]定義
[0056]本發(fā)明所述的“K-ras基因DNA片段”，是指K_ras基因編碼序列中，包含12、13密碼子在內(nèi)的一段DNA。
[0057]術(shù)語“保護(hù)堿基”，指在PCR引物的5’端額外增加的堿基。由于保護(hù)堿基的序列使得PCR引物(即核心引物)的分子量增大，可以避免反應(yīng)剩余的PCR引物進(jìn)入質(zhì)譜檢測窗口，以避免干擾檢測效果。
[0058]術(shù)語“檢測產(chǎn)品”，指用于檢測SNP位點(diǎn)基因型的任何常規(guī)產(chǎn)品，包括:檢測試劑、檢測芯片(如基因芯片、液體芯片等)、檢測載體，以及檢測試劑盒等。
[0059]有益效果
[0060] 1、本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)K-ras基因12、13密碼子基因型的檢測，方便臨床醫(yī)師做出用藥判斷。
[0061]2、相對于測序法、限制性片段長度多態(tài)性法(RFLP)、DHPLC以及基于多重PCR和單堿基延伸的質(zhì)譜檢測等方法，本發(fā)明全過程僅用1-3小時(shí)即可完成，可快速獲得基因型結(jié)果;
[0062]3、相對于常規(guī)PCR測序檢測、競爭性抑制實(shí)時(shí)PCR、基于擴(kuò)增受阻突變體系(ARMS)的蝎子引物法等方法，本發(fā)明僅在一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)即可完成實(shí)驗(yàn)，方便快捷，并且大大的降低了試劑盒耗材成本；
[0063]4、質(zhì)譜檢測技術(shù)具有高靈敏度、高準(zhǔn)確性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0064]圖1為野生型(WT)的核酸酶切指紋圖譜
[0065]圖2為突變型(12A)的核酸酶切指紋圖譜
[0066]圖3為突變型(12C)的核酸酶切指紋圖譜
[0067]圖4為突變型(12D)的核酸酶切指紋圖譜
[0068]圖5為突變型(12R)的核酸酶切指紋圖譜
[0069]圖6為突變型(12S)的核酸酶切指紋圖譜
[0070]圖7為突變型(12V)的核酸酶切指紋圖譜
[0071]圖8為突變型(13D)的核酸酶切指紋圖譜
[0072]圖9為對照樣本I的測序結(jié)果
[0073]圖10為樣本I的測序結(jié)果
[0074]圖11為樣本2的測序結(jié)果
[0075]圖12為樣本3的測序結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0076]現(xiàn)在僅用參考下面非限制性的實(shí)施例的方式進(jìn)一步描述本發(fā)明。但是應(yīng)當(dāng)理解，下面的實(shí)施例僅僅是作為例證的，不應(yīng)以任何方式當(dāng)作對上述本發(fā)明總體的限制。除非有其它說明。本發(fā)明的實(shí)施例使用本領(lǐng)域中的傳統(tǒng)分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、PCR擴(kuò)增和突變技術(shù)等等。這些技術(shù)是技術(shù)人員熟知的，并在文獻(xiàn)中有詳細(xì)解釋。參見，例如，[0077]Sam brook and Russell" Molecular Cloning:A Laboratory Manual" (2001);
[0078]Cloning:A Practical Approach, " Volumes I and II (D.N.Glover, ed.,1985)";
[0079]T.A Brown “Genome”BIOS Scientific Publishers Limited;
[0080]PY Kwok Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.(2001), 235 - 58.[0081]實(shí)施例一、引物設(shè)計(jì)。
[0082]針對K-ras基因DNA片段，設(shè)計(jì)對應(yīng)特異性PCR弓丨物核心序列(SEQ ID No:1和SEQ ID No:2)，該對引物能擴(kuò)增K-ras基因編碼序列上，含12、13密碼子在內(nèi)的83bp。
[0083]SEQ ID No:1:5’-AAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3’
[0084]SEQ ID No:2:5’-TAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3’
[0085]它們擴(kuò)增的序列SEQ ID NO:3 (83bp)如下(其中加下劃線區(qū)域?yàn)?2、13密碼子，僅列出野生型):
[0086]SEQ ID No:3:AAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTG GTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTA
[0087]為了使逆轉(zhuǎn)錄酶識別PCR產(chǎn)物，并且避免PCR引物進(jìn)入質(zhì)譜儀檢測窗口而干擾檢測效果，還需要在SEQ ID No:1和SEQ ID No:2的5’端加上特定序列(小寫字母)。因此，實(shí)際合成的引物序列如下:
[0088]SEQ ID No:4:5’-aggaagagagAAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3’
[0089]SEQ ID No:5:5’ -cagtaatacgactcactatagggagaaggctTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3’
[0090]它們擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物實(shí)際序列如下(其中加下劃線區(qū)域?yàn)?2、13密碼子，僅列出野生型，大寫字母為K-ras基因的部分編碼DNA，小寫字母為SEQ ID No:1和SEQ ID No:2的5’端加上的特定序列):
[0091]SEQ ID No:6:aggaagagagAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTT GGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAagccttctccctatagtgagtcgtatt actg
[0092]相關(guān)引物在生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行合成。
[0093]實(shí)施例二、樣本制備。
[0094]通過質(zhì)粒構(gòu)建和定點(diǎn)突變等分子克隆技術(shù)，分別構(gòu)建含K-ras基因野生型和7種突變的的質(zhì)粒，共8種，分別為樣本W(wǎng)T (野生型)、12A (12密碼子GGT>GCT)、12C (12密碼子GGT>TGT)、12D (12 密碼子 GGT>GAT)、12R (12 密碼子 GGT>CGT)、12S (12 密碼子 GGT>AGT)、12V (12密碼子GGT>GTT)、13D (13密碼子GGOGAC)。此操作采用基本的分子生物學(xué)常用技術(shù)，不再累述。
[0095]臨床結(jié)直腸癌患者一，在手術(shù)切除腫瘤組織時(shí)，取新鮮組織塊(黃豆大小)，以血液/細(xì)胞/組織基因組提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP304)提取該患者腫瘤基因組DNA，定為樣本1，-20°C備用。
[0096]結(jié)直腸癌術(shù)后患者二，采集靜脈血，分離血清(約Iml),采用磁珠法基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP329)提取該患者血清中的游離DNA，定為樣本2，-20°C備用。
[0097]某結(jié)直腸癌患者三的組織標(biāo)本，取石蠟切片10塊(5um厚，每塊中腫瘤組織面積大于70%)，采用石蠟包埋組織DNA試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP331)提取該樣本中的患者的腫瘤基因組DNA，定為樣本3，-20°C備用。
[0098]根據(jù)上述方法，對三名已知未患有結(jié)直腸癌的其他疾病患者，分別采集其直腸組織、靜脈血以及直腸組織石蠟切片，進(jìn)行處理，分別得到對照樣品1-3，-20°C備用。
[0099]實(shí)施例三、K-ras基因12、13密碼子野生型和突變型核酸酶切指紋圖譜的差異性分析和驗(yàn)證。
[0100]通過對野生型和突變型的序列進(jìn)行理論分析，野生型和突變型將產(chǎn)生不同的核酸酶切指紋圖譜，如表2所示，野生型的DNA片段，通過酶切將產(chǎn)生3738.35峰，并且不具有1577.98,2196.38,2485.56,3778.38和3794.37等峰，而突變型的DNA片段正好相反，通過酶切和質(zhì)譜后將產(chǎn)生1577.98,2196.38,2485.56,3778.38和3794.37等峰中的一個(gè)或幾個(gè)，而不存在3738.35峰。因此，理論上可通過3738.35峰是否存在確定是否存在野生型，通過1577.98,2196.38,2485.56,3778.38和3794.37等峰中的一個(gè)或幾個(gè)是否存在確定是否存在突變型。
[0101]表2:K-ras基因12、13密碼子野生型和突變型核酸酶切片段的理論分析
[0102]`
【權(quán)利要求】
1.一種制備κ-ras基因12、13密碼子突變的核酸指紋圖譜的方法，包括如下步驟: (1)PCR反應(yīng):使用特異性PCR引物，擴(kuò)增包含12、13密碼子在內(nèi)的K-ras基因DNA序列； (2)PCR產(chǎn)物純化:對步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化； (3)逆轉(zhuǎn)錄和核酸酶切:使用特定的逆轉(zhuǎn)錄酶和核酸酶，對步驟(2)得到的純化產(chǎn)物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和核酸酶切，獲得一系列長度不一、豐度不一的核酸片段； (4)純化:對步驟(3)得到的酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化； (5)質(zhì)譜儀檢測:將步驟(4)得到的純化產(chǎn)物上點(diǎn)在含有基質(zhì)的靶片上，上質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，得到K-ras基因DNA片段(含12、13密碼子)的核酸酶切指紋圖譜。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的PCR引物選自如SEQID NO: 1_2所示的序列，且步驟3所述的特定酶，包括但不限于RNaseA酶。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中上述PCR引物序列為核心序列，其在5’端可包括保護(hù)堿基序列，優(yōu)選5-15個(gè)堿基。
4.權(quán)利要求3的方法,其中保護(hù)堿基序列選自在SEQNO:1的5’端加入aggaagagag,在SEQ ID N0:2的5’端加入cagtaatacgactcactatagggagaaggc,即實(shí)際合成的引物序列如下:
5’-aggaagagagAAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3’`
5’-cagtaatacgactcactatagggagaaggctTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3’ 。
5.權(quán)利要求1至4的方法，其中密碼子突變的類型選自12S、12R、12C、12D、12A、12V、13D,即:12-13位密碼—f表型命名GGT-GGC野.,l1.fiWTAGT-GGC突變.?12SCGT-GGC突變甩12RTGT-CiCiC突變型12C GAT-GGC突變型12D GCT-GGC突變型12A GTT-GGC51變型12V ° GGT-GAC51變型13D
6.一種建立K-ras基因12、13密碼子突變的核酸指紋特征圖譜庫的方法，至少包括: 權(quán)利要求1-5中所述步驟1-5，和: (6)將步驟5得到的K-ras基因12、13密碼子野生型及突變型的核酸指紋特征圖譜，通過計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行匯總和整理，得到所述的K-ras基因12、13密碼子的核酸指紋特征圖譜庫。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述軟件是BioExplore軟件，其版權(quán)號為軟著登字第.136879 號、登記號 2009SR10700。
8.通過權(quán)利要求6或7的方法所制備的K-ras基因12、13密碼子突變的核酸指紋特征圖譜庫。
9.一種利用權(quán)利要求8的特征圖譜庫進(jìn)行待測K-ras基因12、13密碼子突變檢測的方法，包括: (1)PCR反應(yīng):使用特異性PCR引物，擴(kuò)增包含12、13密碼子在內(nèi)的待測K_ras基因DNA序列； (2)PCR產(chǎn)物純化:對步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化； (3)逆轉(zhuǎn)錄和核酸酶切:使用特定的逆轉(zhuǎn)錄酶和核酸酶，對步驟(2)得到的純化產(chǎn)物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和核酸酶切，獲得一系列長度不一、豐度不一的核酸片段； (4)純化:對步驟(3)得到的酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化； (5)質(zhì)譜儀檢測:將步驟(4)得到的純化產(chǎn)物上點(diǎn)在含有基質(zhì)的靶片上，上質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，得到待測K-ras基因DNA片段(含12,13密碼子)的核酸酶切指紋圖譜； (6)將所得核酸指紋特征圖譜與核酸指紋特征圖譜庫進(jìn)行比較，從而判斷待測K-ras基因12、13密碼子的突變類型。 在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟3所述的特定酶,包括但不限于RNaseA酶。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，其中所述質(zhì)譜儀是MALDI TOF MS質(zhì)譜儀。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，步驟6通過BioExplore軟件進(jìn)行比較檢測。
10.一種用于K-ras基因12、13密碼子基因型檢測的檢測產(chǎn)品，包括: (1)用于擴(kuò)增DNA的引物對及其緩沖液； (2)用于PCR產(chǎn)物純化的試劑； (3)用于逆轉(zhuǎn)錄及核酸酶切的逆轉(zhuǎn)錄酶和核酸酶及其緩沖液； (4)用于純化酶切產(chǎn)物的試劑； (5)用于比對核酸指紋特征圖譜的分析軟件；其中， 所述引物是SEQ ID NO:1-2。
【文檔編號】C12Q1/68GK103667490SQ201310680221
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】張學(xué)記, 馬慶偉, 趙洪斌, 張海燕, 林燕 申請人:向華