一種制備s-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種制備S-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷的方法。該方法以消旋體對硝基溴代苯乙酮為原料，經(jīng)過化學(xué)合成法，雙酶偶聯(lián)反應(yīng)，最終經(jīng)超濾和過硅膠柱得到高純度的S-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷。這種制備S-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷的方法，所用酶酶活高，時(shí)間短，成本底，S-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷純度高，反應(yīng)條件溫和，具有很好的工業(yè)化前景。
【專利說明】一種制備S-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種制備S-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷的方法，屬于生物催化不對稱制備醫(yī)藥手性中間體【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]光學(xué)純的環(huán)氧化物作為合成化學(xué)中重要的手性砌塊可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成許多具有生物活性的化合物，如白三烯、昆蟲信息素、留類物質(zhì)，腎上腺素阻斷劑、神經(jīng)保護(hù)劑和艾滋病毒蛋白酶抑制劑等，在醫(yī)藥、農(nóng)藥和化妝品等行業(yè)中具有非常廣闊的應(yīng)用前景。[0003]目前根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道S-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷的制備方法主要有化學(xué)合成法和生物酶法?；瘜W(xué)合成法以對硝基溴代苯乙酮(CAS =99-81-0)為底物，以硼氫化鈉為還原劑，在適量甲醇中反應(yīng)。產(chǎn)物經(jīng)過萃取，過硅膠柱分離得到消旋體2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷，再經(jīng)過手性制備柱得S-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷。該反應(yīng)會生成其它大量副反應(yīng)，工業(yè)生產(chǎn)和環(huán)保難度大，工業(yè)手性制備柱成本高，產(chǎn)品得率低。目前生物酶法制備S-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷都是直接以消旋體2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷為底物，用環(huán)氧化物水解酶催化從消旋體得到光學(xué)純的2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷。這種方法雖然簡單，但是消旋體2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷本身價(jià)格不低且在市場上不易買到，對硝基溴代苯乙酮(CAS:99-81-0)則非常便宜，每IOg只有100元左右。相比之下雙酶法生產(chǎn)成本低，同時(shí)減去了消旋體2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷的提取過程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種直接以消旋體對硝基溴代苯乙酮(CAS =99-81-0)為原料，先利用化學(xué)合成法合成消旋體2-溴-1- (4-硝基苯基)-乙醇:消旋體2- (4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷(7:3)的混合物，再利用鹵代醇脫鹵酶和環(huán)氧化物水解酶雙酶催化制備高純度的S-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷的方法。該工藝省去了消旋體2-溴-1-(4-硝基苯基)-乙醇(CAS: 19922-82-8)，消旋體2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷的分離提取過程，減少了酸堿消耗和設(shè)備投資，符合綠色環(huán)保和清潔生產(chǎn)的要求，效果突出，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案:本發(fā)明以消旋體對硝基溴代苯乙酮為底物，以化學(xué)合成法合成消旋體2-溴-1- (4-硝基苯基)-乙醇和消旋體2- (4-硝基苯基)環(huán)氧乙燒的混合物(如圖1)，鹵代醇脫鹵酶轉(zhuǎn)化消旋體2-溴-1- (4-硝基苯基)-乙醇為消旋體2- (4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷，消旋體2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷為環(huán)氧化物水解酶的反應(yīng)底物，通過串聯(lián)反應(yīng)制備了 S-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷(如圖2)。具體步驟如下:
[0006](I)分別將具有鹵代醇脫鹵酶和環(huán)氧化物水解酶活性的菌株，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生高活性的鹵代醇脫鹵酶和環(huán)氧化物水解酶；
[0007](2)將消旋體對硝基溴代苯乙酮，硼氫化鈉溶于甲醇中，攪絆子攪動，冰浴環(huán)境下反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后加入適量水，用乙酸乙酯對反應(yīng)物進(jìn)行萃取，保留有機(jī)相。MgSO4干燥后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)得的橘色固體為消旋體2-溴-1- (4-硝基苯基)-乙醇:消旋體2- (4-硝基苯基)環(huán)氧乙燒(7:3)的混合物。
[0008](3)以N，N_ 二甲基甲酰胺為溶液溶解上述混合物，將具有鹵代醇脫鹵酶活性和環(huán)氧化物水解酶活性的濕菌體或粗酶液按一定時(shí)間順序加入此混合物溶液，反應(yīng)體系中同時(shí)含有大量的PH6.8-8.0的磷酸鹽緩沖液。在25~45°C之間進(jìn)行雙相酶促反應(yīng)，最后經(jīng)過超濾和過硅膠柱相結(jié)合的方法分離轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，得到高純度的S-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷。
[0009]上述步驟⑴中的具有鹵代醇脫鹵酶活性的菌株為E.coli BL21 /PET28a-SyHheCM,由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保藏。具有環(huán)氧化物水解酶活性的菌株為E.coliBL21 / pET28a-Eh，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保藏。
[0010]上述步驟(1)中的培養(yǎng)基采用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和/或果糖，培養(yǎng)基中總碳源質(zhì)量濃度為I~30g/L ;氮源采用牛肉膏、酵母膏、玉米漿、蛋白胨和/或豆餅水解液，培養(yǎng)基中總氮量為I~30g / L0
[0011]上述步驟(2)中消旋體對硝基溴代苯乙酮在甲醇中濃度為100g/L。硼氫化鈉在甲醇中濃度為20g / L0
[0012]上述步驟(3)所述的消旋體2-溴-1-(4-硝基苯基)_乙醇，消旋體2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷在N，N-二甲基甲酰胺中濃度為20~60g / L，雙相溶液中濃度為2~6g/L。
[0013]本發(fā)明的有 益效果:
[0014](I)本發(fā)明采用了高活性的鹵代醇脫鹵酶菌株E.coli / SyHheCM和高活性的環(huán)氧化物水解酶菌株E.coli / Eh0優(yōu)選的培養(yǎng)基可高效表達(dá)鹵代醇脫鹵酶和環(huán)氧化物水解酶，使雙酶偶聯(lián)合成S-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷有較高的催化速率和產(chǎn)率，S-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷e.e.值達(dá)98%以上。
[0015](2)本發(fā)明利用消旋體對硝基溴代苯乙酮為原料，降低了成本，每IOg消旋體對硝基溴代苯乙酮100元左右。雙酶偶聯(lián)生產(chǎn)加快了生產(chǎn)速率，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益，環(huán)保效益和社會效益。
[0016](3)本發(fā)明以化學(xué)合成法的混合產(chǎn)物為雙酶偶聯(lián)反應(yīng)的底物，同時(shí)以鹵代醇脫鹵酶反應(yīng)產(chǎn)物直接作為環(huán)氧化物水解酶的底物，省去了消旋體2-溴-1-(4-硝基苯基)-乙醇，消旋體2- (4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷的提取過程，大幅度減少酸堿消耗，方便快捷，符合綠色環(huán)保和清潔生產(chǎn)的要求，實(shí)施效果突出，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。
[0017](4)酶法合成S-2_(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷具有反應(yīng)條件溫和，酶立體選擇性強(qiáng)，催化效率高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1:化合物的化學(xué)合成
[0019]圖2:酶的生物催化過程
【具體實(shí)施方式】
[0020]以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實(shí)施例僅用于詳細(xì)說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0021]實(shí)施例1消旋體2_漠_1-(4_硝基苯基)-乙醇和2_(4_硝基苯基)環(huán)氧乙燒混合物的化學(xué)合成[0022]將5g的消旋體對硝基溴代苯乙酮，Ig的硼氫化鈉溶于50mL的甲醇中，用攪拌子攪拌，在冰浴環(huán)境中反應(yīng)3h后加入50mL水，同時(shí)再加入300mL乙酸乙酯于分液漏斗中搖勻，保留有機(jī)相，有機(jī)相經(jīng)MgSO4干燥，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干得消旋體2-溴-1-(4-硝基苯基)-乙醇:消旋體2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷(7:3)的混合物固體4g。
[0023]實(shí)施例2S-2- (4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷的酶催化的生成
[0024]將IOOmL發(fā)酵液離心得到鹵代醇脫鹵酶濕體菌1.5g加入到1000mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含有4g/L上述混合物，IOOmL 1^二甲基甲酰胺，9001^磷酸鹽緩沖液，？118.0，反應(yīng)Ih0然后加入IOOmL發(fā)酵液,離心得到的環(huán)氧化物水解酶濕菌體1.5g,反應(yīng)30min,GC氣相檢測確定反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中S-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷濃度為1.3g / L0
[0025]實(shí)施例3S-2- (4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷的分離純化
[0026]將轉(zhuǎn)化液4000rpm離心15min去除菌體，上清液中加入IOOmL乙酸乙脂搖勻后保留有機(jī)相，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得固體1.2g。固體物質(zhì)上經(jīng)硅膠柱，以乙酸乙酯:石油醚(I:7)混合液洗脫目的物質(zhì)。洗脫 液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀得純度較高的S-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷固體
1.0g0
【權(quán)利要求】
1.一種制備S-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷的方法，其特征是由以下步驟構(gòu)成: (1)分別將具有鹵代醇脫鹵酶活性和環(huán)氧化物水解酶活性的菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生高活性的鹵代醇脫鹵酶和環(huán)氧化物水解酶； (2)將消旋體對硝基溴代苯乙酮，硼氫化鈉溶于甲醇中，攪絆子攪動，冰浴環(huán)境下反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后加入適量水，用乙酸乙酯對反應(yīng)物進(jìn)行萃取，保留有機(jī)相。MgSO4干燥后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)得的橘色固體為消旋體2-溴-1- (4-硝基苯基)-乙醇:消旋體2- (4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷(7:3)的混合物。 (3)以N，N-二甲基甲酰胺為溶液溶解上述混合物，將具有鹵代醇脫鹵酶活性和環(huán)氧化物水解酶活性的濕菌體或粗酶液按一定時(shí)間順序加入此混合物溶液，反應(yīng)體系中同時(shí)含有大量的pH6.8-8.0的磷酸鹽緩沖液。在25~45°C之間進(jìn)行雙相酶促反應(yīng)，最后經(jīng)過超濾和萃取相結(jié)合的方法分離轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，得到高純度的S-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備S-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷的方法，其特征在于步驟(3)所述的消旋體2-溴-1- (4-硝基苯基)-乙醇:消旋體2- (4-硝基苯基)環(huán)氧乙燒(7:3)的混合物。在N，N- 二甲基甲酰胺中濃度為20~60g/L，雙相溶液中濃度為2~6g/L。
【文檔編號】C12P17/02GK103627776SQ201310666269
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】鄔敏辰, 馮峰, 何瑤, 譚中標(biāo), 李劍芳 申請人:江南大學(xué)