一種草酸青霉菌fh6菌株及其篩選方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種草酸青霉菌FH6菌株及其篩選方法和應(yīng)用，所述草酸青霉菌FH6菌株的保藏號(hào)為CGMCC?No.8270，該菌株酶解滸苔的應(yīng)用方法為，將凍存的FH6菌株于Martin斜面培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，然后挑取一滿環(huán)于Martin液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24-28h后取1-2mL菌液于已滅菌纖維素液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)5-7天；再將發(fā)酵液低溫離心，取上清液為粗酶液或是將發(fā)酵液過(guò)濾，取濾液為粗酶液。將粗酶液與干凈的滸苔粉于45-55℃條件下反應(yīng)。所述草酸青霉菌FH6菌株具有產(chǎn)纖維素酶的能力，能有效地將滸苔中的纖維素類物質(zhì)降解為還原糖，而且生產(chǎn)成本低，設(shè)備簡(jiǎn)單，反應(yīng)溫和，適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】一種草酸青霉菌FH6菌株及其篩選方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種草酸青霉菌FH6菌株及其篩選方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，世界石油資源供應(yīng)漸趨緊張、環(huán)境污染日益嚴(yán)重，能源問(wèn)題也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。近兩年來(lái)，各大能源消費(fèi)國(guó)競(jìng)先尋求替代石油的新能源，生物乙醇燃料以其突出的環(huán)保性和可再生性，受到許多國(guó)家的重視和積極扶持。生物乙醇作為可再生資源，可減少對(duì)石油的消耗，能直接作為液體燃料或者同汽油混合使用。
[0003]2007年開始，我國(guó)黃海海域連續(xù)7年爆發(fā)大規(guī)模滸苔，滸苔糖類成分分析結(jié)果顯示，其纖維素含量為13.3%、半纖維素含量為28.01%、淀粉含量為2.475%、水溶性多糖含量為11.503%、水溶性戊聚糖含量11.25%。纖維素是由葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵連接而成的線狀大分子物質(zhì)，是地球上最豐富的多糖物質(zhì)。1904年，在蝸牛消化液中人們首次發(fā)現(xiàn)了纖維素酶，從此，對(duì)于纖維素酶的研究日益深入。纖維素酶并不是單一酶，是一個(gè)酶系的總稱。滸苔中的纖維素是用于制取生物乙醇的主要成分，在對(duì)滸苔中的纖維素降解時(shí)，一般采用商品纖維素酶，但是，商品纖維素酶成本較高，纖維素酶解過(guò)程對(duì)環(huán)境造成污染，不適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種草酸青霉菌FH6菌株，該菌株可分泌纖維素酶，對(duì)滸苔中的纖維素類物質(zhì)有降解效果，可將纖維素有效降解為還原糖，為滸苔進(jìn)一步能源化利用奠定了基礎(chǔ)。
[0005]本發(fā)明的另一目的是提供一種草酸青霉菌FH6菌株的篩選方法。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供一種草酸青霉菌FH6菌株酶解滸苔的應(yīng)用方法。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)效果，本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
[0008]一種草酸青霉菌FH6菌株，其特征在于:保藏號(hào)為CGMCC N0.8270。
[0009]上述草酸青霉菌FH6菌株的篩選方法，其步驟包括:
[0010](I)將腐爛的滸苔藻體的懸液加入到選擇培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)2-3天；
[0011](2)將步驟(1)中的選擇培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋后的菌懸液，涂布在鑒別培養(yǎng)基上，待菌落長(zhǎng)出；
[0012](3)在長(zhǎng)出菌落的平板上用剛果紅染色法篩選有透明圈的菌株，并用平板劃線分離法分離、提純。
[0013]所述步驟(1)中，腐爛的滸苔藻體的懸液與選擇培養(yǎng)基的體積比為1:25-45 ;搖床培養(yǎng)的溫度為25-35°C，轉(zhuǎn)速為135-145r/min。
[0014]所述步驟(1)中，選擇培養(yǎng)基中的組分包括纖維素粉、硝酸鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、酵母膏、水解酪素及陳海水，各組分的加入配比依次為3-5g:lg:0.3-0.5g:1.1-1.3g:0.8~lg:0.4-0.5g:0.4-0.5g:0.4-0.5g:950_1050mL。
[0015]所述步驟(2)中，鑒別培養(yǎng)基中的組分包括羧甲基纖維素鈉、酵母膏、磷酸二氫鉀、瓊脂、土豆汁及陳海水，各組分的加入配比依次為5-10g:lg:0.1-0.3g:12-16g:90-1 IOmL:950_1050mL。
[0016]上述草酸青霉菌FH6菌株酶解滸苔的應(yīng)用方法:
[0017](a)將草酸青霉菌FH6菌株于Martin液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)22_26小時(shí)，然后在菌液中加入凍存緩沖液，于_20°C—-25°C保存；
[0018](b)將步驟(a)中的草酸青霉菌FH6菌株于Martin斜面培養(yǎng)基中斜面活化培養(yǎng)，然后挑取一滿環(huán)于Martin液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24h后取ImL菌液于已滅菌纖維素液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)5-7天；將發(fā)酵液低溫離心，取上清液為粗酶液或是將發(fā)酵液過(guò)濾，取濾液為粗酶液；
[0019](c)將干凈的滸苔干燥、粉碎，然后與步驟(b)中的粗酶液于45_55°C條件下反應(yīng)45-50小時(shí)。
[0020]所述步驟(a)中，振蕩培養(yǎng)的溫度為25-35°C，轉(zhuǎn)速為135_145r/min ;所述緩沖液是體積濃度為45-55%的甘油，緩沖液與Martin培養(yǎng)基的體積比為1:1_1.5。
[0021]所述步驟(b)中，振蕩培養(yǎng)的溫度為30-35°C，轉(zhuǎn)速為135-145r/min ;離心分離溫度為3-5°C，離心 轉(zhuǎn)速為3500-4500r/min，離心時(shí)間為10-20分鐘。
[0022]所述步驟(b)中，纖維素液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的組分包括酵母浸膏、蛋白胨、滸苔粉及陳海水，各組分的加入配比依次為Ig:3-6g:8-12g:950-1050mL。
[0023]所述步驟(c)中，將干凈的滸苔于55_65°C下干燥10-14小時(shí)，然后粉碎至70-90目；滸苔與粗酶液的加入量比為lg:45-55mL。
[0024]陳海水由上海金山區(qū)城市沙灘海域采集備用。
[0025]本發(fā)明篩選得到的菌株為草酸青霉菌Penicillium oxalicum,該菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2013年9月23日，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)為CGMCC N0.8270，其ITS序列，如下:
[0026]GAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTTTATCGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTCACGGCCGCCGGGGGGCATCCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACACAAACGAACTCTTGTCTGAAGATTGCAGTCTGAGTACTTGACTAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCTCTCGCCCCCCGCTTCCGGGGGGCGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCCCGCCGGCGAACACCATCAATCTTAACCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAA
[0027]本發(fā)明的有益效果是:1、本發(fā)明提供的草酸青霉菌FH6菌株可分泌纖維素酶，而且在應(yīng)用時(shí)，利用滸苔粉作為纖維素底物誘導(dǎo)產(chǎn)酶，直接將該菌株的液體發(fā)酵體系與滸苔纖維素作用，能有效地將滸苔中的纖維素降解為還原糖，為更進(jìn)一步地制備生物乙醇做好準(zhǔn)備。2、本發(fā)明以綠潮藻滸苔為原料，變廢為寶，而且生產(chǎn)成本低，設(shè)備簡(jiǎn)單，反應(yīng)溫和，操作簡(jiǎn)便，適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)?！揪唧w實(shí)施方式】
[0028]下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明:
[0029]陳海水:是指由上海金山區(qū)城市沙灘海域大量采集備用的海水。
[0030]實(shí)施例1
[0031]草酸青霉菌FH6菌株的篩選
[0032](I)分別采自自然條件生長(zhǎng)及綠潮海域密集漂浮的腐爛滸苔藻體，采集地為山東青島第一海水浴場(chǎng)和第六海水浴場(chǎng)。采集后用保溫箱低溫運(yùn)輸帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌篩選。
[0033]將采集到的腐爛滸苔藻體懸液lmL，加入裝有30mL選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上，30°C，140r/min震蕩培養(yǎng)2~3天，直至培養(yǎng)液變渾濁。
[0034]其中選擇培養(yǎng)基為:纖維素粉5g，
[0035]硝酸鈉Ig,
[0036]氯化鉀0.5g，
[0037]磷酸氫二鈉1.2g,
[0038]磷酸二氫鉀0.9g,
[0039]硫酸鎂 0.5g，
[0040]酵母膏0.5g，
[0041]水解酪素0.5g，
[0042]陳海水1000mL。
[0043](2)將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋:10' 10_2，10_3，10_4，10_5，10_6，將稀釋度為10_5、10_6的菌懸液各取0.2mL涂布在鑒別培養(yǎng)基上，48h后觀察菌落。
[0044]其中鑒別培養(yǎng)基為:羧甲基纖維素鈉5-10g，
[0045]酵母膏l(xiāng)g，
[0046]磷酸二氫鉀0.25g,
[0047]土豆汁 IOOmL,
[0048]瓊脂15g，
[0049]陳海水1000mL。
[0050](3)在長(zhǎng)出菌落后的鑒別培養(yǎng)基平板上滴加1%的剛果紅溶液染色，15min后倒去多余剛果紅溶液，然后加入lmol/L的氯化鈉溶液，蕩去表面剛果紅，15min后倒去溶液，觀察透明圈，測(cè)量透明圈的直徑，將透明圈較大的菌株進(jìn)行平板劃線分離得到純菌株。
[0051]實(shí)施例2
[0052]粗酶液的制取。
[0053](I)將實(shí)施例1中得到的草酸青霉菌FH6于Martin液體培養(yǎng)基中，28°C，140r/min培養(yǎng)24h，然后在菌液中添加凍存緩沖液。緩沖液的體積濃度為50%的甘油，緩沖液與菌液的加入體積比為1:1，加入凍存緩沖液，為了更好地保護(hù)草酸青霉菌FH6菌株，使得該菌株不會(huì)因?yàn)槊撍劳觥?br> [0054](2)將上述中的草酸青霉菌FH6菌株于Martin培養(yǎng)基中斜面活化培養(yǎng)，活化2代后挑取一滿環(huán)于Martin液體培養(yǎng)基中，28°C, 140r/min培養(yǎng)24h后取ImL于50mL滅菌冷卻的纖維素液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，35°C、140r/min振蕩培養(yǎng)6天。
[0055]其中液體發(fā)酵培養(yǎng)基為:[0056]酵母浸膏l(xiāng)g，
[0057]蛋白胨5g，
[0058]滸苔粉10g，
[0059]陳海水1000ml。
[0060](3)將步驟(2)中得到的液體發(fā)酵培養(yǎng)液于4°C，4000r/min離心15分鐘，取上清液作為粗酶液。
[0061]粗酶液的活性測(cè)定:
[0062]濾紙酶活(FPA)測(cè)定:將新華I號(hào)濾紙剪成I X 6cm大小卷成小卷,放進(jìn)25mL比色管內(nèi)，加入ImL檸檬酸緩沖液(pH=4.8)，再加入ImL本實(shí)施例中制得的粗酶液，搖勻使濾紙完全浸泡在溶液中，50°C準(zhǔn)確保溫Ih后立即按DNS法測(cè)還原糖，測(cè)得酶活力為13.27U/mL。
[0063]CMC酶活測(cè)定:移取ImL本實(shí)施例中所得的粗酶液于25mL比色管中，加入ImL含
0.5% CMC-Na的檸檬酸緩沖液(pH=4.4)，50°C準(zhǔn)確保溫30min后立即按DNS法測(cè)還原糖，測(cè)得酶活力為26.31U/mL。
[0064]實(shí)施例3
[0065]粗酶液的制取。
[0066]步驟(1)和步驟(2 )同實(shí)施例2。
[0067](3)將步驟(2)中得到的液體發(fā)酵培養(yǎng)液過(guò)濾，取其過(guò)濾溶液作為粗酶液。
[0068]粗酶液的活性檢測(cè):
[0069]濾紙酶活(FPA)測(cè)定:測(cè)定方法同實(shí)施例2，測(cè)得酶活力為13.42U/mL。
[0070]CMC酶活測(cè)定:測(cè)定方法同實(shí)施例2，測(cè)得酶活力為28.01U/mL。
[0071]實(shí)施例4
[0072]粗酶液對(duì)滸苔的酶解應(yīng)用。
[0073](I)以黃海海域大量暴發(fā)的綠潮藻滸苔為原料，清洗除去貝殼、沙石等雜物后，清水漂洗海藻3-4遍，放置于60°C烘箱中12h，烘干后用粉碎機(jī)粉碎I分鐘，過(guò)80目篩后備用。
[0074]( 2)將Ig干燥的滸苔粉置于三角瓶中，加入到實(shí)施例3中制得的粗酶液中，滸苔粉與粗酶液的加入配比為lg: 50mL，于50°C水浴鍋中反應(yīng)48h，然后按DNS法，測(cè)得還原糖得率為8.22%，說(shuō)明粗酶液對(duì)滸苔中的纖維素類物質(zhì)有很好地降解作用，可將纖維素降解為還原糖，為滸苔進(jìn)一步制取生物乙醇做好了準(zhǔn)備。
[0075]實(shí)施例5
[0076]粗酶液對(duì)滸苔的酶解應(yīng)用。
[0077](I)以黃海海域大量暴發(fā)的綠潮藻滸苔為原料，清洗除去貝殼、沙石等雜物后，清水漂洗海藻3-4遍，放置于60°C烘箱中12h，烘干后用粉碎機(jī)粉碎I分鐘，過(guò)80目篩后備用。
[0078]( 2)將Ig干燥的滸苔粉置于三角瓶中，加入到實(shí)施例2中制得的粗酶液中，滸苔粉與粗酶液的加入配比為lg: 50mL，于50°C水浴鍋中反應(yīng)48h，然后按DNS法，測(cè)得還原糖得率為6.39%，說(shuō)明粗酶液對(duì)滸苔中的纖維素類物質(zhì)有很好地降解作用，可將纖維素降解為還原糖，為滸苔進(jìn)一步制取生物乙醇做好了準(zhǔn)備。
【權(quán)利要求】
1.一種草酸青霉菌FH6菌株，其特征在于:保藏號(hào)為CGMCC N0.8270。
2.如權(quán)利要求1所述的草酸青霉菌FH6菌株的篩選方法，其步驟包括: (1)將腐爛的滸苔藻體的懸液加入到選擇培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)2-3天； (2)將步驟(1)中的選擇培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋后的菌懸液，涂布在鑒別培養(yǎng)基上，待菌落長(zhǎng)出； (3)在長(zhǎng)出菌落的平板上用剛果紅染色法篩選有透明圈的菌株，并用平板劃線分離法分離、提純。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的草酸青霉菌FH6菌株的篩選方法，其特征在于:所述步驟(O中，腐爛的滸苔藻體的懸液與選擇培養(yǎng)基的體積比為1:25-45 ;搖床培養(yǎng)的溫度為25-35°C，轉(zhuǎn)速為 135-145r/min。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的草酸青霉菌FH6菌株的篩選方法，其特征在于:所述步驟(O中，選擇培養(yǎng)基中的組分包括纖維素粉、硝酸鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、酵母膏、水解酪素及陳海水，各組分的加入配比依次為3-5g:lg:0.3-0.5g:1.1-1.3g:0.8~lg:0.4-0.5g:0.4-0.5g:0.4-0.5g:950_1050mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的草酸青霉菌FH6菌株的篩選方法，其特征在于:所述步驟(2)中，鑒別培養(yǎng)基中的組分包括羧甲基纖維素鈉、酵母膏、磷酸二氫鉀、瓊脂、土豆汁及陳海水，各組分的加入配比依次為 5-10g:lg:0.1-0.3g:12-16g:90-1 IOmL:950_1050mL。
6.如權(quán)利要求1所述的草酸青霉菌FH6菌株酶解滸苔的應(yīng)用方法: Ca)將草酸青霉菌FH6菌株于Martin液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)22-26小時(shí)，然后在菌液中加入凍存緩沖液，于_20°C—-25°C保存； (b)將步驟(a)中的草酸青霉菌FH6菌株于Martin斜面培養(yǎng)基中斜面活化培養(yǎng)，然后挑取一滿環(huán)于Martin液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)24_28h后取l_2mL菌液于已滅菌纖維素液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)5-7天；將發(fā)酵液低溫離心，取上清液為粗酶液或是將發(fā)酵液過(guò)濾，取濾液為粗酶液； (c)將干凈的滸苔干燥、粉碎，然后與步驟(b)中的粗酶液于45-55°C條件下反應(yīng)45-50小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草酸青霉菌FH6菌株酶解滸苔的應(yīng)用方法，其特征在于:所述步驟(a)中，振蕩培養(yǎng)的溫度為25°C -35°C，轉(zhuǎn)速為135_145r/min ;所述緩沖液是體積濃度為45-55%的甘油，緩沖液與菌液的體積比為1:1-1.5。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草酸青霉菌FH6菌株酶解滸苔的應(yīng)用方法，其特征在于:所述步驟(b)中，振蕩培養(yǎng)的溫度為30°C -35°C，轉(zhuǎn)速為135-145r/min ;離心分離溫度為3-5°C，離心轉(zhuǎn)速為3500-4500r/min，離心時(shí)間為10-20分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草酸青霉菌FH6菌株酶解滸苔的應(yīng)用方法，其特征在于:所述步驟(b)中，纖維素液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的組分包括酵母浸膏、蛋白胨、滸苔粉及陳海水，各組分的加入配比依次為Ig:3-6g:8-12g:950-1050mL。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草酸青霉菌FH6菌株酶解滸苔的應(yīng)用方法，其特征在于:所述步驟(c)中，將干凈的滸苔于55-65°C下干燥10-14小時(shí)，然后粉碎至60-100目；滸苔與粗酶液的加入量比為Ig:45-55mL。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK103740597SQ201310596624
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】費(fèi)嵐, 邵飛, 胡樂(lè)琴, 何培民, 賈睿 申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)