用于檢測男性生育力的引物、探針及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于檢測男性生育力的引物、探針及其試劑盒，所述引物由正向引物和反向引物組成，正向引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No:1，反向引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No:2所示。所述探針包括四種探針，其核苷酸序列分別如SEQ?ID?No:3、SEQ?ID?No:4、SEQ?ID?No:5、SEQ?ID?No:6所示，所述四種探針的5'端標記有四種不同的報告熒光基團，3'端標記有淬滅熒光基團。所述試劑盒包括所述引物和所述探針。本發(fā)明實現(xiàn)了β防御素126基因雙位點缺失的同時篩查，利用本發(fā)明進行檢測能更真實地反映男性體內β防御素126的表達特征，可應用于男性不育診斷領域中。
【專利說明】用于檢測男性生育力的引物、探針及其試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于檢測男性生育力的的引物、探針及其試劑盒，具體地，涉及一種通過同時檢測β防御素126基因雙位點突變以診斷男性生育力的引物、探針及其試劑盒。
【背景技術】
[0002]世界上大約10%至15%的夫婦患有不孕不育癥，無精子或者精子密度、活力和形態(tài)畸形等只能解釋其中部分案例。最新研究發(fā)現(xiàn)，精子包膜缺陷是導致男性不育的新原因；而精子包膜缺陷是β防御素126基因突變造成的。防御素在動植物界中廣泛存在，根據其所含三對二硫鍵連接方式的不同，分為α，β和Θ防御素。β防御素是一類具有廣譜抗菌性質的帶陽離子的小分子多肽。在哺乳動物中，大部分β防御素基因主要在雄性生殖道中表達，是一類富含精氨酸的陽離子多肽，具有廣譜的抗微生物活性。附睪β防御素家族蛋白不僅在宿主生殖道防御方面起作用，而且在雄性生育中亦發(fā)揮重要作用，β防御素126表達異?；蛉笔П磉_會導致人精子穿過透明質酸的能力降低，進而使男性的自然生育能力降低。
[0003]β防御素126存在多個移碼突變位點，其中一個位點(rsl 1468374，chr20:126314-126315，如圖1和圖3所示)的移碼突變已被證明與男性生育力降低相關，但我們發(fā)現(xiàn)該位點并不能真實全面地反映體內β防御素126 (DEFB126)的表達異常情況。
[0004]通過PCR擴增產物測序、實時熒光定量PCR等技術方法，我們發(fā)現(xiàn)DEFB126還存在另一個位點的移碼突變(rsll467497，chr20:126160-126163，如圖1和圖2所示)，該位點移碼突變與男性不育亦呈現(xiàn)高度相關性。統(tǒng)計結果表明rsl 1467497和rsl 1468374也高度相關。
[0005]研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測2個SNP位點能更有效檢測不明原因的男性不育問題，建立在此基礎上的分子檢測，能及時提醒醫(yī)療機構及時調整治療方案、減輕病患的經濟負擔；在建立人類精子庫時有利于發(fā)現(xiàn)潛在不合格的標本；對準備進行IVF實驗的患者而言可以做出前瞻性的風險評估；而對該基因的了解亦會幫助了解后代發(fā)生不孕不育的風險，從而對子代遺傳有指導意義。
[0006]在現(xiàn)有技術中檢測β防御素126基因突變時，只是針對一個位點的缺失，而且檢測試劑和方法只適用于常規(guī)PCR，目前國內外還沒有通過熒光探針對β防御素126基因rsll467497和rsll468374兩個突變位點同時進行檢測以診斷男性生育力的文獻報道。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術存在的缺陷而提供一種通過同時檢測β防御素126基因雙位點突變以診斷男性生育力的引物、探針及其試劑盒，本發(fā)明實現(xiàn)了 β防御素126基因雙位點缺失的同時篩查，利用本發(fā)明進行檢測能更真實地反映男性體內β防御素126的表達特征，進而實現(xiàn)男性生育力的診斷。[0008]本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn):
[0009]—種檢測男性生育力的引物，由正向引物和反向引物組成，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No: 1，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。
[0010]一種與所述引物配合使用的探針，所述探針包括四種探針，其核苷酸序列分別如SEQ ID No:3,SEQ ID No:4,SEQ ID No:5,SEQ ID No:6 所示，所述四種探針的 5’ 端標記有四種不同的報告熒光基團，3’端標記有淬滅熒光基團。
[0011]優(yōu)選的，所述四種探針的報告熒光基團分別為TAMRA、ROX、FAM、VIC。
[0012]優(yōu)選的，SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示探針的淬滅熒光基團為BHQ2 ;SEQ IDNo:5和SEQ ID No:6所示探針的淬滅熒光基團為BHQl。
[0013]一種檢測男性生育力的試劑盒，含有所述正向引物和反向引物。優(yōu)選的，所述試劑盒還包括所述的探針。更優(yōu)選的，所述試劑盒還包括以下試劑:2XMaster Mix。最優(yōu)選的，所述試劑盒還包括以下試劑:裂解吸附液、洗滌液、洗脫液和氧化硅磁珠懸浮液，所述裂解吸附液含有 3.6mol/L GuHCl 和 10mmol/L Tris-HCl ;所述洗滌液含有 800mmol/L LiCl 和IOOmmoI/L NaCl ;所述洗脫液含有 10mmol/L Tris-HCl。
[0014]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:
[0015]rsll467497位點與男性不育高度相關，是β防御素126基因缺失常見形式之一，rsl 1467497與rsl 1468374在各分組人群中高度相關，二者單獨或共同作用導致精子包膜缺失，進而導致男性不孕不育；利用本發(fā)明提供的試劑盒能夠通過探針法熒光定量PCR實現(xiàn)rsll467497和rsll468374雙缺失位點的篩查，能更真實地反映男性體內β防御素126的表達特征。通過利用本發(fā)明進行分子檢測，對疾患而言能及時提醒醫(yī)療機構調整治療方案，減輕病患的經濟負擔；對建立人類精子庫也能發(fā)現(xiàn)潛在不合格的標本；對準備進行IVF實驗的患者而言可以做出前瞻性的風險評估；而對β防御素126基因的了解亦會幫助了解后代發(fā)生不孕不育的風險，從而對子代遺傳有指導意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯:
[0017]圖1為β防御素126基因的結構示意圖。
[0018]圖2為β防御素126基因rsll467497位點(chr20:126160-126163)的突變位置
示意圖。
[0019]圖3為β防御素126基因rsll468374位點(chr20:126314-126315)的突變位置示意圖。
【具體實施方式】
[0020]下面結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0021]實施例1、β防御素126DNA模板的制備[0022]在制備β防御素126模板DNA分子時，采用以下步驟完成:
[0023]步驟(I)在2313個標本數(shù)中，各取100μ L抗凝血、750μ L裂解吸附液(3.6mol/LGuHCl, IOmmoI/L Tris-HCl)和適量(2_5 μ L)氧化硅磁珠懸浮液到1.5mL離心管中，漩渦振蕩混勻后室溫靜置5分鐘；
[0024]步驟(2)置磁力架上分離固液相，棄廢液；
[0025]步驟(3)加入900 μ L 洗滌液(800mmol/L LiCl，IOOmmoI/L NaCl)，漩渦振蕩混勻后置磁力架上分離固液相，棄廢液；
[0026]步驟(4)加入900μ L70%乙醇洗滌，漩渦振蕩混勻后置磁力架上分離固液相，棄廢液；
[0027]步驟(5)重復步驟(4)；
[0028]步驟(6)加入20 μ L洗脫液(10mmol/L Tris-HCl)，65°C放置5分鐘后置磁力架上分離固液相；
[0029]步驟(7)吸取液相到新的離心管中待用。
[0030]實施例2、探針法熒光定量PCR檢測不同β防御素126基因型
[0031]將實施例1獲得的DNA模板分子分別進行探針法熒光定量PCR擴增。探針法熒光定量PCR擴增的引物和探針序列如下表1所示(其中，2W代表rsll468374位點的野生型，2D代表rsl 1468374位點的突變型；4W代表rsl 1467497位點的野生型，4D代表rsl 1467497位點的突變型)，PCR反應體系如表2所示，PCR擴增條件如表3所示，不同熒光探針與基因型的對應關系如表4所不。
[0032]根據每個樣本的擴增曲線可確定其基因型,在2313各檢測標本中，根據4種熒光曲線的變化趨勢，分別有 4 ffff-2ffff，4WW-2DD, 4WW-2WD, 4WD-2WW, 4WD-2DD，4WD-2WD，4DD-2WW,4DD-2DD,4DD-2WD 累計 9 種情形。
[0033]β防御素126不同基因型的熒光定量PCR檢測結果如表5所示，已檢測樣本的統(tǒng)計結果如表6所示，rsll468374位點在不同中國人群中分布如表7所示，rsll467497位點在不同中國人群中的分布如表8所示，rsll468374位點和rsll467497位點相關性研究如表9所示。
[0034]在β防御素126的不同基因型中，4W-2W表達的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID Νο:7所示；4W-2D表達的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:8所示；4D_2D表達的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:9所示；4D-2W表達的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No: 10所示。
[0035]表1
[0036]
【權利要求】
1.一種檢測男性生育力的引物，其特征在于:由正向引物和反向引物組成，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No: 1，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。
2.一種與權利要求1所述引物配合使用的探針，其特征在于:所述探針包括四種探針，其核苷酸序列分別如SEQ ID No: 3, SEQ ID No:4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No:6所示，所述四種探針的5’端標記有四種不同的報告熒光基團，3’端標記有淬滅熒光基團。
3.根據權利要求2所述的探針，其特征在于:所述四種探針的報告熒光基團分別為TAMRA、麗、FAM、VIC。
4.根據權利要求2所述的探針，其特征在于:SEQID No:3和SEQ ID No:4所示探針的淬滅熒光基團為BHQ2 ；SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示探針的淬滅熒光基團為BHQl。
5.一種檢測男性生育力的試劑盒，其特征在于:含有權利要求1所述正向引物和反向引物。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于:還包括權利要求2、3或4所述的探針。
7.根據權利要求6所述的試劑盒,其特征在于:還包括以下試劑:2XMasterMix。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于:還包括以下試劑:裂解吸附液、洗滌液、洗脫液和氧化硅磁珠懸浮液，所述裂解吸附液含有3.6mol/L GuHCl和lOmmol/LTris-HCl ;所述洗滌液含 有800mmol/L LiCl和100mmol/L NaCl ;所述洗脫液含有IOmmol/L Tris-HCl0
【文檔編號】C12Q1/68GK103468807SQ201310415474
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權日:2013年9月12日
【發(fā)明者】施長根, 施惠娟, 王榮芳, 段世偉, 吳峻, 袁瑤, 吳斌 申請人:上?；輰毶锟萍加邢薰?br>