熒光定量PCR檢測(cè)巨細(xì)胞病毒gH基因分型試劑盒及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供的一種熒光定量PCR檢測(cè)巨細(xì)胞病毒gH分型的試劑盒，由定量PCR反應(yīng)液管、gH1型標(biāo)準(zhǔn)品管、gH2型標(biāo)準(zhǔn)品管、陽(yáng)性對(duì)照品管、陰性對(duì)照品管、病毒DNA抽提裂解液管、操作說(shuō)明書(shū)、盒體組成，盒體設(shè)有容器孔，PCR反應(yīng)液由單管分裝，矩陣排列。本發(fā)明運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，采用雙特異熒光探針，實(shí)現(xiàn)了巨細(xì)胞病毒gH基因分型的快速鑒定，有效地解決了以往巢式PCR加限制性內(nèi)切酶分析（RFLP）鑒定巨細(xì)胞病毒gH基因型方法繁瑣的問(wèn)題。為臨床上巨細(xì)胞病毒gH基因型的分型提供了簡(jiǎn)便可靠的檢測(cè)手段及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【專利說(shuō)明】熒光定量PCR檢測(cè)巨細(xì)胞病毒gH基因分型試劑盒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及定量PCR檢測(cè)試劑盒，具體涉及利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)巨細(xì)胞病毒的包膜糖蛋白H基因(glycoprotein H, gH)分型的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)感染在免疫功能低下人群尤其是幼兒、AIDS病人以及器官移植受者中可引起嚴(yán)重疾病，甚至導(dǎo)致患者死亡。HCMV gH基因來(lái)自O(shè)RF UL75, gH糖蛋白為由742-743個(gè)氨基酸組成的單鏈結(jié)構(gòu)，攜帶N-糖基，分子量86 KD。gH糖蛋白可以和gL蛋白、g0蛋白形成gcIII復(fù)合體,gcIII復(fù)合體進(jìn)一步表達(dá)于受感染的細(xì)胞膜表面。gH糖蛋白表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗原性，也是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要靶位點(diǎn)。1992年chou等最先提出了 HCMV gH基因N末端存在核苷酸序列差異，分析這些位點(diǎn)可將HCMV臨床分離株分為2個(gè)基因型(gHl和gH2)。同時(shí)，其通過(guò)序列比對(duì)提出了鑒別兩個(gè)基因型的方法:利用巢式PCR法經(jīng)兩步PCR擴(kuò)增出gH基因兩個(gè)分型的不同區(qū)域(288bp)，之后利用I進(jìn)行酶切分析，可以被通<3 I切開(kāi)的為gHl型，不可以被Hha I切開(kāi)的為gH2型。此方法用于鑒別HCMV gH基因分型一直被沿用至今。之后多個(gè)研究表明gHl分型與gH2分型的巨細(xì)胞病毒引起的疾病種類及某些疾病臨床的嚴(yán)重程度有差異，可見(jiàn)巨細(xì)胞病毒的gH分型對(duì)臨床疾病的診治具有重要的指導(dǎo)意義。但此前的鑒別方法須經(jīng)兩步PCR擴(kuò)增才能得到足夠的產(chǎn)物，之后對(duì)此產(chǎn)物還需進(jìn)行純化回收(液體回收或凝膠電泳后割膠回收)，回收后的產(chǎn)物還需利用I進(jìn)行酶切反應(yīng)，酶切反應(yīng)后的產(chǎn)物須凝膠電泳后進(jìn)行相關(guān)DNA條帶的分析才能最終確定HCMV的具體gH基因的分型。此方法耗時(shí)耗力，且耗費(fèi)成本，所以巨細(xì)胞病毒的gH分型僅停留在實(shí)驗(yàn)室的科研中，無(wú)法應(yīng)用于臨床常規(guī)檢測(cè)。這就迫使我們尋找更簡(jiǎn)便快捷，且特異敏感的方法去滿足臨床檢測(cè)和鑒定HCMVgH基因分型的需求，為臨床巨細(xì)胞病毒感染的診治提供技術(shù)手段。
[0003]近幾年興起的熒光PCR技術(shù)具有準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好等特點(diǎn)，已廣泛用于基因表達(dá)研究、病原體檢測(cè)及基因分型等醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中。該方法完全閉管檢測(cè)，避免了交叉污染，且結(jié)果判斷由計(jì)算機(jī)完成，簡(jiǎn)化了操作步驟，加強(qiáng)了結(jié)果的可靠性。多種Taqman熒光探針的應(yīng)用及熒光定量PCR儀的發(fā)展，使利用多通道熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)巨細(xì)胞病毒gH分型的檢測(cè)及鑒別成為可能。
[0004]本發(fā)明運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，采用巨細(xì)胞病毒通用引物和gH分型的特異熒光探針，開(kāi)發(fā)研制用于巨細(xì)胞病毒gH基因快速分型的試劑盒。并通過(guò)對(duì)臨床上的巨細(xì)胞病毒感染患兒的尿液標(biāo)本，咽拭子標(biāo)本，痰液標(biāo)本等標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)分型，旨在為臨床上的巨細(xì)胞病毒進(jìn)行快速準(zhǔn)確的gH基因型分型的鑒定，同時(shí)為臨床上不同gH型別的巨細(xì)胞病毒感染和疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)手段及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)巨細(xì)胞病毒gH基因分型試劑盒，是一種雙探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)巨細(xì)胞病毒gH基因分型試劑盒，由定量PCR反應(yīng)液、gHl型標(biāo)準(zhǔn)品、gH2型標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品、病毒DNA抽提裂解液、操作說(shuō)明書(shū)、盒體組成，盒體設(shè)有容器孔，分別放置PCR反應(yīng)液管、gHl型標(biāo)準(zhǔn)品管、gH2型標(biāo)準(zhǔn)品管、陽(yáng)性對(duì)照品管、陰性對(duì)照品管、病毒DNA抽提裂解液管，定量PCR反應(yīng)液管裝有PCR緩沖液、MgcI2、dNTPs、巨細(xì)胞病毒gH基因通用上游引物，巨細(xì)胞病毒gH基因通用下游游引物、熒光探針、Taq DNA聚合酶。其中:
上游引物序列為:5’ -TGTTTTCACGCAGGAAGCGG-3’，
下游引物序列為:5’ -TGGATCACGCCGCTGAACC-3’，
gHl 型探針為:5’ -FAM-CATCCGAAGCGCTGGACCCTCACG-BHQ1-3’，
gH2 型探針為:5’ -HEX-TATCCGAACCGCTGGACAAAGCG-BHQ1-3’。
[0006]gHl型標(biāo)準(zhǔn)品序列為: tgttttcacgcaggaagcggatgggtctcccgtaggtgttgagtagtaggtgaaatgcgtgagggtccagcg
cttcggatgcggcgtccgcgccatatcgttgcgaaggtaggtgactgaggaggtagacggtgaagacagtgaggtag
ggggggaggccgggccgcatagcgcggctgcgccgctgggttcagcggcgtgatccao
[0007]gH2型標(biāo)準(zhǔn)品序列為: tgttttcacgcaggaagcggatgggtctcccgtaggtgttgagcagtaggtgaaacgctttgtccagcggtt
cggatatggcttctgcgccatatcgtgacgaaagtaggtggctgaggagacagacggcgaggacgatgaggtaggaggggaggcctggccgcatagcgcggccgcgccgctgggttcagcggcgtgatcca0
[0008]病毒DNA 抽提裂解液管裝有 10mmol/L Tr1-HCL, pH 7.6 5mmol/LEDTA, 0.5%SDS。
[0009]陽(yáng)性對(duì)照品管裝有巨細(xì)胞病毒AD169株和TOWNE株的滅活DNA樣品，陰性對(duì)照品管裝無(wú)菌注射用水。
[0010]本發(fā)明提供的定量試劑盒保存在-20°C，盡量減少反復(fù)凍融。
[0011]本發(fā)明試劑盒是將Taqman探針引入到HCMV的gH基因分型中，在gH基因兩端的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，在gH基因的分型位置設(shè)計(jì)兩種探針，一種探針識(shí)別gHl分型的序列，另一種探針識(shí)別gH2分型。在一個(gè)反應(yīng)管中，利用熒光定量PCR技術(shù)快速鑒定HCMV的gH基因分型。通過(guò)對(duì)gHl型標(biāo)準(zhǔn)株AD169，gH2型標(biāo)準(zhǔn)株TOWNE及中國(guó)地區(qū)HCMV臨床株的gH基因的序列進(jìn)行分析，我們?cè)趃Hl型和gH2型共同的兩端保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)了一對(duì)PCR的引物序列為:F 5’-TGTTTTCACGCAGGAAGCGG-3’，R 5’-TGGATCACGCCGCTGAACC-3’。在 gHl 型標(biāo)準(zhǔn)株及臨床株的保守區(qū)而與gH2型不同的區(qū)域設(shè)計(jì)探針用于識(shí)別gHl型基因型的巨細(xì)胞病毒，其序列為5’ -CATCCGAAGCGCTGGACCCTCACG-3’，其5’端用熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記，3’端用猝滅基團(tuán)BHQl標(biāo)記。在gH2型標(biāo)準(zhǔn)株及臨床株的保守區(qū)而與gHl型不同的區(qū)域設(shè)計(jì)探針用于識(shí)別gH2型基因型的巨細(xì)胞病毒，其序列為5’ -TATCCGAACCGCTGGACAAAGCG-3’，其5’端用熒光基團(tuán)HEX標(biāo)記，3’端用猝滅基團(tuán)BHQl標(biāo)記。
[0012]本發(fā)明試劑盒使用方法:
每次檢測(cè)均應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)品用無(wú)菌去離子水稀釋為IXIO2-1X IO9拷貝/ml。
[0013](I)HCMV病毒DNA提取:取巨細(xì)胞病毒感染兒童的尿液ImL于EP管中，12000r/min離心5min，棄去上清，加入40 μ L病毒DNA抽提裂解液，置于100°C煮沸l(wèi)Omin，12000r/min離心5min，取5μ I上清作為PCR模板。血清，腦脊液標(biāo)本方法同上。[0014](2)擴(kuò)增檢測(cè):在雙色或以上的熒光定量PCR儀上進(jìn)行，PCR體系共50 μ L，其中PCR定量反應(yīng)液45 μ L，檢測(cè)樣品(提取產(chǎn)物，標(biāo)準(zhǔn)品，陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照)5 μ L。具體反應(yīng)程序?yàn)?4°C 2min;循環(huán)中94°C 15s，60°C 45s，循環(huán)中的最后一步分別采集FAM通道熒光和VIC通道熒光，共循環(huán)40次。
[0015](3)熒光定量結(jié)果分析:
a.雙探針CT值均等于40，則為HCMV陰性標(biāo)本；
b.gHl探針或gH2探針其中之一 CT ( 35，判定為相應(yīng)的gH分型；
c.gHl探針和gH2探針CT值均< 35，則判定為混合分型；
d.CT值在35和40之間的，重做之后大于37的為陰性。
[0016]根據(jù)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各待測(cè)樣本的HCMV的滴度(拷貝數(shù)/ml)。
[0017]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供的雙探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)巨細(xì)胞病毒gH基因分型試劑盒在鑒別巨細(xì)胞病毒gH基因分型中的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，采用HCMV通用引物和gHl型和gH2型雙特異熒光探針，開(kāi)發(fā)研制出用于巨細(xì)胞病毒gH基因型分型的檢測(cè)試劑盒。該發(fā)明利用熒光定量PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)了 gH基因型分型的特異探針，比傳統(tǒng)的巢式PCR結(jié)合酶切鑒定的方法更加簡(jiǎn)便，快速和準(zhǔn)確。為臨床上巨細(xì)胞病毒gH分型的鑒定提供可靠的實(shí)驗(yàn)手段。 【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1是試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖。
[0020]圖2是標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果圖。
[0021]圖3是標(biāo)本分型后產(chǎn)物的測(cè)序圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]本發(fā)明結(jié)合附圖和具體實(shí)施例做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)該理解，實(shí)施例僅用于說(shuō)明目的，而不用于限制該發(fā)明的范圍。
[0023]實(shí)施例1
參見(jiàn)圖1，一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)巨細(xì)胞病毒gH基因分型試劑盒，由定量PCR反應(yīng)液管1、gHl型標(biāo)準(zhǔn)品管2、gH2型標(biāo)準(zhǔn)品管3、陽(yáng)性對(duì)照品管4、陰性對(duì)照品管5、病毒DNA抽提裂解液管6、操作說(shuō)明書(shū)7、盒體8組成，盒體8設(shè)有容器孔，分別放置PCR反應(yīng)液管1、gHl型標(biāo)準(zhǔn)品管2、gH2型標(biāo)準(zhǔn)品管3、陽(yáng)性對(duì)照品管4、陰性對(duì)照品管5、病毒DNA抽提裂解液管6，PCR反應(yīng)液由單管分裝，矩陣排列，其中定量PCR反應(yīng)液管I裝有PCR緩沖液、MgcI2、dNTPs、巨細(xì)胞病毒gH基因通用上游引物、巨細(xì)胞病毒gH基因通用下游游引物、熒光探針、Taq DNA聚合酶。其中:
上游引物序列為:5’ -TGTTTTCACGCAGGAAGCGG-3’，
下游引物序列為:5’ -TGGATCACGCCGCTGAACC-3’，
gHl 型探針為:5’ -FAM-CATCCGAAGCGCTGGACCCTCACG-BHQ1-3’，
gH2 型探針為:5’ -HEX-TATCCGAACCGCTGGACAAAGCG-BHQ1-3’。
[0024]gHl型標(biāo)準(zhǔn)品序列為:
tgttttcacgcaggaagcggatgggtctcccgtaggtgttgagtagtaggtgaaatgcgtgagggtccagcgcttcggatgcggcgtccgcgccatatcgttgcgaaggtaggtgactgaggaggtagacggtgaagacagtgaggtag
ggggggaggccgggccgcatagcgcggctgcgccgctgggttcagcggcgtgatccao
[0025]gH2型標(biāo)準(zhǔn)品序列為： tgttttcacgcaggaagcggatgggtctcccgtaggtgttgagcagtaggtgaaacgctttgtccagcggtt
cggatatggcttctgcgccatatcgtgacgaaagtaggtggctgaggagacagacggcgaggacgatgaggtaggaggggaggcctggccgcatagcgcggccgcgccgctgggttcagcggcgtgatcca0
[0026]病毒DNA抽提裂解液管6 裝有 10mmol/L Tri-HCL, pH 7. 6 5mmol/LEDTA, O. 5%SDS。
[0027]陽(yáng)性對(duì)照品管4裝巨細(xì)胞病毒AD169株和TOWNE株的滅活DNA樣品，陰性對(duì)照品管5裝為無(wú)菌注射用水。本發(fā)明提供的定量試劑保存在_20°C，盡量減少反復(fù)凍融。
[0028]實(shí)施例2 雙探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)gHl型標(biāo)準(zhǔn)株AD169和gH2型標(biāo)準(zhǔn)株TOffNE
一.材料：標(biāo)準(zhǔn)株AD169(gHl)及T0WNE(gH2)均為本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0029]二.引物和探針的設(shè)計(jì)與合成
從Genbank中調(diào)取AD169及TOWNE株的gH的基因序列，應(yīng)用MegAlign軟件分析其基因序列，在兩gH分型病毒的保守區(qū)設(shè)計(jì)上下游引物，在兩種病毒的不同區(qū)域(分型區(qū)）設(shè)計(jì)特異性的探針。
[0030]上游引物序列為：5’-TGTTTTCACGCAGGAAGCGG-3’
下游引物序列為：5’ -TGGATCACGCCGCTGAACC-3’
gHl 型探針為：5’ -FAM-CATCCGAAGCGCTGGACCCTCACG-BHQ1-3’ gH2 型探針為：5’ -HEX-TATCCGAACCGCTGGACAAAGCG-BHQ1-3’
引物及探針均有大連寶生物技術(shù)公司合成。
[0031]三標(biāo)準(zhǔn)株DNA的抽提
取標(biāo)準(zhǔn)株病毒上清液ImL于EP管中，12000r/min離心5min，棄去上清，加入40 μ L病毒DNA抽提裂解液置于100°C煮沸l(wèi)Omin，12000r/min離心5min，取5 μ L上清作為PCR模板。
[0032]四標(biāo)準(zhǔn)株的實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)
對(duì)上述兩種標(biāo)準(zhǔn)株AD169及TOWNE進(jìn)行單管gH分型的熒光PCR檢測(cè)，結(jié)果表明AD169株gHl型探針為陽(yáng)性，gH2型探針為陰性。TOWNE株gH2型探針為陽(yáng)性，gHl型探針為陰性。我們?cè)O(shè)計(jì)的分型探針無(wú)任何交叉信號(hào)出現(xiàn)，具有很高的特異性。具體CT值參見(jiàn)表1。
表1巨細(xì)胞病毒標(biāo)準(zhǔn)株的熒光定量PCR的激分型結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種熒光定量PCR檢測(cè)巨細(xì)胞病毒gH基因分型試劑盒，其特征在于，由定量PCR反應(yīng)液管(I)、gHl型標(biāo)準(zhǔn)品管(2)、gH2型標(biāo)準(zhǔn)品管(3)、陽(yáng)性對(duì)照品管(4)、陰性對(duì)照品管(5)、病毒DNA抽提裂解液管(6)、操作說(shuō)明書(shū)(7)、盒體組成(8)組成，盒體⑶設(shè)有容器孔，分別放置PCR反應(yīng)液管(I )、gHl型標(biāo)準(zhǔn)品管(2 )、gH2型標(biāo)準(zhǔn)品管(3 )、陽(yáng)性對(duì)照品管(4 )、陰性對(duì)照品管(5)、病毒DNA抽提裂解液管(6)，定量PCR反應(yīng)液管(I)由單管分裝，矩陣排列，定量PCR反應(yīng)液管(I)裝有PCR緩沖液，Mgcl2, dNTPs，巨細(xì)胞病毒gH基因通用上游引物，巨細(xì)胞病毒gH基因通用下游引物，熒光探針，Taq DNA聚合酶；其中: 上游引物序列為:5’ -TGTTTTCACGCAGGAAGCGG-3’， 下游引物序列為:5’ -TGGATCACGCCGCTGAACC-3’， gHl 型探針為:5’ -FAM-CATCCGAAGCGCTGGACCCTCACG-BHQ1-3’， gH2 型探針為:5’ -HEX-TATCCGAACCGCTGGACAAAGCG-BHQ1-3’ ； gHl型標(biāo)準(zhǔn)品序列為:
tgttttcacgcaggaagcggatgggtctcccgtaggtgttgagtagtaggtgaaatgcgtgagggtccagcgcttcggatgcggcgtccgcgccatatcgttgcgaaggtaggtgactgaggaggtagacggtgaagacagtgaggtagggggggaggccgggccgcatagcgcggctgcgccgctgggttcagcggcgtgatcca ；gH2型標(biāo)準(zhǔn)品序列為:
tgttttcacgcaggaagcggatgggtctcccgtaggtgttgagcagtaggtgaaacgctttgtccagcggttcggatatggcttctgcgccatatcgtgacgaaagtaggtggctgaggagacagacggcgaggacgatgaggtaggaggggaggcctggccgcatagcgcggccgcgccgctgggttcagcggcgtgatcca ； 病毒 DNA 抽提裂解液管(6)裝有 10mmol/L Tr1-HCL, pH 7.6 5mmol/LEDTA, 0.5%SDS。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光定量PCR檢測(cè)巨細(xì)胞病毒gH基因分型試劑盒，其特征在于，陽(yáng)性對(duì)照品管(4)裝有巨細(xì)胞病毒AD169株和TOWNE株的滅活DNA樣品，陰性對(duì)照品管(5)裝有無(wú)菌注射用水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種熒光定量PCR檢測(cè)巨細(xì)胞病毒gH基因分型試劑盒，其特征在于，試劑盒保存在-20°C，避免反復(fù)凍融。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)巨細(xì)胞病毒gH基因分型試劑盒在鑒別巨細(xì)胞病毒gH基因分型中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12M1/00GK103540685SQ201310414995
【公開(kāi)日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月11日
【發(fā)明者】李偉, 尚世強(qiáng), 舒強(qiáng), 陶然, 樓金吐, 李華美, 董敖, 彭朝陽(yáng), 周明明 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)