Tradd基因過表達慢病毒在抑制皮膚疤痕形成中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了TRADD基因過表達慢病毒在抑制皮膚疤痕形成或治療皮膚疤痕中的應用，并具體公開了TRADD基因過表達慢病毒的制備方法。本發(fā)明的TRADD基因過表達慢病毒能同時改善皮膚疤痕的平整度和色澤均勻度。
【專利說明】TRADD基因過表達慢病毒在抑制皮膚疤痕形成中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制藥領域，具體而言涉及TRADD基因過表達慢病毒在抑制皮膚疤痕形成中的應用。
【背景技術】
[0002]人TRADD基因含有4個外顯子，外顯子總長度為939bp，可編碼大小為34KD信號蛋白——腫瘤壞死因子受體相關死亡域蛋白(tumor necrosis factor receptor associateddeath domain protein，TRADD)，該蛋白可通過腫瘤壞死因子-a (tumor necrosis factoralpha, TNF- a )介導的信號通路調控細胞的增殖與凋亡。TNF- a與TNFRl結合后，TNFRl胞內段的死亡結構域(death domain, DD)即可與TRADD蛋白結合,產生2種不同的誘導調節(jié)機制(I)TRADD與FADD，caspase-8結合，再激活caspase-3，誘導細胞凋亡；(2) TRADD結合TRAF (TNF recepto r associated factors)或招募 RIP (receptor interacting protein),激活NF-K B，活化的NF-K B可抑制細胞凋亡和促進炎癥反應。有學者研究和我們的研究證實TRADD蛋白在HSFb中的表達量明顯降低，抑制了其在TNF-a / TNFRl信號通路中介導的細胞凋亡作用，導致HSFb的過度增殖。
[0003]目前皮膚斑痕的治療有手術療法和非手術療法兩大類。手術切除是臨床治療皮膚斑痕的常用方法，軟組織擴張術、皮片、皮瓣等修復技術的應用，明顯改善了病損部位的外觀和功能，但復發(fā)率較高，很可能因術后創(chuàng)傷愈合失控而導致病理性瘢痕再次形成。非手術療法包括加壓療法、局部藥物注射、激光療法、冷凍治療等，任何非手術療法，均直接或間接作用于抑制成纖維細胞增殖和調節(jié)膠原代謝這一重要環(huán)節(jié)，方法雖多，效果卻不盡如人意。加壓療法由于治療療程較長，患者不易堅持；皮質類固醇激素僅適用于小面積的病理性瘢痕；激光治療的局限性主要是其穿透性不足，治療的深度不夠；冷凍治療的限制因素是疼痛、延遲愈合及感染。
[0004]瘢痕一旦產生就無法完全消除，因此預防HS的形成尤為重要，只有通過尋找瘢痕基因缺陷并從基因水平加以修正，從源頭上抑制成纖維細胞增殖及膠原蛋白合成，避免或減輕HS的發(fā)生發(fā)展，才是預防HS的核心問題。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明要解決的問題是提供一種抑制皮膚疤痕形成中的TRADD基因過表達慢病毒，為了實現本發(fā)明的目的，擬采用如下技術方案:
[0006]為解決上述技術問題，本發(fā)明提出的方案為一種抑制皮膚疤痕形成中的TRADD基因過表達慢病毒，該TRADD基因過表達慢病毒通過如下方法制備得到:
[0007]1.TRADD基因過表達慢病毒在抑制皮膚疤痕形成或治療皮膚疤痕中的應用，其特征在于所述的TRADD基因過表達慢病毒通過如下方法制備而成:
[0008](I) TRADD基因為模板，采用PCR法擴增目的片段，擴增引物序列為:
[0009]TRADD-F:5，-CTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGGCAGCTGGGCAA AATG-3，；[0010]TRADD-R:5’ -CCATGGTGGCGAATTCGGCCAGGCCGCCATTGG-3’ ；
[0011]PCR產物回收純化后與EcoR I酶切線性化的表達載體pLVX-EGFP-3FLAG_Puro進行重組連接，37°C孵育15min，再50°C孵育15min，立即轉化DH5a感受態(tài)細胞，最后將已轉化的感受態(tài)細胞轉移至含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)16h ；
[0012](2)接種陽性克隆，保種并分裝100 μ I進行測序，測序驗證無誤后，接種抽提質粒;
[0013](3)選擇生長狀態(tài)良好的293FT細胞進行包裝:取慢病毒表達載體pLVX-TRADD-EGFP-3FLAG-Puro3 μ 1、virapower packing mix9 μ I 輕柔混合于 1.5ml 無血清 Opt1-MEM I 中，形成溶液 A ;將 36 μ lLipofectamine2000 與 1.5ml 無血清 Opt1-MEMI混合形成溶液B,并室溫孵育5min ;再將溶液A和B混合，室溫孵育20min,形成DNA-Lipofectamine 2000復合物，直接轉染293FT細胞，轉染48h后，收集病毒液。
[0014]本發(fā)明另一方面還涉及上述TRADD基因過表達慢病毒及其改善皮膚疤痕的平整度和/或色澤均勻度中的應用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1TRADD基因PCR擴增電泳結果，其中:M:標準；1 =TRADD ；
[0016]圖2 重組質粒菌落 PCR 鑒定，其中 1:ddH20 ；2:pLVX-EGFP-3FLAG_Puro ；M:標準；3-10:pLVX-TRADD-EGFP-3FLAG-Puro ；
[0017]圖3慢病毒感染293FT細胞48h后綠色熒光蛋白的表達(X 100)，其中a:熒光顯微鏡觀察；b:光鏡觀察；
[0018]圖4EFb、HSFb中TRADD蛋白表達情況，其中a:EFb中TRADD蛋白表達；b:HSFb中TRADD蛋白表達；
[0019]圖5HSFb和EFb中TRADD蛋白表達水平的變化，HSFb組和EFb組比較，aP < 0.05 ；
[0020]圖6Western blot檢測慢病毒轉染EFb后融合蛋白的表達，其中1:EFb ；2:轉染pLVX-TRADD-EGFP-3FLAG-Puro 的 EFb.；
[0021]圖7Western blot檢測慢病毒轉染HSFb后融合蛋白的表達，其中1:HSFb ；2:轉染pLVX-TRADD-EGFP-3FLAG-Puro 的 HSFb ；
[0022]圖8TRADD慢病毒、TNF- α對EFb增殖的影響；
[0023]圖9TRADD慢病毒、TNF- α對HSFb增殖的影響；
[0024]圖10TRADD慢病毒、TNF-α對EFb細胞周期和凋亡的影響，其中a:空白組；b:空白組+TNF- a ；c:實驗組；d:實驗組+TNF- α ；
[0025]圖1ITRADD慢病毒、TNF-α對HSFb細胞周期和凋亡的影響，其中a:空白組；b:空白組+TNF- a ；c:實驗組；d:實驗組+TNF- α ；
[0026]圖12不同部位TRADD表達情況，其中A:皮膚成纖維細胞內TRADD蛋白表達b.皮下成纖維細胞內TRADD蛋白表達；
[0027]圖13經方法不同處理后皮膚愈合情況。
【具體實施方式】:
[0028]I材料與方法[0029]1.1質粒和細胞
[0030]TRADD基因模板購自OPEN公司，慢病毒表達載pLV X-EGFP-3FLAG_Puro購自上海生博公司，ViraPower? Lent1-viral Packaging Mix 購自 Invitrogen 公司，DH5a 感受態(tài)細胞、293FT細胞、EFb及HSFb均為本領域常見的細胞類型。
[0031]1.2主要試劑
[0032]DL2000DNA Marker、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、Taq酶和dNTP購自TaKaRa公司，EcoR I 購自 NEB 公司，BCA Protein Assay kit 購自 HyClone-Perce 公司、Prestainedprotein marker 購自 Ferments 公司，Rabbit Ant1-TRADD 購自 Abcam 公司，GoatAnt1-rabbit IgG 購自 Santa Cruz 公司，ECL-plus/kit 購自 Amersham 公司，I 型膠原(Collagen I)ELISA試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司。引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成，陽性克隆測序由華大基因完成。
[0033]1.3TRADD目的基因獲得與慢病毒表達載體構建
[0034]以購買的TRADD基 因為模板，采用PCR法擴增目的片段。引物序列:
[0035]TRADD-F5，-CTCAAGCTTCGAATTC GCCACC ATGGCAGCTGGGCAA AATG-3，，含同源重組序列、EcoR I酶切位點(下劃線)、Kozak序列(雙下劃線)；
[0036]TRADD-R5’ -CCATGGTGGCGAATTCGGCCAGGCCGCCATTGG-3，,含同源重組序列、EcoR I酶切位點(下劃線)。
[0037]PCR產物回收純化后與EcoR I酶切線性化的表達載體pLVX-EGFP-3FLAG_Puro進行重組連接，37°C孵育15min，再50°C孵育15min，立即轉化DH5a感受態(tài)細胞。最后將已轉化的感受態(tài)細胞轉移至含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)16h。
[0038]1.4陽性克隆鑒定
[0039]挑取平板上長出的轉化子重懸于10 μ I LB培養(yǎng)液中，從中取1μ I做模板進行菌落PCR鑒定。
[0040]陽性克隆鑒定引物:CMV-F 5’ -CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’，該引物位于目的基因上游的CMV啟動子中；
[0041]pEGFP-N-R 5’-CGTCGCCGT CCAGCTCGACC AG_3’，該引物位于多克隆位點的下游序列中。
[0042]反應體系為:TemplateI μ I, CMV-F (10 μ mo I / L)0.8 μ I, pEGFP-N-R (IOtmo I /L)0.8μ 1，dNTP (各 2.5mmol / L) 1.6μ I, IOXBuffer (with Mg2+) 2 μ 1，Taq 酶 0.1 μ 1，加 dH20 至 20 μ I。PCR 反應條件:94 °C 5min ；94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 1.5min，30 循環(huán)；72°C IOmin0接種陽性克隆，保種并分裝100 μ I進行測序。測序驗證無誤后，接種抽提質粒。
[0043]1.5慢病毒的包裝
[0044]選擇生長狀態(tài)良好的293FT細胞進行包裝。取慢病毒表達載體pLVX-TRADD-EGFP-3FLAG-Puro3 μ 1、virapower packing mix9 μ I 輕柔混合于 1.5ml無血清Opt1-MEM I中，形成溶液A ;將36 μ I Lipofectamine2000與1.5ml無血清Opt1-MEM I混合形成溶液B，并室溫孵育5min ;再將溶液A和B混合，室溫孵育20min，形成DNA-Lipofectamine2000復合物，直接轉染293FT細胞。轉染48h后，收集病毒液。
[0045]1.6滴度測定[0046]用Real-time 定量 PCR 法檢測病毒滴度，引物序列:BAC_F5’ -TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’，BAC-R5’-CAGCG GAACCGCTCATTGCCAATGG-3’，BAC-P5’-FAM-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT-TAMRA-3’ ；WPRE_F5’-CCTTTCCGGGACT TTCGCTTT-3 ’，WPRE-R5 ’ -GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3，，WPRE-P5’ -FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3，。檢測的前 ld，將長勢良好的293FT細胞按IXlO5 /孔接種于24孔板中，次日分別用10、1、0.1 μ I病毒原液感染293FT細胞。48h后，熒光顯微鏡下觀察細胞中綠色熒光的分布。72h后抽提每組細胞基因組DNA，在AB17500熒光定量PCR儀上進行Real-time PCR反應檢測病毒滴度。
[0047]1.7驗證TRADD基因在HSFb、EFb中的表達
[0048]1.7.1細胞免疫熒光法
[0049]將HSFb、EFb接種至蓋玻片上，當融合率達到80%時終止培養(yǎng)，PBS漂洗3次，每次3-5min ;4%多聚甲醛室溫固定20分鐘，PBS漂洗3次，每次3_5min ；0.5% Triton xlOO細胞穿孔15min，PBS漂洗3次，每次3_5min ；5% BSA室溫封閉30min ;加入1% BSA稀釋的一抗，稀釋比1:100，4°C 孵育過夜，PBS漂洗3次，每次3-5min ;加入I % BSA稀釋的二抗，稀釋比1:50，37°C避光孵育lh，PBS漂洗3次，每次3-5min ；5ug/ml DAPI染色3min，PBS漂洗3次，每次3-5min ;95%甘油封片,避光保存,于激光共聚焦顯微鏡下觀察結果。
[0050]1.7.2ffestern blot 法
[0051]收集HSFb、EFb并轉移到EP管中，冰上裂解10-15min，超聲破碎儀破碎細胞，離心后取上清液。BCA法測定蛋白濃度后，每個樣品蛋白終濃度均調整為2 μ g/μ I。常規(guī)蛋白變性、上樣電泳、濕轉至PVDF膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉Ih ;4°C—抗孵育過夜(RabbitAnti TRADD:1:200) ；TBST 洗膜 3 次，每次 IOmin ;室溫下二抗孵育 PVDF 膜 2h(Goat Antirabbit IgG:1:3000) ;TBST 洗膜 3 次，每次 IOmin ;最后 ECL-plus / kit 顯色、X 光片曝光、顯影、定影后進行分析。應用quantity one4.6.2圖像處理軟件測定電泳條帶的累積光密度IOD值，計算目的蛋白與內參蛋白光密度的比值，并以此比值作為目的蛋白的相對表達量。
[0052]1.8ffestern blot檢測HSFb、EFb轉染慢病毒后TRADD-GFP-FLag融合蛋白的表達
[0053]根據預實驗結果:PLVX-TRADD-EGFP感染HSFb、EFb的效率達到80 %，MOI應為100，對上述細胞分別做如下處理:空白組(未轉染)、實驗組(轉染PLVX-TRADD-EGFP)。細胞收集，蛋白提取及Western blot方法同上。
[0054]I.9MTT法檢測HSFb、EFb增殖情況
[0055]HSFb (空白組與實驗組)分別配成1.11 X IO4Cells / ml細胞懸液，鋪5塊96孔板，每孔90 μ 1，即1.0X IO3Cells / well，待細胞貼壁后，在相應孔分別加入IOOng / mlTNF- α，IOul /孔，終濃度為10ng/ml，每組設6個復孔；將EFb (空白組與實驗組)分別配成2.22X IO4Cells / ml細胞懸液，每孔鋪90 μ 1，即2.0X 103cells / well，待細胞貼壁后，在相應孔分別加入IOOng / ml TNF- a , IOul /孔，終濃度為IOng / ml，每組設6個復孔。490nm波長測OD值。
[0056]1.10流式細胞儀檢測HSFb、EFb細胞周期與細胞凋亡
[0057]PLVX-TRADD-EGFP 感染 HSFb、EFb，3d 后加入終濃度為 IOng / ml 的 TNF- α，實驗分為空白組、空白組+TNF-α、實驗組、實驗組+TNF-α。72h后收集生長狀態(tài)良好的各組細胞，細胞計數后，每個樣品準備IO6Cells,制成細胞懸液后，預冷的70%乙醇4°C固定兩小時。300目的篩網過濾后，將細胞懸液轉移到流式上機管中，上機檢測。[0058]1.11 ELISA檢測HSFb、EFb膠原蛋白合成
[0059]PLVX-TRADD-EGFP 感染 HSFb、EFb, 3d 后加入終濃度為 10ng/ml 的 TNF- α 繼續(xù)培養(yǎng)，實驗分為空白組、空白組+TNF-α、實驗組、實驗組+TNF-α。24h、48h、72h分別收取各組細胞培養(yǎng)液，使用人I型膠原(Collagen I) ELISA試劑盒，在450nm波長測OD值。以標準品的濃度為縱坐標(對數坐標)，OD值為橫坐標(對數坐標)，作標準曲線。根據樣品OD值，由標準曲線得到樣品中Collagen I濃度。
[0060]1.12皮膚疤痕模型的建立
[0061]將2頭巴馬小型豬常規(guī)兩側背部清洗、備皮并分欄適應性喂養(yǎng)24小時。用3%戊巴比妥鈉注射液按25ml / kg體重靜脈注射至深昏迷。將恒溫電烙鐵溫度調為200°C，在豬兩側背部各作9個直徑約2cm的圓形灼傷點，每次灼燒時間為0.5s，使皮膚表面形成焦痂。無菌紗布包扎創(chuàng)面。隔日去除包扎暴露創(chuàng)面，術后肌注青霉素一周預防抗炎并密切觀察局部情況。
[0062]1.13局部注射TRADD基因過表達慢病毒對皮膚疤痕的影響
[0063]于燒灼后第3天分別在燒灼點基底部及灶內注射不同量的慢病毒及rmhTNF(上海賽達生物藥業(yè)股份有限公司生產)。A組:對照慢病毒(PLVX-EGFP)0.2 X IO8TU病毒液；B組:目的基因慢病毒(PLVX-TRADD-EGFP) 0.2 X IO8TU病毒液；
[0064]C 組:目的基因慢病毒(PLVX-TRADD-EGFP)0.2X IO8TU 病毒液 +rmhTNF50IU ；35d時，同樣在麻醉條件切取瘢痕組織標本，測定慢病毒轉染及瘢痕增生情況。
[0065]2 結果
`[0066]2.1PCR擴增目的基因
[0067]PCR擴增目的基因后，產物經瓊脂糖凝膠電泳，可見在IOOObp與750bp間出現一條特異性陽性條帶，大小與預期的974bp相符(圖1)。
[0068]2.2陽性克隆PCR鑒定
[0069]重組質粒轉化DH5a感受態(tài)細胞，經氨芐抗性培養(yǎng)基篩選后，采用菌落PCR法鑒定，
5、7、9泳道可見大小約1200bp的陽性克隆條帶，2、3、6、8泳道可見大小約252bp的陰性克隆條帶(圖2)。陽性克隆送華大基因測序，結果顯示重組質粒中插入的序列與GenBank中序列完全一致，說明慢病毒質粒載體構建成功。
[0070]2.3慢病毒包裝與滴度測定
[0071]質粒共轉染至293FT包裝細胞中，成功包裝出慢病毒顆粒。病毒原液感染293FT細胞48h后，熒光顯微鏡下可見大量綠色熒光(圖3)。感染72h后抽提每組細胞基因組DNA，Real-time PCR法檢測病毒滴度。按病毒滴度公式進行數據分析:IUml-l=(CXNXDX1000) / V，其中:C=平均每基因組整合的病毒拷貝數，N=感染時細胞的數目(約為2X 105)，D=病毒載體的稀釋倍數，V=加入的稀釋病毒的體積數(μ I)。本次檢測出的病毒滴度為3.22X 108IU / ml ο
[0072]2.4驗證TRADD基因在HSFb、EFb細胞中的表達
[0073]2.4.1細胞免疫熒光法:
[0074]利用共聚焦顯微鏡觀察細胞爬片，可觀察到HSFb、EFb中綠色熒光標記的TRADD蛋白散在分布于整個細胞胞漿中，這說明TRADD蛋白在細胞中得到了有效表達，同時定位了TRADD蛋白在細胞中的表達部位。共聚焦顯微鏡掃描后直接測量熒光強度，結果顯示，TRADD蛋白在HSFb中的表達量明顯低于在EFb中的表達量(圖4)。
[0075]2.4.2ffestern blot 法:
[0076]以TRADD目的蛋白與β-Actin內參蛋白累積光密度的比值作為TRADD蛋白的相對表達量，實驗結果與細胞免疫熒光檢測結果相一致，兩組比較有顯著統(tǒng)計學意義(P< 0.05)(圖 5)
[0077]2.5ffestern blot檢測HSFb、EFb細胞轉染慢病毒后融合蛋白表達
[0078]目的基因TRADD融合GFP與FLag，共同表達的融合蛋白TRADD-GFP-Flag理論大小為64X 103。用β-actin作內參,通過Western blot檢測，可以觀察到實驗組55-72X IO3處有陽性條帶，其大小與融合蛋白理論值相吻合，空白對照組無陽性條帶表達。因此判斷TRADD過表達慢病毒在HSFb、EFb細胞中獲得了有效表達(圖6、圖7)。
[0079]2.6MTT法測定細胞增殖能力
[0080]TRADD慢病毒對EFb增殖有輕度促進作用，10ng/ml TNF- α、TRADD慢病毒聯合IOng / ml TNF-α對EFb增殖均無明顯影響(圖8)。TRADD慢病毒、IOng / ml TNF-α、TRADD慢病毒聯合10ng/ml TNF-α對HSFb增殖均有抑制作用，TRADD慢病毒聯合IOng /ml TNF-α的抑制作用更為明顯(圖9)。
[0081]2.7流式細胞儀檢測細胞周期與凋亡
[0082]TRADD 慢病毒、10ng/ml TNF- α、TRADD 慢病毒聯合 10ng/mlTNF- α 對 EFb 細胞周期及凋亡均無明顯影響(圖10)。TRADD慢病毒引起HSFb G2 / M期阻滯，10ng/ml TNF-α可促進TRADD慢病毒引起的G2 / M期阻滯作用的發(fā)生，TRADD慢病毒聯合10ng/ml TNF-α引起HSFb亞Gl期凋亡峰的出現，說明HSFb細胞分裂受到抑制，有凋亡現象發(fā)生(圖11)。
[0083]2.8ELISA檢測膠原蛋白合成
[0084](I) EFb膠原蛋白:與空白組、空白組+TNF- α組比較，實驗組在24h分泌I型膠原蛋白的含量增多，P < 0.05(表一)。
[0085]⑵HSFb膠原蛋白:與空白組比較，空白組+TNF- α組在72h分泌的I型膠原蛋白含量減少，P < 0.01，實驗組與實驗組+TNF- α在24h、48h、72h分泌的I型膠原蛋白含量減少，P < 0.01，實驗組+TNF-α組減少尤為明顯(表二)。
[0086]表一:EFb I型膠原蛋白表達量的校正值:(1 土s)
組別24h4 Sh72h

空白組0.083士0.005 0.201士0.010 0.236士0.008
[0087]2 白組+INF-Ct0.082±0.005 0.1 卯士 0.0140.224士 0.010
實驗組0.09S±0.008ab 0.185±0,0110.224±0.019


實驗組+TNF-α0.0S8±0.011 0.194±0_0100.216±0.014
[0088]注:與同一時點上空白組比較，aP< 0.05，與同一時間點上空白組+TNF-α比較，bP < 0.05
[0089]表二:HSFb I型膠原蛋白表達量的校正值土s)
【權利要求】
1.TRADD基因過表達慢病毒在抑制皮膚疤痕形成或治療皮膚疤痕中的應用，其特征在于所述的TRADD基因過表達慢病毒通過如下方法制備而成: (1)TRADD基因為模板，采用PCR法擴增目的片段，擴增引物序列為:
TRADD-F:5’ -CTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGGCAGCTGGGCAA AATG-3’ ；
TRADD-R:5’ -CCATGGTGGCGAATTCGGCCAGGCCGCCATTGG-3’: PCR產物回收純化后與EcoR I酶切線性化的表達載體pLVX-EGFP-3FLAG-Puro進行重組連接，37°C孵育15min，再50°C孵育15min，立即轉化DH5a感受態(tài)細胞，最后將已轉化的感受態(tài)細胞轉移至含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)16h ； (2)接種陽性克隆，保種并分裝100μ I進行測序，測序驗證無誤后，接種抽提質粒: (3)選擇生長狀態(tài)良好的293FT細胞進行包裝:取慢病毒表達載體pLVX-TRADD-EGFP-3FLAG-Puro3 μ 1、virapower packing mix9 μ I 輕柔混合于 1.5ml 無血清 Opt1-MEM I 中，形成溶液 A ;將 36 μ lLipofectamine2000 與 1.5ml 無血清 Opt1-MEMI混合形成溶液B,并室溫孵育5min ;再將溶液A和B混合，室溫孵育20min,形成DNA-Lipofectamine2000復合物，直接轉染293FT細胞，轉染48h后，收集病毒液。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于改善皮膚疤痕的平整度和/或色澤均勻度，優(yōu)選為同時改善平整度和色澤均勻度。
3.權利要求1所述的 TRADD基因過表達慢病毒。
【文檔編號】C12N7/01GK103446188SQ201310391083
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月2日 優(yōu)先權日:2013年9月2日
【發(fā)明者】彭貴勇, 袁月, 康秀峰, 劉云杰, 代劍華 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院