專利名稱：具有抑制平滑肌細胞增生活性的肝素片段及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抑制平滑肌細胞增生活性的肝素片段及其制備方法。
背景技術(shù)：
肝素是糖胺聚糖家族中一種高度硫酸化的重要成員。它在肥大細胞中合成后，被 運輸?shù)礁鞣N組織器官中，因此其在生物體內(nèi)廣泛存在。生物體內(nèi)肝素單鏈的分子量高達 60，000-100，OOODa，許多條肝素鏈又通過肽段連接，形成巨大蛋白聚糖分子。商用肝素分 子量是由上述的糖胺聚糖降解而來的，巨型糖鏈在生產(chǎn)過程中多處被打斷，形成了分子量 范圍大約在5000-25000Da之間產(chǎn)品。由此可以看出，肝素是由不同長度的混合鏈組成，鏈 與鏈之間則又有差異，導(dǎo)致了肝素組分的高度異質(zhì)性。根據(jù)對肝素鏈的組成和寡糖序列分 析，現(xiàn)在已經(jīng)基本清楚肝素的總體結(jié)構(gòu)和組成。鏈中主要以糖醛酸殘基(L-iduronic acid, IdoA ；D-glucuronic acid, GlcA)和六糖胺(D-glucoamine)形式交替出現(xiàn)。肝素最早的臨床用途是作為抗凝和抗血栓出現(xiàn)的。后來研究表明它還有抗平滑肌 細胞增生、抗炎癥、抗腫瘤調(diào)節(jié)人體免疫功能等生物活性。同時它可以治療和預(yù)防因外傷、 哮喘、動脈粥樣硬化、高血壓、充血性心力衰竭、肺出血、腎炎綜合癥、急性腎小球腎炎、小兒 先天性心臟病等引起的平滑肌增生，預(yù)防血管狹窄，避免或減少小兒和成人肺動脈高壓癥， 預(yù)防和治療冠心病和心肌梗塞患者經(jīng)冠狀動脈“搭橋術(shù)” “球囊擴充術(shù)” “安裝支架術(shù)”和腦 栓塞患者經(jīng)“顱內(nèi)血管分流術(shù)”平滑肌增生引起的心，腦血管再狹窄癥(restenosis)。因此 肝素具有多種藥用的潛力。但是，肝素作為一種高度硫酸化的多糖，在使用過程中會引起明 顯的出血癥狀，這一主要的副作用限制了肝素的臨床應(yīng)用。解決這一問題的途徑在于分別明確肝素中起抗凝活性的寡糖片段的結(jié)構(gòu)和其它 生物學(xué)活性的片段結(jié)構(gòu)。到目前為止，肝素的抗凝活性寡糖片段是唯一被闡明的結(jié)構(gòu)。它是一個含有 3-0-硫酸基團五糖片段。肝素五糖與抗凝血酶的作用包括兩個步驟首先，五糖序列中非還原端三糖序列 與ATIII形成一個低親和性的識別復(fù)合物，誘導(dǎo)ATIII構(gòu)象變化導(dǎo)致高親和性復(fù)合物的形 成。三糖序列能夠完全激活A(yù)TIII，還原端的二糖序列對激活過程并不重要，但是它能穩(wěn)定 激活后的構(gòu)象。除此而外，肝素的結(jié)構(gòu)中其它生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)域尚不清楚。SPR傳感技術(shù)是基于一種名為表面等離子體諧振(Surface Plasmon Resonance, SPR)的物理光學(xué)現(xiàn)象發(fā)展起來的一種傳感技術(shù)。其基本原理是利用附著于特制金屬薄膜 表面的物質(zhì)分子(或親和結(jié)合分子復(fù)合物)質(zhì)量的改變會引起附近局部折射率的變化，將 這種變化轉(zhuǎn)化成電信號輸出，從而實時檢測金屬膜表面分子相互作用的情況。操作程序包 括以下幾個步驟將特異的生物分子(受體)通過化學(xué)或物理方法固定于金膜表面，制成檢 測芯片；通入緩沖液到芯片表面，清洗獲得平衡基線；然后通入待檢測樣品(即含配體的溶 液)，檢測配體和受體的結(jié)合反應(yīng)；再通入緩沖液，檢測反應(yīng)形成的復(fù)合物的解離；最后通入再生液徹底洗脫掉待檢樣品，使得芯片得以再生。該技術(shù)的優(yōu)點在于樣品的免標(biāo)記、無 損傷檢測，實時檢測和待檢測分子的可回收性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種制備具有抑制平滑肌細胞增生活性的肝素片段的 方法。本發(fā)明所提供的制備具有抑制平滑肌細胞增生活性的肝素片段的方法，包括如下 步驟(1)用肝素酶酶解肝素，得到肝素酶解產(chǎn)物；(2)用SPR傳感技術(shù)從所述肝素酶解產(chǎn)物中分離得到具有抑制平滑肌細胞增生活 性的肝素片段。上述過程中，所述用sra傳感技術(shù)從所述肝素酶解產(chǎn)物中分離得到具有抑制平滑 肌細胞增生活性的肝素片段的方法包括如下步驟1)在芯片上固定連接刺激平滑肌細胞增生的堿性成纖維細胞生長因子，得到連接 有刺激平滑肌細胞增生的堿性成纖維細胞生長因子的芯片；2)使所述肝素酶解產(chǎn)物與步驟1)得到的芯片相互作用，所述肝素酶解產(chǎn)物中的 一部分與所述芯片上的堿性成纖維細胞生長因子特異結(jié)合，其余部分未與所述芯片上的堿 性成纖維細胞生長因子結(jié)合，去掉未與所述芯片上的堿性成纖維細胞生長因子結(jié)合的部 分，得到連接有與堿性成纖維細胞生長因子特異結(jié)合的肝素酶解產(chǎn)物的芯片；3)將所述與堿性成纖維細胞生長因子特異結(jié)合的肝素酶解產(chǎn)物從步驟2)得到的 芯片上洗脫下來，即得到具有抑制平滑肌細胞增生活性的肝素片段。上述過程中，所述刺激平滑肌細胞增生的堿性成纖維細胞生長因子為人腦源堿性 成纖維細胞生長因子。上述過程中，所述步驟3)中，所述洗脫中，所用的洗脫液為濃度為2M的氯化鈉水 溶液或濃度為2M的碳酸氫銨水溶液。上述過程中，所述芯片為表面連接有葡聚糖的CM5芯片。上述過程中，所述用肝素酶酶解肝素的方法包括如下步驟所述方法中，在所述步 驟(1)后，步驟(2)前，包括將所述肝素酶解產(chǎn)物進行如下純化的步驟將所述肝素酶解產(chǎn) 物用超濾膜進行超濾，取截留分子量在1000Da-8000Da之間的肝素酶解產(chǎn)物。上述過程中，所述酶解的方法包括如下步驟將所述肝素與所述肝素酶混合，在 25°C、振蕩的條件下反應(yīng)；所述振蕩的轉(zhuǎn)速為100-200轉(zhuǎn)每分鐘，具體為150轉(zhuǎn)每分鐘；所 述肝素與所述肝素酶的投料比為IOg肝素1U肝素酶。上述過程中，所述步驟1)中，所述在芯片上固定連接刺激平滑肌細胞增生的堿性 成纖維細胞生長因子的方法包括如下步驟用所述刺激平滑肌細胞增生的堿性成纖維細胞 生長因子的溶液與所述芯片相互作用；所述刺激平滑肌細胞增生的堿性成纖維細胞生長因 子溶液的濃度為10微克/毫升；所述步驟2)中，所述使所述肝素酶解產(chǎn)物與步驟1)得到的芯片相互作用的方法 是使所述肝素酶解產(chǎn)物的溶液與步驟1)得到的芯片相互作用；所述肝素酶解產(chǎn)物溶液中 肝素酶解產(chǎn)物的濃度為lmg/ml。
上述過程中，所述方法中，在所述步驟1)前，包括將所述芯片表面的葡聚糖活化 的步驟。上述過程中，所述肝素酶是發(fā)酵鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium sp. HC-6155) CGMCC NO. 0660 得到的。上述過程中，所述肝素酶是按照包括如下步驟的方法制備得到的1)將所述發(fā)酵鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium sp. HC-6155) CGMCC NO. 0660 接種 于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)40小時，離心收獲菌體；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成由NaCl、K2HP04、MgS04、肝素、大豆粉和水組成，NaCl在培養(yǎng)基 中的濃度為1克/L，K2HPO4在培養(yǎng)基中的濃度為2. 5克/L，MgSO4在培養(yǎng)基中的濃度為0. 5 克/L，肝素在培養(yǎng)基中的濃度為2克/L，大豆粉在培養(yǎng)基中的濃度為2克/L。2)用滲透壓穩(wěn)定液懸浮所述菌體，12，OOOr/min離心20分鐘，去掉上清液；再用低 鹽溶液懸浮所述菌體，12，000r/min離心20分鐘，收集上清液，記作上清液I ；最后用高鹽溶 液再次懸浮所述菌體，12，000r/min離心20分鐘，再次收集上清液，記作上清液II ；合并所 述上清液I和所述上清液II，得到肝素酶粗酶液；低鹽溶液是將2mmol MgSO4溶解于IL 20mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中得 到的；高鹽溶液是將300mmol NaCl溶解于IL的IOmM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液 中得到的；滲透壓穩(wěn)定液是20% (質(zhì)量百分含量)蔗糖的水溶液。3)將所述肝素酶粗酶液依次用SP Sepharose XL強陽離子交換凝膠和SOURCE 30S強陽離子交換凝膠進行純化；用SP Sepharose XL強陽離子交換凝膠進行純化的方法中，包括如下洗脫步驟 以NaCl濃度為0. 12M的磷酸鹽緩沖液作為起始液，以NaCl濃度為0. 18M的磷酸鹽緩沖液 作為終止液，進行線性梯度洗脫，洗脫時間為120分鐘，所述洗脫過程中NaCl濃度梯度變化 速率恒定，每次收集2ml洗脫液，收集NaCl濃度為0. 16M的磷酸鹽緩沖液所洗脫下來的溶 液；用SOURCE 30S強陽離子交換凝膠進行純化的方法中，包括如下洗脫步驟以 NaCl濃度為0. 05M的磷酸鹽緩沖液作為起始液、以NaCl濃度為0. 15M的磷酸鹽緩沖液作為 終止液，進行線性梯度洗脫，洗脫時間為120分鐘，所述洗脫過程中NaCl濃度梯度變化速率 恒定，每次收集2ml洗脫液，收集NaCl濃度為0. IM的磷酸鹽緩沖液所洗脫下來的溶液；由上述任一所述方法得到的具有抑制平滑肌細胞增生活性的肝素片段也屬于本 發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明方法基于表面等離子體諧振波譜技術(shù)檢測分子間親和作用的原理，從高生 理活性和低副作用的寡糖混合物中篩選功能專一性寡糖片段。該方法具有實時，非標(biāo)記和 靈敏的特點，可以真實的篩選出具有生理功能的寡糖。本發(fā)明方法制備得到的肝素片段具 有抑制平滑肌細胞增生的功能，在濃度較低時，其對平滑肌細胞的抑制率均高于肝素；而且 與肝素比，本發(fā)明得到的肝素片段具有很低的抗凝活性，只有原始肝素的1. 9%。因此，本發(fā) 明方法及制備得到的肝素片段可用于臨床，克服了肝素在使用過程中會引起明顯的出血癥 狀的缺陷，使肝素抗平滑肌細胞增生性能的實際應(yīng)用成為可能。因此，本發(fā)明方法及產(chǎn)品具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為肝素酶解產(chǎn)物圖譜。圖2為肝素酶解產(chǎn)物的抗胎兒臍動脈平滑肌細胞增生活性分析。圖3為肝素酶解產(chǎn)物的抗腫瘤活性分析。圖4為堿性成纖維細胞生長因子的飽和藕聯(lián)。圖5為肝素酶解產(chǎn)物與芯片表面因子相互作用。圖6為芯片三通道同時結(jié)合肝素酶解產(chǎn)物過程示意圖。圖7為回收的肝素片段的高效液相色譜分析。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、具有抑制平滑肌細胞增殖活性的肝素片段及其制備一、制備具有抑制平滑肌細胞增生活性的肝素片段(一 )肝素酶酶解肝素截留分子量為8，000和1，000的超濾膜均購自美國Pall公司。肝素購自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號為H3393;此肝素產(chǎn)品不含肽段，全部是多糖。1、本實驗中所用的肝素酶按照如下方法制備鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriumsp. HC-6155) CGMCC No. 0660 (專利申請?zhí)?02148066. 4)。菌發(fā)酵斜面保存的肝素酶產(chǎn)生菌株鞘氨醇桿菌經(jīng)活化后，接種于液體發(fā)酵培養(yǎng) 基中，30°C培養(yǎng)40小時后，5500r/min離心收獲菌體。液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成由NaCl、K2HP04、MgSO4、肝素、大豆粉和水組成，NaCl在培養(yǎng) 基中的濃度為1克/L，K2HPO4在培養(yǎng)基中的濃度為2. 5克/L，MgSO4在培養(yǎng)基中的濃度為 0. 5克/L，肝素在培養(yǎng)基中的濃度為2克/L，大豆粉在培養(yǎng)基中的濃度為2克/L。NaCl購自北京現(xiàn)代東方精細化學(xué)品有限公司，K2HPO4購自國藥集團化學(xué)試劑有限 公司，MgSO4購自廣東汕頭市西隴化工廠，肝素購自Sigma公司，大豆粉購自北京雙旋微生物 培養(yǎng)基制品廠。低鹽溶液將2mmol MgSO4溶解于lL20mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中得到 的，PH7.4 ；高鹽溶液將300mmol NaCl溶解于IL的IOmM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中 得到的，PH7.4。用滲透休克的方法，即用滲透壓穩(wěn)定液(20%蔗糖水溶液)、低鹽溶液和高鹽溶液 依次處理細胞，以釋放細胞周質(zhì)中的肝素酶。具體做法如下首先用滲透壓穩(wěn)定液懸浮細 胞，12，000r/min離心20分鐘，去掉上清液；再用低鹽溶液懸浮細胞，12，000r/min離心20 分鐘，收集上清液；最后用高鹽溶液再次懸浮細胞，12，000r/min離心20分鐘，再次收集上清液。
將上述低鹽處理獲得的上清液和高鹽處理獲得的上清液合并作為肝素酶粗酶液， 透析后依次用SP Sepharose XL強陽離子交換凝膠和SOURCE 30S強陽離子交換凝膠進 行純化。上柱前皆用20mM pH7. 4的磷酸鹽緩沖液進行平衡。在SP-S印harose (Amersham Biosciences產(chǎn)品)中，加入2ml粗酶液，然后在0-120分鐘的時間范圍內(nèi)，用含有
0.12-0. 18M NaCl的磷酸鹽緩沖液進行線性梯度洗脫(即以NaCl濃度為0. 12M的磷酸鹽緩 沖液作為起始液，以NaCl濃度為0. 18M的磷酸鹽緩沖液作為終止液，進行線性梯度洗脫)， NaCl濃度梯度變化速率恒定，每次收集2ml洗脫液，收集在0. 16M NaCl梯度附近的酶活力 峰，對洗脫下來的液體進行透析和濃縮，作為Source_30S (Amersham Biosciences產(chǎn)品)層 析的起始樣品；Source_30S (Amersham Biosciences產(chǎn)品)中，加入2ml起始樣品，然后在 0-120分鐘的時間范圍內(nèi)，用含有0. 05-0. 15M NaCl的磷酸鹽緩沖液進行線性梯度洗脫(即 以NaCl濃度為0. 05M的磷酸鹽緩沖液作為起始液，以NaCl濃度為0. 15M的磷酸鹽緩沖液 作為終止液，進行線性梯度洗脫)，NaCl濃度梯度變化速率恒定，每次收集2ml洗脫液，收集 在0. IM NaCl梯度附近的酶活力峰，脫鹽和濃縮，得到肝素酶粉末。酶活定義每分鐘生成1 μ mol不飽和糖醛酸所需酶量；將肝素酶粉末溶解于20mM pH7. 4的磷酸鹽緩沖液中，得到酶液。將2g肝素溶于100ml 20mM pH7. 4的磷酸鹽緩沖液中，得到肝素底物溶液，肝素在 肝素底物溶液中的濃度為20mg/ml。酶活檢測將0. Iml酶液和0. Iml肝素底物溶液混合，36 °C反應(yīng)10分鐘后，用
1.8ml 50mM的鹽酸終反應(yīng)，測定A232nm。對照管將0. Iml酶液和0. Iml肝素底物溶液混合，再加入1. 8ml 50mM的鹽酸， 36°C反應(yīng)10分鐘后，測定A232nm。結(jié)果，肝素酶粉末的酶比活為0. 5U/mg。2、用上述肝素酶酶解肝素肝素底物溶液的組成將IOg肝素溶于100ml 20mM pH7. 4的磷酸鹽緩沖液中，得 到肝素底物溶液。酶解方法將100ml肝素底物溶液和20mg肝素酶(肝素與肝素酶的投料比為 IOg IU肝素酶)，放置于密封容器中，25°C水浴溫和振蕩(轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)每分鐘)；間隔 12小時取樣測定酶解產(chǎn)物在波長下的吸光度值A(chǔ)232nm的變化，直至酶解產(chǎn)物的吸光值不 再變化(最后的吸光值為3. 0)。將酶解產(chǎn)物用截留分子量為8，OOODa的超濾膜超濾，取濾出液；將濾出液用 截留分子量為1，OOODa的超濾膜超濾，取被截留部分；得到酶解產(chǎn)物中分子量范圍在 IOOODa-SOOODa之間的組分，即為肝素酶解產(chǎn)物，將肝素酶解產(chǎn)物冷凍干燥，備用。將肝素和酶解產(chǎn)物分別進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，所用凝膠濃度為20%，電泳結(jié) 束后，用0. 08%的天青A染色直到有清晰條帶出現(xiàn)，立即用蒸餾水沖洗除去多余染液，結(jié)果 如圖1所示。圖1中，第1和第4泳道是肝素的分子分布；第3泳道是酶法制備的肝素酶解 產(chǎn)物的分子分布。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果一致。(二)用SPR傳感技術(shù)分離具有抑制平滑肌細胞增殖活性的肝素片段1、在芯片上固定連接堿性成纖維細胞生長因子
人腦源堿性成纖維細胞生長因子Q^parin binding growth factor-2， basicbrain-derived growth factor, 17KDa))購自 Invitrogen 公司，產(chǎn)品目錄號為 PHG0024 ；SPR傳感芯片采用CM5芯片。(1) CM5芯片的活化依次注射35 μ L濃度分別為0. 05mol/L和0. 2mol/L的N-羥 基硫代琥珀酰亞胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)到芯片表面，流 速為5μ L/min，使CM5芯片表面的葡聚糖活化，得到表面為活化的葡聚糖分子的CM5芯片。 CM5芯片的3條通道均被活化處理，分別記作通道1、通道2、通道3，通道4不活化作為對照。(2)飽和固定人腦源堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)人腦源堿性成纖維細胞生長因子溶液的濃度為10微克/毫升；設(shè)置儀器的流速為10微升每分鐘，通入HBS緩沖液(pH 7. 4) (PharmaciaBiosensor AB公司)(溶液成分如下:10mmol/L 4—2(2—羥基)哌嗪-1-乙基 磺酸、150mmol/L NaCl,3. 4mmol/L EDTA.O. 005% (V/V)表面活性劑P20)到芯片表面，清洗 獲得平衡基線；注射5微升bFGF溶液于涂有葡聚糖芯片的表面；反復(fù)進樣，直到響應(yīng)值不 再上升，封閉，通道4作為對照通道。如此堿性成纖維細胞生長因子和芯片表面已經(jīng)活化 的葡聚糖分子發(fā)生化學(xué)藕聯(lián)，獲得飽和偶聯(lián)bFGF的芯片，1，2，3通道的響應(yīng)值分別達到約 5000RU (圖4)。(該響應(yīng)值為起點和終點之差)。2、肝素酶解產(chǎn)物和人腦源堿性成纖維細胞生長因子結(jié)合(1)肝素酶解產(chǎn)物與細胞生長因子的結(jié)合能力檢測設(shè)定流速恒定為50 μ l/min, 將樣品分別配制成系列濃度梯度，肝素酶解產(chǎn)物為0，3. 9,7. 8，31. 3，62. 5，125，250nM。每次 進樣后，芯片表面用 50 μ 1 2Μ NaCl 溶液(NaCl 溶解于 IOOmM sodium acetatebuffer (pH 4. 0)再生。結(jié)果，肝素片段在不同濃度條件下獲得的和因子的結(jié)合和解離特征譜圖如圖5所 示。A圖為酶法制備的肝素寡糖(即肝素酶解產(chǎn)物)；B圖為化學(xué)法肝素寡糖(即肝素裂解 產(chǎn)物)。兩種樣品各自與因子結(jié)合能力常數(shù)如表1所示。ka為結(jié)合速度系數(shù)，kd為解離速 度系數(shù)，KD為解離常數(shù)。KD值越小，說明二者的結(jié)合能力越強。表1、各種相互作用的動力學(xué)分析*
權(quán)利要求
1.一種制備具有抑制平滑肌細胞增生活性的肝素片段的方法，包括如下步驟(1)用肝素酶酶解肝素，得到肝素酶解產(chǎn)物；(2)用SI^R傳感技術(shù)從所述肝素酶解產(chǎn)物中分離得到具有抑制平滑肌細胞增生活性的 肝素片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求ι所述的方法，其特征在于所述用sra傳感技術(shù)從所述肝素酶解產(chǎn) 物中分離得到具有抑制平滑肌細胞增生活性的肝素片段的方法包括如下步驟1)在芯片上固定連接刺激平滑肌細胞增生的堿性成纖維細胞生長因子，得到連接有刺 激平滑肌細胞增生的堿性成纖維細胞生長因子的芯片；2)使所述肝素酶解產(chǎn)物與步驟1)得到的芯片相互作用，所述肝素酶解產(chǎn)物中的一部 分與所述芯片上的堿性成纖維細胞生長因子特異結(jié)合，其余部分未與所述芯片上的堿性成 纖維細胞生長因子結(jié)合，去掉未與所述芯片上的堿性成纖維細胞生長因子結(jié)合的部分，得 到連接有與堿性成纖維細胞生長因子特異結(jié)合的肝素酶解產(chǎn)物的芯片；3)將所述與堿性成纖維細胞生長因子特異結(jié)合的肝素酶解產(chǎn)物從步驟幻得到的芯片 上洗脫下來，即得到具有抑制平滑肌細胞增生活性的肝素片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述刺激平滑肌細胞增生的堿性成 纖維細胞生長因子為人腦源堿性成纖維細胞生長因子；所述步驟幻中，所述洗脫中，所用 的洗脫液為濃度為2M的氯化鈉水溶液或濃度為2M的碳酸氫銨水溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述芯片為表面連接有葡聚糖的 CM5芯片；所述方法中，在所述步驟1)前，包括將所述芯片表面的葡聚糖活化的步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述步驟(1) 后，步驟( 前，包括將所述肝素酶解產(chǎn)物進行如下純化的步驟將所述肝素酶解產(chǎn)物用超 濾膜進行超濾，取分子量在1000Da-8000Da之間的肝素酶解產(chǎn)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述酶解的方法包括如下步驟 將所述肝素與所述肝素酶混合，在25°C、振蕩的條件下反應(yīng)；所述振蕩的轉(zhuǎn)速為100-200轉(zhuǎn) 每分鐘，具體為150轉(zhuǎn)每分鐘；所述肝素與所述肝素酶的投料比為IOg肝素1U肝素酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，所述在芯片上 固定連接刺激平滑肌細胞增生的堿性成纖維細胞生長因子的方法包括如下步驟用所述刺 激平滑肌細胞增生的堿性成纖維細胞生長因子的溶液與所述芯片相互作用；所述刺激平滑 肌細胞增生的堿性成纖維細胞生長因子溶液中刺激平滑肌細胞增生的堿性成纖維細胞生 長因子的濃度為10微克/毫升；所述步驟幻中，所述使所述肝素酶解產(chǎn)物與步驟1)得到的芯片相互作用的方法是使 所述肝素酶解產(chǎn)物的溶液與步驟1)得到的芯片相互作用；所述肝素酶解產(chǎn)物的溶液中肝 素酶解產(chǎn)物的濃度為lmg/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述肝素酶是發(fā)酵鞘氨醇桿菌 (Sphingobacterium sp. HC-6155)CGMCC N0. 0660 得到的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述肝素酶是按照包括如下步 驟的方法制備得到的1)將所述發(fā)酵鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium sp. HC-6155) CGMCC NO. 0660接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)40小時，離心收獲菌體；所述發(fā)酵培養(yǎng)基由NaCl、K2HPO4, MgSO4、肝素、大豆粉和水組成，NaCl在發(fā)酵培養(yǎng)基中 的濃度為1克/L，K2HPO4在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為2. 5克/L，MgSO4在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度 為0. 5克/L，肝素在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為2克/L，大豆粉在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為2克 /L；2)用滲透壓穩(wěn)定液懸浮所述菌體，12，OOOr/min離心20分鐘，去掉上清液；再用低鹽溶 液懸浮所述菌體，12，000r/min離心20分鐘，收集上清液，記作上清液I ；最后用高鹽溶液再 次懸浮所述菌體，12，000r/min離心20分鐘，再次收集上清液，記作上清液II ；合并所述上 清液I和所述上清液II，作為肝素酶粗酶液；低鹽溶液是將2mmol MgSO4溶解于IL 20mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中得到的； 所述低鹽溶液的PH值是7. 4;高鹽溶液是將300mmol NaCl溶解于IL的IOmM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中得 到的；所述高鹽溶液的PH值是7. 4 ；滲透壓穩(wěn)定液是20% (質(zhì)量百分含量)蔗糖的水溶液；3)將所述肝素酶粗酶液依次用SPSepharose XL強陽離子交換凝膠和SOURCE 30S 強陽離子交換凝膠進行純化；用SP Sepharose XL強陽離子交換凝膠進行純化的方法中，包括如下洗脫步驟以 NaCl濃度為0. 12M的磷酸鹽緩沖液作為起始液，以NaCl濃度為0. 18M的磷酸鹽緩沖液作為 終止液，進行線性梯度洗脫，洗脫時間為120分鐘，所述洗脫過程中NaCl濃度梯度變化速率 恒定，每次收集2ml洗脫液，收集NaCl濃度為0. 16M的磷酸鹽緩沖液所洗脫下來的溶液；用SOURCE 30S強陽離子交換凝膠進行純化的方法中，包括如下洗脫步驟以NaCl濃 度為0. 05M的磷酸鹽緩沖液作為起始液、以NaCl濃度為0. 15M的磷酸鹽緩沖液作為終止 液，進行線性梯度洗脫，洗脫時間為120分鐘，所述洗脫過程中NaCl濃度梯度變化速率恒 定，每次收集2ml洗脫液，收集NaCl濃度為0. IM的磷酸鹽緩沖液所洗脫下來的溶液。
10.由權(quán)利要求1-9中任一所述方法得到的具有抑制平滑肌細胞增生活性的肝素片段。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有抑制平滑肌細胞增生活性的肝素片段及其制備方法。該方法包括如下步驟(1)用肝素酶酶解肝素，得到肝素酶解產(chǎn)物；(2)用SPR傳感技術(shù)從所述肝素酶解產(chǎn)物中分離得到具有抑制平滑肌細胞增生活性的肝素片段。本發(fā)明方法制備得到的肝素片段具有抑制平滑肌細胞增生的功能，在濃度較低時，其對平滑肌細胞的抑制率均高于肝素；而且與肝素比，本發(fā)明得到的肝素片段具有很低的抗凝活性，只有原始肝素的1.9％。因此，本發(fā)明方法及制備得到的肝素片段可用于臨床，克服了肝素在使用過程中會引起明顯的出血癥狀的缺陷，使肝素抗平滑肌細胞增生性能的實際應(yīng)用成為可能。因此，本發(fā)明方法及產(chǎn)品具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N9/24GK102146425SQ20101911407
公開日2011年8月10日 申請日期2010年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月8日
發(fā)明者樊崢, 程秀蘭, 鈔亞鵬, 錢世鈞 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所