專利名稱：：一種基于納米金標(biāo)銀增強(qiáng)信號(hào)放大技術(shù)的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及l(fā))生物素化沙門(mén)氏菌序列特異寡核苷酸捕獲探針首先通過(guò)生物素_親和素結(jié)合作用固定到親和素包被酶標(biāo)板上，再通過(guò)DNA互補(bǔ)雜交捕獲沙門(mén)氏菌序列特異目標(biāo)單鏈核酸分子，納米金標(biāo)記沙門(mén)氏菌序列特異性寡核苷酸顯示探針進(jìn)一步通過(guò)與目標(biāo)單鏈核酸分子雜交，在酶標(biāo)板孔內(nèi)形成納米金標(biāo)記三明治雙鏈復(fù)合物；2)或者固定在微孔板上的沙門(mén)氏菌多克隆抗體首先捕獲目標(biāo)沙門(mén)氏菌，然后納米金標(biāo)記的沙門(mén)氏菌多克隆抗體再與目標(biāo)菌溫育結(jié)合形成夾心結(jié)構(gòu)；3)通過(guò)銀染增強(qiáng)，結(jié)合在酶標(biāo)孔內(nèi)的納米金標(biāo)記信號(hào)被放大3-6個(gè)數(shù)量級(jí)，結(jié)合光密度檢測(cè)技術(shù)或溶出化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門(mén)氏菌的超靈敏檢測(cè)。同時(shí)該方法很容易推廣應(yīng)用到其它致病菌的檢測(cè)工作中。具體實(shí)驗(yàn)原理如圖1、圖2所示。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的主要分析步驟如下1試樣制備1.1本發(fā)明所用沙門(mén)氏菌特異性寡核苷酸探針包括Seq1:5'_SH_(CH2)6_atatccacgcaggaaataacaggactt_3，(顯不探針)；Seq2:5'-gagcgtgccttaccgacgata-(CH2)6-Biotin-3，(捕獲探針)；Seql和Seq2溶解于TE緩沖液(10,1/LTris-HCl，1,1/LEDTA，pH7.4)。本發(fā)明所用抗體為鼠抗沙門(mén)氏菌多克隆抗體。1.2納米金的制備在圓底燒瓶中加入95.8mL超純水，再加入4.2mL1%的氯金酸溶液，磁力加熱攪拌，持續(xù)煮沸10min;加入10mL1%的檸檬酸三鈉溶液(迅速)，溶液開(kāi)始有些藍(lán)色，然后變淺藍(lán)色，再加熱出現(xiàn)紅色；等到出現(xiàn)透明的橙紅色，停止加熱，將熱源除去，繼續(xù)攪拌15min。圖3為所制備納米金顆粒的紫外_可見(jiàn)吸收光譜，其最大吸收波長(zhǎng)為520nm。圖4為所制備納米金顆粒的透射電鏡(TEM)圖，可以看出納米金形貌為較均一的球狀，粒徑在12nm左右。1.3納米金標(biāo)記顯示探針的制備膠體金溶液500iiL，4。C11000r/min離心13min，棄上清。加300nmol/L(pH7.4的1XTE緩沖液稀釋)巰基化沙門(mén)氏菌寡核苷酸顯示探針(seql)50i!L，混勻，置于4t:環(huán)境，反應(yīng)12h。加等體積含0.2mol/L的TE緩沖液，使NaCl終濃度為0.1M，迅速混勻，置于4t:環(huán)境，反應(yīng)24h。加等體積(50iiL)含0.2mol/LNaCl的1XTE緩沖液，使NaCl終濃度為0.lmol/L，迅速混勻，置于4。C環(huán)境，反應(yīng)24h。取上清，4°C，11000r/min離心8分鐘，棄上清，加100i!L超純水重懸后再次離心，棄上清，以去除多余的游離寡核苷酸鏈。加100iiL含0.lmol/LNaCl的1XTE緩沖液混勻，置4"環(huán)境儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.4納米金標(biāo)記鼠抗沙門(mén)氏菌多克隆抗體的制備納米金標(biāo)記鼠抗沙門(mén)氏菌多克隆抗體按照以下方法制備一定量的多抗與lmL納米金膠體溶液混合，室溫下孵育2h。隨后于45000g離心30min去除未結(jié)合多抗。所得沉淀物即為納米金標(biāo)記多抗，將其重懸于0.01mol/LpH7.6Tris緩沖液中備用。1.5酶標(biāo)板包被親和素本發(fā)明中夾心型DNA雜交產(chǎn)物是通過(guò)生物素化的捕獲探針與包被于酶標(biāo)板上的親和素之間的特異性結(jié)合反應(yīng)固定在了微孔板上。適合的親和素包被濃度是本發(fā)明成功與否的基礎(chǔ)。對(duì)親和素的包被濃度進(jìn)行了優(yōu)化，測(cè)定了不同包被濃度下目標(biāo)探針濃度與銀增強(qiáng)后吸光度值的關(guān)系，結(jié)果顯示親和素包被濃度為10.00mg/L時(shí)，目標(biāo)探針濃度與吸光度值之間具有較好的線性關(guān)系，所以選擇10.00mg/L為最佳的親和素包板濃度。酶標(biāo)板包被親和素的具體步驟親和素(lmg/mL)用碳酸鹽包被液按l:100稀釋，每孔包被100iiL，置于4。C環(huán)境，12h。含0.2mol/LNaCl的0.02mol/LPB(pH7.0)每孔250iiL洗滌3次，5min/次，拍干。用3%牛血清白蛋白(BSA)封閉孔板，防止后面的過(guò)程發(fā)生非特異性吸附。1.6酶標(biāo)板包被鼠抗沙門(mén)氏菌多克隆抗體酶標(biāo)板微孔每孔加100L鼠抗沙門(mén)氏菌多克隆抗體(10g/mL配置于0.05M碳酸緩沖液，pH9.6)4。C孵育過(guò)夜，未結(jié)合抗體用0.01mol/LPBS-Tween20(PBST)溶液洗掉。隨后每孔用含1%BSA的0.Olmol/LPBS在37。C封閉lh。接著用PBST溶液洗滌三次。2分析檢測(cè)2.1酶標(biāo)板孔納米金組裝A.DNA雜交法基于夾心型DNA雜交的組裝過(guò)程如圖1所示。選用國(guó)標(biāo)法(GBT4789.4-2008)對(duì)樣品中沙門(mén)氏菌進(jìn)行選擇性增菌培養(yǎng)，采用商品化試劑盒提取細(xì)菌基因組，制備單鏈目標(biāo)DNA樣品。取20iiL1Onmol/L生物素標(biāo)記探針(seq2)，與用0.lmol/LPBS(pH7.O，含0.2mol/LNaCl)配制的10yL單鏈目標(biāo)DNA，混勻，25。C反應(yīng)10min。加納米金標(biāo)記顯示探針(含0.1%BSA)8nmol/L，10yL，混勻，在25°C，反應(yīng)10min。將該40yL體系雜交產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到各酶標(biāo)板孔，37t:保溫20min，傾倒干凈。含0.2mol/LNaCl的0.02mol/LPB(pH7.0):洗滌1次，拍干，2XPBN(0.3mol/LNaN03和lOmmol/LNa2HP04/NaH2P04，pH7.0)洗滌2次，拍干。B.免疫親和法基于夾心型免疫反應(yīng)的組裝過(guò)程如圖2所示。在包被好鼠抗沙門(mén)氏菌多克隆抗體的酶標(biāo)板孔內(nèi)加入100L目標(biāo)菌，37t:孵育20min，隨后用PBST劇烈震蕩洗滌3次去除未結(jié)合的菌。接著每孔加入100i!L鼠抗沙門(mén)氏菌多克隆抗體-納米金復(fù)合物，室溫下孵育20min，隨后用PBST劇烈震蕩洗滌3次，去除未結(jié)合的抗體_納米金復(fù)合物。2.2銀增強(qiáng)信號(hào)放大及吸光度檢測(cè)取銀增強(qiáng)液迅速混勻立即加入各酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔lOOiiL，置于恒溫箱里反應(yīng)，反應(yīng)一定時(shí)間后，每孔加超純水洗滌終止反應(yīng)。然后將銀增強(qiáng)后的微孔板放入酶標(biāo)儀中，在630nm處檢測(cè)其吸光度值。銀增強(qiáng)反應(yīng)在暗處避光進(jìn)行，以減少銀自身成核反應(yīng)，增強(qiáng)特異性。在銀增強(qiáng)過(guò)程中，隨著時(shí)間的推移，增強(qiáng)液的灰度會(huì)不斷增加，尤其是通過(guò)雜交或免疫親和錨定于酶標(biāo)板上的納米金顆?？娠@著加速銀顆粒的聚集，即納米金銀增強(qiáng)信號(hào)的吸光度值變化是劑量時(shí)間依賴性的(圖5)。在一定的時(shí)間控制下，銀增強(qiáng)的灰度值變化與不同濃度目標(biāo)核酸序列(Seq2)雜交系中固定于酶標(biāo)孔內(nèi)的納米金顆粒的量(或通過(guò)與目標(biāo)沙門(mén)氏菌免疫親和固定于酶標(biāo)孔內(nèi)的納米金顆粒的量)呈正相關(guān)。通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，選擇出最合適的時(shí)間段60-80s終止銀增強(qiáng)反應(yīng)，得出(DNA雜交分析法)銀增強(qiáng)吸光度值與目標(biāo)核酸序列的濃度對(duì)數(shù)值lg[c(target)mol/L]在-13-9范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(y=0.0652x+0.8694，R2=0.9948)，檢測(cè)范圍為0.l-1000pmol/L，檢測(cè)限為33fmol/L;(免疫親和分析法)銀增強(qiáng)吸光度值與目標(biāo)沙門(mén)氏菌的濃度在50-2000cfu/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(y=0.0328x+0.4056，R2=0.9932)，檢出限為50cfu/mL。所述銀增強(qiáng)液的制備0.85g氫醌溶于15mL超純水中；1.175g擰檬酸三鈉/1.275g檸檬酸溶于5mL超純水中；0.5g硝酸銀溶于2mL超純水中，溶液均需新鮮配制，確保無(wú)結(jié)晶體析出且無(wú)色，氫醌和檸檬酸混合液應(yīng)在銀增強(qiáng)前30min左右保持37t:溫育。2.3銀的化學(xué)溶出與化學(xué)發(fā)光檢測(cè)6采用l:3HN03(v/v)來(lái)溶解納米金表面沉積的銀。以超純水取代化學(xué)溶出的銀離子溶液做空白對(duì)照，結(jié)果用溶銀測(cè)出的化學(xué)發(fā)光值與空白對(duì)照化學(xué)發(fā)光值差值即相對(duì)化學(xué)發(fā)光值表示。結(jié)果表明，銀在l:3HN03(v/v)中易于溶解，10min即可溶解完全，為保證其完全溶解，本方法中溶解時(shí)間都采用15min。溶出的銀離子催化MnS04-K2S208-H3P04體系生成KMn04，進(jìn)而氧化luminol化學(xué)發(fā)光，通過(guò)Ag+濃度與化學(xué)發(fā)光信號(hào)之間良好的線性關(guān)系完成對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)。本發(fā)明選定上述試劑濃度和用量為K2S208濃度為0.02g/mL(200yL)，MnS04濃度6X10_3mol/L(40iiL)，l:1(v/v)H3P04(36iiL)，1Pmol/Lluminol溶液(200iiL)。用l:3(v/v)H冊(cè)3來(lái)溶解銀增強(qiáng)后各酶標(biāo)板孔內(nèi)的銀(100iiL/孔)，溶解所得的銀離子溶液中均加入60L5mol/L的NaOH來(lái)調(diào)節(jié)其酸度。然后該溶液轉(zhuǎn)移至含有200iiL2%(m/V)K2S208，40iiL6X10—3mol/LMnS04禾P36iiL1:1(v/v)H3P04的離心管中，混合均勻后馬上放入9(TC水浴中加熱7分鐘。流水冷卻中止該催化反應(yīng)并用5mol/LNaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至10。取該溶液50iiL轉(zhuǎn)移至石英發(fā)光管中，然后注射入200yLluminol(1iimol/L，pH13.5)同時(shí)在發(fā)光分析儀上記錄發(fā)光信號(hào)。本發(fā)明中銀離子的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度和目標(biāo)沙門(mén)氏菌特異DNA或沙門(mén)氏菌的濃度成正比，可以得出化學(xué)發(fā)光信號(hào)和待測(cè)沙門(mén)氏菌的關(guān)系。采用DNA雜交分析方法時(shí)，得方法線性范圍為l-1000fmol/L，校正曲線方程為AI=1672.42C(fmol/L)+26477(R2=0.9932)。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.3%(20fmol/L，n=11)，檢測(cè)限為0.3fmol/L(3o)。至少5cfu/mL目標(biāo)菌可以用本發(fā)明方法檢出。采用免疫親和分析方法時(shí)，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與目標(biāo)菌數(shù)量線性范圍為5-1038cfu/mL。回歸方程為AI=7.12C(cfu/mL)+857.78(R2=0.9935)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.7%(50-100cfu/mL，n=11)，檢測(cè)限為5cfu/mL。3分析性能本發(fā)明創(chuàng)新性的利用了沙門(mén)氏菌序列特異性寡核苷酸捕獲探針、金標(biāo)沙門(mén)氏菌顯示探針與目標(biāo)核酸序列之間的DNA雜交，形成三明治復(fù)合體；或者鼠抗沙門(mén)氏菌多克隆抗體直接捕獲目標(biāo)食源性致病菌，再與納米金標(biāo)記鼠抗沙門(mén)氏菌多克隆抗體結(jié)合形成夾心型復(fù)合體；利用納米金銀增強(qiáng)原理，結(jié)合光密度檢測(cè)技術(shù)或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，建立了沙門(mén)氏菌新型超靈敏檢測(cè)方法，不僅發(fā)揮了納米金標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)，更利用了銀增強(qiáng)技術(shù)將信號(hào)有效放大，建立了比傳統(tǒng)方法更靈敏高效的檢測(cè)手段。該方法也極易通過(guò)改變寡核苷酸探針或多克隆抗體類別應(yīng)用于其它致病菌的檢測(cè)，有可能為其他致病菌的超靈敏分析開(kāi)辟一條新的途徑。圖1基于納米金標(biāo)銀增強(qiáng)技術(shù)的沙門(mén)氏菌檢測(cè)示意圖(DNA雜交分析法)圖2基于納米金標(biāo)銀增強(qiáng)技術(shù)的沙門(mén)氏菌檢測(cè)示意圖(免疫親和分析法)圖3納米金的紫外_可見(jiàn)吸收?qǐng)D譜圖4所制備納米金的TEM形貌圖5不同濃度目標(biāo)探針的銀增強(qiáng)時(shí)間與吸光度值的關(guān)系曲線圖6本發(fā)明方法對(duì)沙門(mén)氏菌序列特異寡核苷酸序列響應(yīng)情況比較(a，完全互補(bǔ)目7標(biāo)寡核苷酸序列；b，單堿基錯(cuò)配寡核苷酸序列；c，五堿基錯(cuò)配寡核苷酸序列；d，隨機(jī)對(duì)照鏈圖7)目標(biāo)沙門(mén)氏菌濃度與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度校正曲線具體實(shí)施例方式下面的實(shí)例將具體說(shuō)明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)例11材料1.1儀器MultiskanMK3酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)，DF-101S型集熱式磁力加熱攪拌器(河南鞏義市予華儀器廠)，TU-1900紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，TecnaiG220透射電鏡(TEM)(美國(guó)FEI公司)，LH586-2型恒溫水槽(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)，5804R高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，96酶標(biāo)板(加拿大BBI公司)。1.2試劑和樣品牛血清白蛋白(BSA)(北京鼎國(guó)生物工程有限公司)，氯金酸(HAuCl4)(上海久岳化工有限責(zé)任公司)，氫醌、硝酸銀、磷酸(中國(guó)醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司)，親和素(美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品)，超純水由Milli-Qsystem制取。寡核苷酸序列購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。Seq1:5'-SH-(CH2)6_atetccacgcaggaaateacaggactt-3，(顯不探針)；Seq2:5'-gagcgtgccttaccgacgata-(CH2)6-Biotin-3'(捕捉探針)；Seq3:3'-tataggtgcctcctttattgtcctgaaattgctgttaatcttctttacgctctcgcacggaatggctgctat-5'(目標(biāo)序列)；Seq4:5'-tatcgtcggtaaggcacgctcaattgtcgttaaagtcctgttatttcctgggtggatat-3'(單減基錯(cuò)配鏈)；Seq5:5'-tatcgtcagtaaggcacactcaattgtcgttaaagtcgtgttattacctgcgaggatat-3'(五減基錯(cuò)配鏈)；S印6:5'-acatctgcatttccgttaaagtcccgttcgtaaatgctgttgcggcttgcttttccgcg-3'(對(duì)照序列_隨機(jī)鏈)。Seq1和Seq2溶解于TE緩沖液(10mmol/LTris-HCl，lmmol/LEDTA，pH7.4)，Seq3_6直接溶于超純水中。2方法2.1操作步驟取20iiL10nmol/L生物素標(biāo)記探針(seq2)，與用0.lmol/LPBS(pH7.0，含0.2mol/LNaCl)配制的10yL單鏈目標(biāo)DNA，混勻，25。C反應(yīng)10min。加納米金標(biāo)記顯示探針(含O.1%BSA)8nmol/L，10iiL，混勻，在25。C，反應(yīng)10min。將該40yL體系雜交產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到各酶標(biāo)板孔，37"C保溫20min，傾倒干凈。含0.2mol/LNaCl的0.02mol/LPB(pH7.0):洗滌1次，拍干，2XPBN(0.3mol/LNaN03和10mmol/LNa2HP04/NaH2P04，pH7.0)洗滌2次，拍干。取銀增強(qiáng)液迅速混勻立即加入各酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔100iiL，置于恒溫箱里反應(yīng)，反應(yīng)60-80s后，每孔加超純水洗滌終止反應(yīng)。采用1:3HN03(v/v)來(lái)溶解納米金表面沉積的銀，時(shí)間15min。以超純水取代化學(xué)溶出的八8+溶液做空白對(duì)照，結(jié)果用溶銀測(cè)出的化學(xué)發(fā)光值與空白對(duì)照差值即相對(duì)化學(xué)發(fā)光值表示。溶出的銀離子催化MnS04-K2S208-H3P04體系生成KMn04，進(jìn)而氧化luminol化學(xué)發(fā)光，通過(guò)Ag+濃度與化學(xué)發(fā)光信號(hào)之間良好的線性關(guān)系完成對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)。2.2制作標(biāo)準(zhǔn)曲線、確定靈敏度在實(shí)驗(yàn)選定最佳條件下，測(cè)定了不同濃度沙門(mén)氏菌序列特異目標(biāo)DNA(Seq3)的化學(xué)發(fā)光響應(yīng)情況。得方法線性范圍為l-1000fmol/L，校正曲線方程為AI=1672.42C(fmol/L)+26477(R2=0.9932)。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.3%(20fmol/L，n=ll)，檢測(cè)限為O.3fmol/L(3o)。同時(shí)，測(cè)定了本發(fā)明方法對(duì)沙門(mén)氏菌(以Salmonellatyphimurium為例)檢測(cè)的靈敏度，結(jié)果顯示(表l)，至少5cfu/mLSalmonellatyphimurium可以用本發(fā)明方法檢出。表1平板計(jì)數(shù)方法和本發(fā)明方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)沙門(mén)氏菌結(jié)果稀釋梯度a平板計(jì)數(shù)結(jié)果b(cfu/mL)本發(fā)明方法測(cè)定結(jié)果No.l00+No.200+No.300+No.430500+No.53540+No.6452+No.738+No.8+No.92—a，每個(gè)稀釋梯度稀釋倍數(shù)為10;b，為兩次平板計(jì)數(shù)結(jié)果平均值。2.3選擇性分析比較了完全互補(bǔ)目標(biāo)DNA序列(lOfmol/L)與單堿基錯(cuò)配、五堿基錯(cuò)配、隨機(jī)對(duì)照序列(100fmol/L)的響應(yīng)情況。結(jié)果顯示，其它序列響應(yīng)值顯著小于完全互補(bǔ)DNA序列響應(yīng)值(圖6)，如完全互補(bǔ)DNA序列響應(yīng)值為100，則隨機(jī)對(duì)照序列響應(yīng)值為0.9。表明本發(fā)明方法具有良好的選擇性。同時(shí)考察了本發(fā)明方法對(duì)目標(biāo)菌和其它不同種類菌(均約lOOcfu/mL)的實(shí)際響應(yīng)情況。結(jié)果表明(表2)，相對(duì)于沙門(mén)氏菌其它菌基本沒(méi)有響應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了本發(fā)明方法對(duì)沙門(mén)氏菌測(cè)定的特異性。表2本發(fā)明方法對(duì)不同種類菌株的測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2.4樣品測(cè)定按照國(guó)標(biāo)法(GBT4789.4-2008)對(duì)30個(gè)取自不同場(chǎng)所的食品樣品進(jìn)行處理，采用商品化試劑盒提取細(xì)菌基因組，制備單鏈目標(biāo)DNA樣品。采用本發(fā)明方法檢測(cè)目標(biāo)菌數(shù)量，同時(shí)采用國(guó)標(biāo)法(GB/T4789.30-2008)進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示(表3)，本發(fā)明方法對(duì)于實(shí)際樣品中目標(biāo)菌的測(cè)定結(jié)果與國(guó)標(biāo)法(GB/T4789.30-2008)—致，準(zhǔn)確性良好。表3國(guó)標(biāo)法和本發(fā)明方法測(cè)定食品樣品中目標(biāo)菌的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3結(jié)果分析由上述分析測(cè)定結(jié)果可知，本發(fā)明所提供的方法可通過(guò)DNA雜交的方式，結(jié)合納米金標(biāo)記_銀增強(qiáng)信號(hào)放大_化學(xué)發(fā)光檢測(cè)(或光密度檢測(cè))，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)沙門(mén)氏菌的超靈敏檢測(cè)。方法特異性、準(zhǔn)確度良好。實(shí)例21試劑與材料鼠抗沙門(mén)氏菌多克隆抗體購(gòu)自上海生工。納米金和鼠抗沙門(mén)氏菌多克隆抗體-納米金復(fù)合物在本實(shí)驗(yàn)室制備合成。所用沙門(mén)氏菌菌株和其它涉及到的菌株為本實(shí)驗(yàn)室保藏。所測(cè)定食品樣品購(gòu)自當(dāng)?shù)?個(gè)不同農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。所用其它試劑材料、儀器設(shè)備與實(shí)例1相同。2方法2.1操作步驟在包被好鼠抗沙門(mén)氏菌多克隆抗體的酶標(biāo)板孔內(nèi)加入100i!L目標(biāo)菌，37t:孵育20min，隨后用PBST劇烈震蕩洗滌3次去除未結(jié)合的菌。接著每孔加入100yL鼠抗沙門(mén)氏菌多克隆抗體_納米金復(fù)合物，室溫下孵育20min，隨后用PBST劇烈震蕩洗滌3次，去除未結(jié)合的抗體-納米金復(fù)合物。取銀增強(qiáng)液迅速混勻立即加入各酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔100iiL，置于恒溫箱里反應(yīng)，反應(yīng)一定時(shí)間后，每孔加超純水洗滌終止反應(yīng)。采用1:3HN03(v/v)來(lái)溶解納米金表面沉積的銀，溶解15min。以超純水取代化學(xué)溶出的八8+溶液做空白對(duì)照，結(jié)果用溶銀測(cè)出的化學(xué)發(fā)光值與空白對(duì)照差值即相對(duì)化學(xué)發(fā)光值表示。溶出的銀離子催化MnS04-K2S208-H3P04體系生成KMn04，進(jìn)而氧化luminol化學(xué)發(fā)光，通過(guò)Ag+濃度與化學(xué)發(fā)光信號(hào)之間良好的線性關(guān)系完成對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)。2.2制作標(biāo)準(zhǔn)曲線、確定靈敏度在實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件下，采用本發(fā)明方法測(cè)定目標(biāo)沙門(mén)氏菌，其實(shí)際數(shù)量通過(guò)平板計(jì)數(shù)法加以對(duì)照和驗(yàn)證。結(jié)果顯示(圖7):化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與目標(biāo)菌數(shù)量線性范圍為5-1038cfu/mL，回歸方程為AI=7.12C(cfu/mL)+857.78(R2=0.9935)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.7%(50-100cfu/mL，n=11)，檢出限為5cfu/mL。2.3選擇性分析通過(guò)測(cè)定目標(biāo)沙門(mén)氏菌和其它不同類型菌株(大約100cfu/mL)，對(duì)本發(fā)明方法的選擇性進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示(表4)，目標(biāo)沙門(mén)氏菌具有正常化學(xué)發(fā)光響應(yīng)，其它類型菌株產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度則顯著小于目標(biāo)菌的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，表明本發(fā)明方法具有良好的選擇性。表4本發(fā)明方法測(cè)定不同類型菌株的結(jié)果菌株類型相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度5W/腳"e〃a妙/z/mwh鵬1420^&c/zm'c/H'aco//25丄/他r/amowocytogene51272.4樣品測(cè)定按照國(guó)標(biāo)法(GB/T4789.30-2008)對(duì)取樣得到的50個(gè)樣品進(jìn)行沙門(mén)氏菌選擇性增菌培養(yǎng)，隨后采用本發(fā)明方法進(jìn)行沙門(mén)氏菌數(shù)量測(cè)定，同時(shí)采用國(guó)標(biāo)法(GB/T4789.30-2008)進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證。結(jié)果顯示(表5)，本發(fā)明方法與國(guó)標(biāo)法(GB/T4789.30-2008)檢測(cè)結(jié)果一致，表明本發(fā)明方法準(zhǔn)確性良好。表5本發(fā)明方法與國(guó)標(biāo)法測(cè)定實(shí)際樣品中沙門(mén)氏菌的結(jié)果比較食品樣品樣本數(shù)陽(yáng)性數(shù)(陽(yáng)性率°/。)GB/T4789.30-2008本發(fā)明方法禽肉161(6.25%)1(6.25%)豬肉151(6.67%)1C6.670/0)即食食品192(10.53%)2(10.53%)總計(jì)504(8，/(04(8.00%)3結(jié)果分析由上述分析測(cè)定結(jié)果可知，本發(fā)明所提供的方法可通過(guò)鼠抗沙門(mén)氏菌多克隆抗體與目標(biāo)沙門(mén)氏菌免疫親和的方式，結(jié)合納米金標(biāo)記_銀增強(qiáng)信號(hào)放大_化學(xué)發(fā)光檢測(cè)(或光密度檢測(cè))，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)沙門(mén)氏菌的超靈敏檢測(cè)。方法特異性、準(zhǔn)確度良好。1權(quán)利要求一種基于納米金標(biāo)銀增強(qiáng)信號(hào)放大技術(shù)的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法，其特征在于(1)沙門(mén)氏菌序列特異性寡核苷酸捕獲探針、納米金標(biāo)記沙門(mén)氏菌序列特異性寡核苷酸顯示探針與目標(biāo)菌目標(biāo)核酸序列之間的DNA雜交，形成三明治復(fù)合體；(2)鼠抗沙門(mén)氏菌多克隆抗體、納米金標(biāo)記鼠抗沙門(mén)氏菌多克隆抗體與目標(biāo)菌直接免疫親和，形成三明治復(fù)合體；(3)加入銀增強(qiáng)溶液，組裝錨定在酶標(biāo)孔上的納米金顆粒加速銀顆粒的沉積，通過(guò)檢測(cè)吸光度可對(duì)沙門(mén)氏菌定量檢測(cè)；(4)進(jìn)一步將沉積的銀化學(xué)溶出，采用luminol化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，可提高靈敏度10倍以上。2.如權(quán)利要求1所述一種基于納米金標(biāo)銀增強(qiáng)信號(hào)放大技術(shù)的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法，其特征在于納米金標(biāo)記沙門(mén)氏菌序列特異寡核苷酸顯示探針的制備1)膠體金溶液500iiL，4。C11000r/min離心13min，棄上清。2)加300nmol/L(pH7.4的1XTE緩沖液稀釋)巰基化沙門(mén)氏菌報(bào)告寡核苷酸探針(seql)50yL，混勻，置于4"環(huán)境，反應(yīng)12h。3)加等體積含0.2mol/L的TE緩沖液，使NaCl終濃度為0.1M，迅速混勻，置于4t:環(huán)境，反應(yīng)24h。3)加等體積(50iiL)含0.2mol/LNaCl的1XTE緩沖液，使NaCl終濃度為0.lmol/L，迅速混勻，置于4。C環(huán)境，反應(yīng)24h。4)取上清，4°C，11000r/min離心8分鐘，棄上清，加100yL超純水重懸后再次離心，棄上清，以去除多余的游離寡核苷酸鏈。5)加100iiL含0.lmol/LNaCl的1XTE緩沖液混勻，置4"環(huán)境儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.如權(quán)利要求1所述一種基于納米金標(biāo)銀增強(qiáng)信號(hào)放大技術(shù)的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法，其特征在于納米金標(biāo)記鼠抗沙門(mén)氏菌多克隆抗體復(fù)合物的制備1)膠體金溶液500iiL，4。C11000r/min離心13min，棄上清。2)加300nmol/L(pH7.4的1XTE緩沖液稀釋)目標(biāo)菌單克隆抗體(或多克隆抗體)50iiL，混勻，置于4t:環(huán)境，反應(yīng)12h。3)加等體積含0.2mol/L的TE緩沖液，使NaCl終濃度為0.1M，迅速混勻，置于4t:環(huán)境，反應(yīng)24h。3)加等體積(50iiL)含0.2mol/LNaCl的1XTE緩沖液，使NaCl終濃度為0.lmol/L，迅速混勻，置于4°C環(huán)境，反應(yīng)24h。4)取上清，4°C，11000r/min離心8分鐘，棄上清，加100yL超純水重懸后再次離心，棄上清，以去除多余的游離單抗。5)加100iiL含0.lmol/LNaCl的1XTE緩沖液混勻，置4"環(huán)境儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.如權(quán)利要求1所述一種基于納米金標(biāo)銀增強(qiáng)信號(hào)放大技術(shù)的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法，其特征在于酶標(biāo)板包被親和素的制備1)親和素(lmg/mL)用碳酸鹽包被液按1:100稀釋，每孔包被100yL，置于4"環(huán)境，12h。2)含0.2mol/LNaCl的0.02mol/LPB(pH7.0)每孔250iiL洗滌3次，5min/次，拍干。3)用3%BSA封閉孔板，防止后面的過(guò)程發(fā)生非特異性吸附。5.如權(quán)利要求1所述一種基于納米金標(biāo)銀增強(qiáng)信號(hào)放大技術(shù)的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法，其特征在于生物素標(biāo)記沙門(mén)氏菌捕獲探針、金標(biāo)沙門(mén)氏菌顯示探針與沙門(mén)氏菌目標(biāo)核酸序列之間的DNA雜交1)生物素標(biāo)記探針(seq2)10nmol/L，20iiL用含0.2mol/LNaCl的0.lmol/LPBS(pH7.0)配制的一系列濃度的目的核酸(seq3)以及對(duì)照序列(seq4)各10iiL(l翻1/L-10nmol/L)，混勻，在25。C，反應(yīng)10min。2)加膠體金標(biāo)記探針(含0.1%BSA)8nmol/L，10yL，混勻，在25°C，反應(yīng)10min。3)將該40iiL體系雜交產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到各酶標(biāo)板孔，37t:保溫20min，傾倒干凈。4)含0.2mol/LNaCl的0.02mol/LPB(pH7.0):洗滌1次，拍干，2XPBN(0.3mol/LNaN03禾P10mmol/LNa2HP04/NaH2P04，pH7.0)洗滌2次，拍干。6.如權(quán)利要求1所述一種基于納米金標(biāo)銀增強(qiáng)信號(hào)放大技術(shù)的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法，其特征在于納米金標(biāo)記物的銀增強(qiáng)信號(hào)放大取銀增強(qiáng)液迅速混勻立即加入各組裝好納米金標(biāo)記物的酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔100i!L，置于恒溫箱里反應(yīng)，反應(yīng)60-80s后，每孔加超純水洗滌終止反應(yīng)。然后將銀增強(qiáng)后的微孔板放入酶標(biāo)儀中，在630nm處檢測(cè)其吸光度值。所述銀增強(qiáng)液的制備0.85g氫醌溶于15mL超純水中；1.175g檸檬酸三鈉/1.275g檸檬酸溶于5mL超純水中；0.5g硝酸銀溶于2mL超純水中，溶液均需新鮮配制，確保無(wú)結(jié)晶體析出且無(wú)色，氫醌和檸檬酸混合液應(yīng)在銀增強(qiáng)前30min左右保持37t:溫育。7.如權(quán)利要求1所述一種基于納米金標(biāo)銀增強(qiáng)信號(hào)放大技術(shù)的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法，其特征在于銀增強(qiáng)后的光密度檢測(cè)銀增強(qiáng)后于酶標(biāo)儀上630nm檢測(cè)吸光度值，吸光度值與目標(biāo)沙門(mén)氏菌序列特異DNA或目標(biāo)沙門(mén)氏菌數(shù)量成正相關(guān)。8.如權(quán)利要求1所述一種基于納米金標(biāo)銀增強(qiáng)信號(hào)放大技術(shù)的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法，其特征在于銀增強(qiáng)后的溶出化學(xué)發(fā)光檢測(cè)用l:3(v/v)HN03來(lái)溶解銀增強(qiáng)后各酶標(biāo)板孔內(nèi)的銀(100iiL/孔)，溶解所得的銀離子溶液中均加入60iiL5mol/L的NaOH來(lái)調(diào)節(jié)其酸度。然后該溶液轉(zhuǎn)移至含有200yL2%(m/V)K2S208，40iiL6X10—3mol/LMnS0^P36iiL1:1(v/v)H3P04的離心管中，混合均勻后馬上放入9(TC水浴中加熱7分鐘。流水冷卻中止該催化反應(yīng)并用5mol/LNaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至10。取該溶液50iiL轉(zhuǎn)移至石英發(fā)光管中，然后注射入200iiLluminol(1ymol/L，pH13.5)同時(shí)在發(fā)光分析儀上記錄發(fā)光信號(hào)。通過(guò)Ag+濃度與化學(xué)發(fā)光信號(hào)之間良好的線性關(guān)系完成對(duì)沙門(mén)氏菌的超靈敏檢測(cè)。全文摘要本發(fā)明涉及利用沙門(mén)氏菌特異寡核苷酸捕獲探針、納米金標(biāo)記特異寡核苷酸顯示探針與致病菌目標(biāo)核酸序列之間的DNA雜交，或沙門(mén)氏菌多克隆抗體、納米金標(biāo)記多克隆抗體與沙門(mén)氏菌直接免疫親和，形成三明治復(fù)合體；加入銀增強(qiáng)液，雜交或免疫親和錨定在酶標(biāo)孔上的納米金顆粒加速銀顆粒的沉積，通過(guò)吸光度檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門(mén)氏菌的靈敏檢測(cè)，該方法的檢出限可達(dá)到33fmol/L(DNA雜交分析)或50cfu/mL(免疫親和分析)；進(jìn)一步將沉積的銀化學(xué)溶出，采用luminol化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，可使方法的檢出限達(dá)到0.3fmol/L(DNA雜交分析)或5cfu/mL(免疫親和分析)。本發(fā)明建立的食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)準(zhǔn)確、靈敏、快速，對(duì)于食品安全具有重要意義。文檔編號(hào)C12Q1/06GK101776688SQ20101902605公開(kāi)日2010年7月14日申請(qǐng)日期2010年2月8日優(yōu)先權(quán)日2010年2月8日發(fā)明者李井泉,段諾,王周平申請(qǐng)人:江南大學(xué)