專利名稱：一種兩罐法發(fā)酵生產(chǎn)蘇云金芽胞桿菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專利涉及一種蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)的發(fā)
酵方法，屬于輕工發(fā)酵領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Bt的生長分為適應(yīng)期、對數(shù)生長期、平衡期和衰亡階段。芽胞、晶體的脫落產(chǎn)生在 平衡期中后期，最后從發(fā)酵液分離芽胞和晶體產(chǎn)品。從細(xì)胞經(jīng)濟(jì)學(xué)角度看在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn) 上，分批發(fā)酵的前期是微生物增殖階段，應(yīng)該從培養(yǎng)條件上保證菌種微生物的正常增殖，以 便為隨后目的產(chǎn)物生成提供足夠的細(xì)胞，稱前發(fā)酵，然后細(xì)胞轉(zhuǎn)入目的產(chǎn)物的生產(chǎn)階段，即 芽胞、晶體形成、脫落階段，稱后發(fā)酵。根據(jù)Bt的發(fā)酵特點，已有不少研究者研究在一個攪拌通風(fēng)罐中，采用分段控制發(fā) 酵工藝，即前發(fā)酵階段采用高的通風(fēng)量、30°C發(fā)酵，后發(fā)酵采用低的通風(fēng)量、33°C發(fā)酵，與對 照恒溫、恒通風(fēng)量發(fā)酵相比，發(fā)酵周期縮短，毒力增加，而且節(jié)能。國外有研究采用兩個連續(xù)發(fā)酵罐串聯(lián)，控制稀釋率，第一個罐用于前發(fā)酵產(chǎn)菌體 用，第二個罐用于產(chǎn)芽胞和晶體用。但由于連續(xù)培養(yǎng)野生型菌株具有更高的比生長速率，此 外單細(xì)胞分裂，有很大一部分野生菌株突變成不產(chǎn)芽胞的突變菌株，最后突變菌株代替了 野生菌株，而且有報道連續(xù)培養(yǎng)由于長時間的培養(yǎng)，自發(fā)產(chǎn)生不產(chǎn)芽胞的突變Bt菌株，因 此連續(xù)發(fā)酵比分批發(fā)酵更合適于研究菌體生長和芽胞的形成，而不適合生產(chǎn)應(yīng)用。因此，在現(xiàn)實的Bt的生產(chǎn)中，通常生產(chǎn)方法仍然是在一個攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐中，采 用分段控制發(fā)酵的工藝進(jìn)行生產(chǎn)。這種方法通風(fēng)攪拌占用時間長，浪費了大量的電能，同時 對菌體和后發(fā)酵芽胞、晶體造成剪切傷害，不利于殺蟲毒素的形成。本發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種既有利于菌體、芽胞和晶體的形成，又可以節(jié)能，提高產(chǎn) 量的Bt發(fā)酵生產(chǎn)新方法。本發(fā)明的目的是以如下方式實現(xiàn)的；一種兩罐法發(fā)酵生產(chǎn)蘇云金芽胞桿菌的方 法，根據(jù)Bt芽胞形成來確定發(fā)酵工段，從發(fā)酵罐接種開始到發(fā)酵液形成芽胞階段為前發(fā) 酵；芽胞開始形成到芽胞開始脫落階段為后發(fā)酵1，芽胞開始脫落到芽胞脫落50%階段為 后發(fā)酵2 ；前發(fā)酵在前發(fā)酵罐B內(nèi)完成，前發(fā)酵罐B是一個攪拌通風(fēng)的發(fā)酵罐，后發(fā)酵1、后 發(fā)酵2在后發(fā)酵罐C內(nèi)完成，后發(fā)酵罐C是一個氣升式發(fā)酵罐；前發(fā)酵罐B中采用高的通風(fēng) 量，即按培養(yǎng)基與無菌空氣體積1 1.5v/v/min的通風(fēng)量、攪拌轉(zhuǎn)速250r/min、發(fā)酵溫度控 制在-30°C，發(fā)酵至芽胞剛開始形成時，轉(zhuǎn)入后發(fā)酵罐C，后發(fā)酵1采用較低的通風(fēng)量， 即按培養(yǎng)基體積與無菌空氣體積1 lv/v/min的通風(fēng)量、發(fā)酵溫度控制在33°C發(fā)酵；發(fā)酵 至芽胞剛開始脫落時，停止通風(fēng)，進(jìn)入后發(fā)酵2，后發(fā)酵2維持33°C靜置發(fā)酵至芽胞50%脫 落時，出料轉(zhuǎn)入后期處理階段。上述的兩罐法發(fā)酵生產(chǎn)Bt的方法中，在前發(fā)酵罐B的前端設(shè)有一個培養(yǎng)基連續(xù)滅 菌裝置A，即可實現(xiàn)半連續(xù)發(fā)酵。
采用上述的發(fā)明方法的兩罐法發(fā)酵工藝能產(chǎn)生非常的積極的效果，主要優(yōu)勢如 下1、可以分段控制菌體生長和芽胞晶體蛋白的形成；通過控制通風(fēng)量和后期發(fā)酵溫 度達(dá)到縮短發(fā)酵時間、提高毒力產(chǎn)量的目的。2、后發(fā)酵罐C相當(dāng)于中轉(zhuǎn)罐，沒有攪拌裝置，比前發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)簡單、價格便宜；當(dāng) 發(fā)酵進(jìn)入后發(fā)酵，開始進(jìn)入后發(fā)酵罐C，則前發(fā)酵罐B可以提前1/3-1/2的時間騰空或進(jìn)入 下一個前發(fā)酵流程，同時可以省去1/3-1/2的通風(fēng)攪拌發(fā)酵時間，節(jié)約大量通風(fēng)攪拌能耗， 而且后發(fā)酵罐C沒有攪拌裝置，溫和的通風(fēng)可以較少剪切力對菌體、芽胞和晶體形成的傷 害，有利毒素的形成。3、如果培養(yǎng)基采用連續(xù)滅菌設(shè)備A，設(shè)備A可以是薄板、管式、塔式等連續(xù)滅菌設(shè) 備，則可以實現(xiàn)“半連續(xù)發(fā)酵”，即前發(fā)酵罐B出料進(jìn)入后發(fā)酵罐C，下一批物料通過連續(xù)滅 菌可直接進(jìn)入前發(fā)酵罐B，待后發(fā)酵罐C出料后，下一批前發(fā)酵罐B的發(fā)酵液又可以進(jìn)入后 發(fā)酵罐C，如此生產(chǎn)多批后視環(huán)境衛(wèi)生情況，根據(jù)微生物檢測情況決定對前、后兩個發(fā)酵罐 空罐滅菌。這樣可以實現(xiàn)半連續(xù)多批次同時生產(chǎn)，減少了發(fā)酵罐空罐的清洗滅菌等輔助操 作時間，大大提高設(shè)備周轉(zhuǎn)率。4、兩罐法間歇發(fā)酵可以避免連續(xù)培養(yǎng)易染菌、菌種退化的問題。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進(jìn)一步說明圖1兩罐法生產(chǎn)Bt的工藝設(shè)備流程2發(fā)酵工藝流程圖A、培養(yǎng)基連續(xù)滅菌裝置B、前發(fā)酵罐C、后發(fā)酵罐；D、進(jìn)料管接口 E、無菌空氣進(jìn)管F、空氣出管G、出料口
具體實施例采用圖1的工藝設(shè)備、圖2的兩罐法發(fā)酵工藝培養(yǎng)，以8010為發(fā)酵菌株發(fā)酵生產(chǎn) Bt。培養(yǎng)基配方玉米淀粉1 %，豆粕1. 3%，花生餅粉10Z0，玉米漿1 %，酵母粉0. 1 %， CaCO3O. 3%, KH2PO4 0. 2%, MgSO4 0. 07%, pH 7. 0-7. 5，121°C高壓滅菌 40min。經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基進(jìn)入前發(fā)酵罐B，前發(fā)酵罐B中采用高的通風(fēng)量，即按培養(yǎng)基與空 氣量1 1.5V/V/min通風(fēng)量、發(fā)酵溫度控制在30°C，至芽胞剛開始形成時，轉(zhuǎn)入后發(fā)酵罐 C，后發(fā)酵罐C前期采用低的通風(fēng)量，即按培養(yǎng)基與無菌空氣量1 lv/v/min通風(fēng)量，溫度 控制在33°C發(fā)酵，發(fā)酵至芽胞剛開始脫落時，停止通風(fēng)，維持33°C至芽胞50%以上脫落時， 出料轉(zhuǎn)入后期處理階段，即分離、干燥和制劑生產(chǎn)。發(fā)酵液芽胞計數(shù)方法取發(fā)酵液85°C加熱處理5min，迅速冷卻，采用稀釋平板活 菌技術(shù)法計數(shù)；毒力測定方法發(fā)酵液經(jīng)1000倍稀釋后對2-3齡小菜蛾生物測定。結(jié)果采用本發(fā)明方法的發(fā)酵時間為65h，終產(chǎn)品芽胞數(shù)75億/mL，芽胞形成率 90%以上；4 小菜蛾校正死亡率100%;如采用傳統(tǒng)的單罐法發(fā)酵，采用恒溫(30°C)、恒通 風(fēng)量(1 1.5VV/min)、恒轉(zhuǎn)速O50r/min)控制發(fā)酵，則需要發(fā)酵時間為72h，終產(chǎn)品的芽胞數(shù)58億/mL、芽胞形成率80%左右，4 2_3齡小菜蛾校正死亡率86%。按每度電0.73 元，每罐1. 5t計算，可節(jié)省攪拌能耗300元以上，而且產(chǎn)品對小菜蛾殺蟲能力提高12. 5%。
權(quán)利要求
1.一種兩罐法發(fā)酵生產(chǎn)蘇云金芽胞桿菌的方法，其特征是根據(jù)Bt芽胞形成來確定發(fā) 酵工段，從發(fā)酵罐接種開始到發(fā)酵液形成芽胞階段為前發(fā)酵；芽胞開始形成到芽胞開始脫 落階段為后發(fā)酵1，芽胞開始脫落到芽胞脫落50%階段為后發(fā)酵2 ；前發(fā)酵階段在前發(fā)酵罐 B內(nèi)完成，前發(fā)酵罐B是一個攪拌通風(fēng)的發(fā)酵罐，后發(fā)酵1、后發(fā)酵2在后發(fā)酵罐C內(nèi)完成， 后發(fā)酵罐C是一個氣升式發(fā)酵罐；前發(fā)酵罐B中采用高的通風(fēng)量，即按培養(yǎng)基與無菌空氣體 積1 1.5V/V/min的通風(fēng)量、攪拌轉(zhuǎn)速250r/min、發(fā)酵溫度控制在觀1-301，至芽胞剛開 始形成時，轉(zhuǎn)入后發(fā)酵罐C，后發(fā)酵1采用較低的通風(fēng)量，即按培養(yǎng)基體積與無菌空氣體積 1 lv/v/min通風(fēng)量、發(fā)酵溫度控制在33°C發(fā)酵；發(fā)酵至芽胞剛開始脫落時，停止通風(fēng)，進(jìn) 入后發(fā)酵2，后發(fā)酵2維持33°C靜置發(fā)酵至芽胞50%脫落時，出料轉(zhuǎn)入后期處理階段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兩罐法發(fā)酵生產(chǎn)蘇云金芽胞桿菌的方法，其特征是前發(fā) 酵罐B的前端設(shè)有一個培養(yǎng)基連續(xù)滅菌裝置A，即可實現(xiàn)半連續(xù)發(fā)酵。
全文摘要
一種兩罐法發(fā)酵生產(chǎn)蘇云金芽胞桿菌的方法，從進(jìn)料接菌至芽胞剛開始形成在前發(fā)酵罐內(nèi)完成，芽胞開始脫落到芽胞脫落50％為后發(fā)酵，在后發(fā)酵罐內(nèi)完成；前發(fā)酵罐是一個攪拌通風(fēng)的發(fā)酵罐，后發(fā)酵罐是一個氣升式發(fā)酵罐；前發(fā)酵罐中按培養(yǎng)基與無菌空氣體積1∶1.5v/v/min的通風(fēng)量、攪拌轉(zhuǎn)速250r/min、發(fā)酵溫度28℃-30℃；至芽胞開始形成即轉(zhuǎn)入后發(fā)酵罐C，采用培養(yǎng)基與無菌空氣體積1∶1v/v/min通風(fēng)量、發(fā)酵溫度33℃，發(fā)酵至芽胞剛脫落即停止通風(fēng)，維持33℃靜置發(fā)酵至芽胞50％脫落時，發(fā)酵完成；產(chǎn)品毒力高，能耗低及生產(chǎn)效率高。
文檔編號C12R1/07GK102146349SQ20101062374
公開日2011年8月10日 申請日期2010年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月25日
發(fā)明者關(guān)雄, 吳麗云 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)